Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

وحيد الطفرات سيت بيسلفيت

doi: 10.3791/4046 Published: June 27, 2012

Summary

الطفرات بيسلفيت هو معيار الذهب لتحليل الحامض النووي. لدينا بروتوكول تعديل يسمح لتحليل الحامض النووي على مستوى وحيدة الخلية والتي صممت خصيصا لالبويضات الفردية. ويمكن أيضا استخدامه لانشقاق في مرحلة الأجنة.

Abstract

علم التخلق يتفرد بها كل الموروثة وتعديلات عكسها على لونين من شأنها أن تغير الجينات إمكانية الوصول، وبالتالي هي الآليات الأساسية لتنظيم النسخ الجيني 1. الحامض النووي هو تعديل اللاجينية التي تعمل في الغالب على أنه علامة القمعية. من خلال إضافة التساهمية لمجموعة الميثيل على cytosines في dinucleotides الدليل السياسي الشامل، فإنه يمكن توظيف البروتينات القمعية إضافية وتعديلات بسيطة لبدء العمليات التي ينطوي عليها التكثيف لونين وإسكات الجينات 2. الحامض النووي أمر ضروري للتطور الطبيعي لأنه يلعب دورا حاسما في البرمجة التنموية، تمايز الخلايا، وقمع العناصر فيروسات، تعطيل كروموسوم X-والبصمة الجينية.

واحدة من أكثر الوسائل قوية لتحليل الحامض النووي هو الطفرات بيسلفيت. بيسلفيت الصوديوم هو المغير الحمض النووي التي deaminates cytosines إلى uracils. بعد التضخيم PCR وseque ncing، تم الكشف عن هذه الأحداث تحويل كما thymines. محمية cytosines ميثليته من نزع الأمين وهكذا تظل كما cytosines، مما يتيح تحديد الحامض النووي على مستوى فردي النوكليوتيدات 3. وقد تقدمت تطوير بيسلفيت فحص الطفرات من تلك التي ذكرت في الأصل 4-6 نحو تلك التي هي أكثر حساسية وقابلية للتكرار 7. وكان واحد تقدم مفتاح تضمين كميات صغيرة من الحمض النووي في حبة الاغاروز، ومن ثم حماية الحمض النووي من معاملة قاسية بيسلفيت 8. إلى أن يتم تنفيذ هذا التحليل مثيلة تمكين على برك من البويضات والأجنة في مرحلة الكيسة 9. والطفرات بيسلفيت الأكثر تطورا حتى الآن هو بروتوكول للأجنة في مرحلة الكيسة فرد 10. ومع ذلك، منذ blastocysts يكون على الخلايا متوسط ​​64 (التي تحتوي على 120-720 خريج من الحمض النووي الجيني)، وهذا الأسلوب غير فعال للدراسات مثيلة في البويضات أو الأجنة الفردية الانقسام المرحلة.

خيمة "> أخذ القرائن من تضمين الاغاروز كميات الحمض النووي بما في ذلك البويضات الدقيقة 11، هنا نقدم وسيلة يتم من خلالها مباشرة جزءا لا يتجزأ من البويضات في الاغاروز وتحلل حبة حل استرجاع التالية فورا وإزالة الشفافة زونا من البويضة، وهذا يتيح لنا تجاوز التحديات الرئيسيان من بويضة واحدة الطفرات بيسلفيت: حماية كمية ضئيلة من الحمض النووي من تدهور، وفقدان لاحق خلال خطوات عديدة بروتوكول الأهم من ذلك، كما يتم الحصول على البيانات من البويضات واحد، هو القضاء مسألة التحيز PCR داخل حمامات وعلاوة على ذلك. ، غير مقصود تلوث الخلية الركامية قابلا للاكتشاف من قبل هذه الطريقة منذ يجوز استبعاد أي عينة مع نمط مثلأيشن واحد أو أكثر من تحليل 12. هذا البروتوكول يوفر طريقة أفضل للتحليل ناجحة وقابلة للتكرار من الحامض النووي على مستوى وحيدة الخلية، ويعتبر مثاليا لالبويضات الفردية، وكذلك الأجنة في مرحلة الانقسام.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يوم 1

إعداد الحلول التالية العذبة في اليوم من جمع البويضة مع الماء، وعقيمة مثل الماء المقطر GIBCO. لتقليل فرصة التلوث الحمض النووي، وتغيير في كثير من الأحيان واستخدام قفازات نصائح مرشح. إبقاء الأنابيب الزاوية بعيدا عندما فتحها، وخلاصة كل أنابيب عندما لا تكون قيد الاستعمال. من المستحسن أن تتم الحلول كما ن +1.

3٪ LMP الاغاروز

30 ملغ نقطة انصهار منخفضة (LMP) الاغاروز
يصل إلى 1 مل GIBCO O 2 H
حل @ 70 درجة مئوية

تحلل الحل

8 عازلة تحلل ميكرولتر
1 ميكروليتر بروتيناز K
1 ميكروليتر IGEPAL 10٪
مكان على الجليد حتى جاهزة للاستخدام

02:01 الاغاروز: تحلل الحل (10 ميكرولتر لكل بويضة الفردية، والمبلغ هو لمدة 3 البويضات)

20 ميكرولتر 3٪ LMP الاغاروز
10 الحل تحلل ميكرولتر
مزيج @ 70 درجة مئوية

SDS لايالهيئة العامة للاستعلامات العازلة (501 ميكرو لتر لكل بويضة الفردية)

1X الشركة المصرية للاتصالات 7.5 درجة الحموضة 450 ميكرولتر
10٪ SDS 50 ميكرولتر
بروتين K 1 ميكروليتر
501 ميكرولتر

1. مجموعة سيت

  1. ضع الماوس oviducts تشريح في وسائل الاعلام M2، وتمزيق الأمبولات لاستخراج مجمع الخلية الركامية.
  2. فصل البويضات من الركام مجمع الخلية باستخدام 0.3 ملغم / لتر في حل هيالورونيداز قطرة ميكرولتر 30 من وسائل الاعلام M2. إبقاء البويضات في الحل الوحيد طالما أنه يأخذ لإزالة الخلايا الركامية، والتعرض طويل قد يضر بهم. غسل البويضات 3X في 30 قطرة ميكرولتر من وسائل الاعلام M2، وإزالة الركام الخلايا دوريا.
  3. إزالة الشفافة زونا باستخدام محلول حمضي tyrode ل. وضع البويضات في الانخفاض 30 1 ميكرولتر من الحل الأول، ومن ثم نقل إلى 30 آخرينانخفاض ميكرولتر، كما أن أي وسائل الاعلام قامت على طول تمييع حامض والحد من فعاليتها. إبقاء البويضات في الحل الوحيد طالما أنه يأخذ لإزالة زونا، كما تعرض طويلة قد تضر بهم. ملاحظة: يمكن استخدام زيادة تركيز المحاليل الحمضية tyrode أو pronase للعينات البشرية، حيث أن الإنسان المنطقة الشفافة هي أكثر مقاومة للعلاج مع المحاليل الحمضية tyrode لمن الماوس.
  4. غسل البويضات مرة أخرى في قطرة وميكرولتر 30 من وسائل الاعلام M2.

2. الاغاروز التضمين وتحلل

  1. لأداء الاغاروز التضمين، ووضع حل تحلل على heatblock 70 درجة مئوية. إضافة مسخن LMP الاغاروز إلى حل تحلل، مما ينتج عنه الاغاروز 02:01: حل تحلل.
  2. وضع بويضة واحدة على شريحة زجاجية نظيفة في وسائل الاعلام M2 الحد الأدنى. يستغرق 10 ميكرولتر من الاغاروز: حل تحلل في قمة ماصة، و (تحت المجهر) طرد بلطف كمية صغيرة (~ 1 ميكروليتر أو أقل) على شريحة زجاجية، والسماح لها بالاختلاط قطرةآل وسائل الاعلام. اختيار برفق البويضة في قمة ماصة ووضع كل ميكرولتر 10 في أنبوب إيبندورف مع 300 ميكرولتر الزيوت المعدنية لذلك حبة يشكل المجال.
    ملاحظة: يجب أن تتم هذه العملية بسرعة كبيرة كما الاغاروز سوف تتصلب إذا تنخفض درجة الحرارة اقل من 5 درجات مئوية أقل من 70 درجة مئوية.
  3. احتضان أنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق. لأداء تحلل، وإزالة الزيوت المعدنية 300 ميكروليتر وإضافة 500 ميكرولتر من العازلة تحلل SDS. احتضان بين عشية وضحاها في حمام ماء C ° 50.
    ملاحظة: يمكن أيضا حل تحلل (الجدول 1) يمكن استخدامها لهذا الغرض.

يوم 2

إعداد الحلول التالية العذبة في اليوم من الطفرات بيسلفيت. للحد من فرص انتشار التلوث الحمض النووي، وتغيير في كثير من الأحيان واستخدام قفازات نصائح مرشح. إبقاء الأنابيب الزاوية بعيدا عندما فتحها، وخلاصة كل أنابيب عندما لا تكون قيد الاستعمال. من المستحسن أن تتم الحلول كما ن +1.

<TD> 2،4 غرام هيدروكسيد الصوديوم في 20 مل مشبع O 2 DDH
3 M هيدروكسيد الصوديوم
0.1 M هيدروكسيد الصوديوم 0.5 مل من 3M في 14.5 مل مشبع O 2 DDH
0.3 متر هيدروكسيد الصوديوم 1.5 مل من 3M في 13.5 مل مشبع O 2 DDH

2.5 الحل M بيسلفيت

  1. ز 3،8 بيسلفيت الصوديوم
    5.5 مل GIBCO المقطر H 2 O
    1 مل 3 M هيدروكسيد الصوديوم
    حل @ درجة حرارة الغرفة
  2. 110 ملغ هيدروكينون
    1 مل GIBCO المقطر H 2 O
    حل @ 90 درجة مئوية (من أجل فقط طالما أنه يأخذ إلى حل، خلط بانتظام)

عندما يذوب تماما، خلط محلول (أ) و (ب)
* يحفظ بعيدا عن ضوء *

3. بيسلفيت التطفير

  1. إزالة بالكامل 500 تحلل SDS ميكرولتر عازلة وإضافة الزيوت المعدنية 300 ميكروليتر (~ 20 ساعة). فإن أي العازلة تحلل ما تبقى تمييع عشره الاغاروز عندما يتم تسخينها وحبة سوف تكون أكثر عرضة للتذويب في الخطوات اللاحقة. المضي قدما في الطفرات بيسلفيت فورا، أو متجر عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أيام.
  2. إن وجدت، وإزالة البويضات من الثلاجة، والسماح ذوبان (فقط حتى الاغاروز حبة غير شفافة نسبيا). احتضان لمدة 2.5 دقيقة على كتلة حرارة 90 درجة مئوية، وبعد ذلك احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: لا تخلط أو إثارة، وتمديد فترة أطول من 2.5 دقيقة، أو تقلب درجات الحرارة.
  3. لأداء تمسخ، وإزالة الزيوت المعدنية وإضافة 1 مل 0.1M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل نفض الغبار، وأنبوب عكس 5-6 مرات.
  4. احتضان لمدة 15 دقيقة في بالحمام المائي 37 درجة مئوية، قلب كل 3-4 دقائق. يجب أن حبة تعوم في هيدروكسيد الصوديوم.
  5. لإجراء معاملة بيسلفيت، وتدور في أنبوب بلطف، ثم إزالة هيدروكسيد الصوديوم وإضافة الزيوت المعدنية 300 و 500 ميكروليتر حل بيسلفيت ميكرولتر. احتضان الأنبوب لمدة 3.5 ساعة في بالحمام المائي 50 درجة مئوية. * يحفظ بعيدا عن ضوء * ملاحظة: مدة حضانة المرض قد تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا لجينة من الفائدة.
  6. لأداء desulfonation، احتضان على الجليد لمدة 3 دقائق، ثم إزالة الزيوت المعدنية والحل بيسلفيت، وتدور بلطف، وإضافة 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم 0.3 متر. نفض الغبار وعكس 5-6 مرات.
  7. احتضان لمدة 15 دقيقة في بالحمام المائي 37 درجة مئوية، قلب كل 3-4 دقائق. يجب أن حبة تعوم في هيدروكسيد الصوديوم.
  8. غسل العينات، من قبل الغزل 1 بلطف، ثم إزالة هيدروكسيد الصوديوم وإضافة 1 مل 1X الشركة المصرية للاتصالات 7.5 درجة الحموضة. هزة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (على شاكر). تدور بلطف مرة أخرى، ثم إزالة TE 1X. كرر هذه العملية مرتين غسيل.
  9. إضافة 1 مل مشبع DDH 2 O. هزة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (على شاكر). تدور بلطف، ثم إزالة 2 H O. كرر DDH غسيل O 2 مرتين.
  10. التحقق من الرقم الهيدروجيني للطاف، وإنما يجب أن تكون 5.0 درجة الحموضة. إذا كانت لا تزال أساسية جدا، وغسل مرة أخرى مع H 2 O. إزالة جميع طاف، ولم يتبق سوى أن تكون الاغاروزإعلان.

4. 1 ش و 2 الثانية تضخيم PCR جولة

  1. إعداد 1 ش جولة PCR ** المزيج في حين غسل **
10 ميكرومتر الخارجي التمهيدي إلى الأمام 0،5 ميكروليتر
10 عكس التمهيدي ميكرومتر الخارجي 0،5 ميكروليتر
240 نانوغرام / مل الحمض الريبي النووي النقال 1 ميكروليتر
H 2 O 13 ميكرولتر

إضافة إلى الجاهزة للحار الذهاب الخرز Illustra PCR البداية
الشريحة بعناية في صلب الاغاروز خرزة داخل الأنبوب PCR (~ 10 ميكرولتر)
الحرارة إلى 70 درجة مئوية ومزيج
إضافة 25 الزيوت المعدنية ميكرولتر
المجموع: 50 ميكرولتر

  1. تضخيم
    ملاحظة: مثال من ظروف ركوب الدراجات لSnrpn الماوس تمسخ لمدة 2 دقيقة على 94 درجة مئوية، تليها 40 دورة من 30 ثانية في 94 درجة مئوية، 1 دقيقة في 50 درجة مئوية، و 1دقيقة عند 68 درجة مئوية، ونهائي 10 خطوة استطالة دقيقة عند 68 درجة مئوية. الصلب درجة الحرارة لمدة 1 PCR الجولة الحادية وللماوس H19 و Peg3 هو 50 درجة مئوية.
  2. 2 تحضير الجولة الثانية PCR مزيج
10 ميكرومتر التمهيدي الداخلية إلى الأمام 0،5 ميكروليتر
10 عكس التمهيدي ميكرومتر الداخلية 0،5 ميكروليتر
H 2 O 19 ميكرولتر

إضافة إلى الجاهزة للحار الذهاب الخرز Illustra PCR البداية
إضافة 5 ميكرولتر جولة ST 1 المنتج كقالب. تسخين المنتج 1 ش جولة إلى 70 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لتليين الاغاروز. تأكد من ماصة تحت طبقة من الزيوت المعدنية.
إضافة 25 الزيوت المعدنية ميكرولتر
المجموع: 50 ميكرولتر

ملاحظة: يمكن العثور على تسلسل التمهيدي متداخل لSnrpn، H19، وPeg3 Velker في السوق وآخرون 10،12.

  1. تضخيم
    ملاحظة: شروط ركوب الدراجات لSnrpn الماوس تمسخ لمدة 2 دقيقة على 94 درجة مئوية، تليها 40 دورة من 30 ثانية في 94 درجة مئوية، 1 دقيقة في 50 درجة مئوية، و 1 في الدقيقة 68 درجة مئوية، واستطالة النهائي 10 دقائق خطوة عند 68 درجة مئوية 10. فأر H19 و Peg3 تتطلب 50 درجة مئوية درجة الحرارة الصلب لمدة 2 PCR الجولة الثانية.
  2. كاختبار تشخيصي، ويمكن قطع عينات من الدور الثاني مع انزيم تقييد هذا هو مثيلة أو سلالة معينة.
2 المنتج الثاني جولة 4 ميكرولتر
تقييد الإنزيم 1 ميكروليتر
العازلة 1 ميكروليتر
H 2 O 4 ميكرولتر
  1. Electrophorese المنتجات الهضم على هلام الأكريلاميد 8٪. أي فرق غير متجانسة تمثل أكثر من واحد sequeالامتحانات التنافسية الوطنية.

5. TA الاستنساخ وPCR مستعمرة

  1. لاستنساخ 2 المنتج الثاني جولة، أول حرارة إلى 70 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لتليين الاغاروز، ligate ثم إلى ناقلات باستخدام pGEM-T Promega ناقل النظام (فيشر العلمية كات # A1360).
2 الثانية جولة PCR 1 ميكروليتر
pGEMT-EASY ناقلات 1 ميكروليتر
يغاز 1 ميكروليتر
H 2 O 2 ميكروليتر
2X الربط الاحتياطي 5 ميكرولتر

احتضان بين عشية وضحاها @ 4 آلة PCR درجة مئوية في.

  1. ذوبان الجليد المختصة الخلايا القولونية على الجليد لمدة 15 دقيقة (الإنزيم القطة شركة أبحاث # T3009). إضافة 3 رد فعل ربط ميكروليتر إلى 8 القولونية ميكرولتر واحتضان ربط على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  2. الصدمة الحرارية لمدة 40 ثانية في بالحمام المائي 42 درجة مئوية،واحتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة. إضافة 60 شركة نفط الجنوب ميكرولتر المتوسطة واحتضان على 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (في شاكر).
  3. وضع كل من مزيج رد فعل على صفيحة رطل / آجار / IPTG / Xgal / أمبير واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية خلال الليل.
  4. تعد مستعمرة PCR مزيج
20 ميكرومتر التمهيدي أمام M13 0،7 ميكروليتر
20 ميكرومتر التمهيدي عكس M13 0،7 ميكروليتر
5X الأخضر الذهاب طق الواق 7،0 ميكروليتر
10 ملي dNTP 0،7 ميكروليتر
طق الحمض النووي بوليميريز 0.28 ميكروليتر
H 2 O 25.62 ميكرولتر
35 المجموع ميكرولتر

إضافة 35 ميكرولتر مزيج مستعمرة سيد PCR في أنبوب PCR. اختيار مستعمرة البكتيرية أبيض من لوحة مع طرف ماصة، ودوامة عليه في رد فعل PCR.

  1. تضخيم مع تمسخ لمدة 10 دقائق على 94 درجة مئوية، تليها 30 دورات من 45 ثانية في 94 درجة مئوية، 30 ثانية عند 57 درجة مئوية، و 1 دقيقة في 72 درجة مئوية، والخطوة النهائية استطالة 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية. Electrophorese 4 ميكرولتر على هلام الاغاروز٪ 1.5. إرسال ~ 30 ميكرولتر من منتج PCR في التسلسل.
    ملاحظة: للحصول على البويضات، والتسلسل 5 مستعمرة منتجات PCR.
  2. مرة واحدة يتم الحصول على نتائج التسلسل، يمكن قراءة أنماط مثيلة. وكان ميثليته أي CG الأصلية التي لا تزال بمثابة الفريق الاستشاري، وكان unmethylated أي CG الأصلي الذي هو الآن TG.

6. ممثل النتائج

في عملنا، مطبوع نحن فحص مثيلة في البويضات والأجنة الفردية (الشكل 1). بعد التضخيم PCR متداخلة باستخدام بادئات بيسلفيت تحويلها، فمن الممكن لتأكيد تحويل ناجح من خلال وضع تصور حجم قطعة الصحيح على جل الاغاروز (الشكل 2). بويضة الفرديةتمثل واحدة أليل الأبوية، ونظريا، لديها واحد نمط مثلأيشن مطبوع. على هذا النحو، يمكن اختبار الدور الثاني لتلوث المنتجات PCR غير مقصود. ويمكن استخدام انزيم تقييد الحساسة إلى الحامض النووي (مثل HinfI أو DpnII) إكمال عملية هضم الطعام والثاني منتج PCR جولة لتقييم ما إذا كان يحتوي على أليل ميثليته أو unmethylated (الشكل 3). والمشقوق مكيف ميثليته ضمن تسلسل اعتراف الانزيم في حين لم يعد يعترف 1 C unmethylated أن يتم تحويلها إلى T بواسطة انزيم وغير المصقول. يجب التخلص من أي عينة MII بويضة تحتوي على كل من ميثليته والأليلات unmethylated، لأنه يدل على تلوث الخلية الركامية (الشكل 3). بعد ربط والتحول، لا يمكن نجاح التضخيم PCR مستعمرة تصور على هلام الاغاروز لضمان ارسال عينات مع حجم المنتج الصحيح لتسلسل (الشكل 4). وأخيرا، فإن تسلسل من خمسة CL الفرديةوينبغي أن منها من بويضة MII إنتاج خمسة أنماط مثيلة متطابقة ومتماثلة أسعار التحويل nonCpG (الشكل 5A). يجب التخلص من أي عينات التي تحتوي على أكثر من نمط واحد (الشكل 5B). منذ ovulated البويضات صناعة المعلومات لديها نسخ كروموسوم اثنين أو هيئة المرفقة القطبية، وهناك إمكانية للحصول على نمطين تسلسل مماثل (الشكل 5C). نوصي تجاهل البيانات من البويضات التي لديها أنماط مثيلة متباينة للغاية حيث لا قزع تلوث الخلية يمكن استبعاده.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي لفحص سيت واحدة الطفرات بيسلفيت.

الشكل 2
النتائج الممثل الشكل 2. من التضخيم الثانية 2 الدور لSnrpn من الغناءلو MII البويضة على هلام الاغاروز 1.5٪. الممرات 1-4 أربعة واحد البويضات صناعة المعلومات وممر 5 هو سيطرة سلبية (أي بويضة). يتوقع حجم amplicon لSnrpn هو 420 شركة بريتيش بتروليوم. L، سلم.

الشكل (3)
النتائج الممثل الشكل 3. في الفترة من 2 جولة الثانية الهضم تقييد مثلأيشن محددة لSnrpn من بويضة واحدة MII على هلام الأكريلاميد 8٪. HinfI الهضم تقييد التشخيصية أن الحمض النووي الذي يؤوي unmethylated تي أن يلغي موقع تقييد (420bp، لين 1) أو الحمض النووي ميثليته التي تحتوي على C في موقع الاعتراف (قطع، 262، 103، وبريتش بتروليوم 54، لين 2). الهضم تظهر على حد سواء ميثليته وunmethylated مواقع الانزيم تقييد (عصابات قطع وتقطيعه، حارة 3) تدل على تلوث الخلية الركامية. L، سلم.

الشكل 4
الشكل 4. لSnrpn من بويضة واحدة على صناعة المعلومات هلام الاغاروز 1.5٪. يتوقع حجم amplicon بعد الربط من Snrpn في ناقلات pGEM-T سهل واستخدام M13 إلى الأمام، والاشعال العكس هو 656 شركة بريتيش بتروليوم. لين 1-8، amplicons من الحيوانات المستنسخة 1-8. استنساخ 5 لديه حجم amplicon غير صحيح، وينبغي ألا يتم إرسالها في التسلسل.

الشكل 5
الشكل 5. الممثل تسلسل النتائج لSnrpn من بويضة واحدة صناعة المعلومات. Snrpn وميثليته في البويضات. الدوائر السوداء تشير CpGs ميثليته. دوائر بيضاء تشير CpGs unmethylated. عدد الدليل السياسي الشامل والتنسيب هو ممثل للماوس الأنثى B6 السلالة. أ) المتوقعة تسلسل النتائج لSnrpn من بويضة واحدة صناعة المعلومات. يجب فقط ضفيرة واحدة من الحمض النووي في تضخيم كل الحيوانات المستنسخة الخامسة. البويضات مع نمط مثيلة واحدة ومتطابقة طقطق تحويل غير الدليل السياسي الشاملوينبغي أن تدرج في التحليلات ن (التحويل في المئة من CpGs عدم وأشارت إلى الحق ومحسوبة على أساس عدد من المنظمات غير الدليل السياسي الشامل cytosines تحويلها إلى الثايمين كنسبة مئوية من cytosines عدم الدليل السياسي الشامل الكل). ب) نتائج التسلسل الجيني لSnrpn من بويضة واحدة مع صناعة المعلومات تلوث الخلية الركامية. لاحظ الاختلاف بين الولايات مثلأيشن وأنماط متعددة تشير إلى تحويل التضخيم حبلا. ج) تسلسل النتائج لSnrpn من بويضة واحدة مع صناعة المعلومات على حد سواء نسخ كروموسوم أو القطبية إدراج الجسم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هذا الفحص بويضة واحدة تحتوي على العديد من الخطوات مع عدد التي تعتبر بالغة الأهمية وتتطلب رعاية خاصة. الأول هو غسل البويضة. من المهم بشكل خاص لغسل كل بويضة عدة مرات في المتوسط ​​الطازجة يسقط بعد العلاج هيالورونيداز لإزالة الركام وخلايا أكبر عدد ممكن. وعلاوة على ذلك، عند نقل البويضات إلى حل الحمضية tyrode لإزالة الشفافة زونا تأكد المحيطة المتوسط ​​هو واضح من الخلايا الركامية. البويضة غير لزجة جدا بعد إزالة زونا، ويمكن بسهولة أي الخلايا الركامية المحيطة تصبح عالقا إلى البويضة. من الصعب جدا لإزالة خلية الركام التي عالق لبويضة زونا خالية. في حين أن هذا البروتوكول يتيح للكشف عن تلوث الخلية الركامية في نقاط وقت لاحق، فإنه ليس من البناء، ولا اقتصادا، على الخضوع لبروتوكول كامل على البويضات التي من المرجح أن يتم تجاهل.

الخطوة الثانية الحاسمة هي التضمين البويضة. عندما غرس البويضة في الاغاروز وLYSتم حل، من المهم أن نلاحظ أن درجة انصهار منخفضة (LMP) الاغاروز سوف تتصلب في درجات حرارة اقل من 5 درجات مئوية أقل من 70 درجة مئوية. على هذا النحو، ونحن نوصي خلط الاغاروز حل وتحلل في 70 درجة مئوية، ووضع بعد ذلك البويضة الفردية على شريحة زجاجية في الحد الأدنى من المتوسط. استعداد مرة واحدة، ماصة الحل الاغاروز / تحلل وترسيخ البويضة في أنبوب إيبندورف أعدت تحت الزيوت المعدنية، على نحو دقيق حتى الآن في الوقت المناسب.

فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ تعطيل حرارة K بروتين في 90 درجة مئوية لمدة 2.5 دقيقة. لا ينصح انحراف عن هذا. قد ارتفاع درجات الحرارة أو أوقات أطول تلف الحمض النووي، في حين أن درجات الحرارة المنخفضة أو أقصر الأوقات لا يجوز تعطيل للبروتين K.

للتذكير، بيسلفيت الصوديوم وهيدروكينون هي الحساسية للضوء. الحلول يجب أن تكون على استعداد ومن ثم ملفوفة في احباط، والعنبر أنابيب و / أو وضعها في درج مظلم حتى الاستخدام. مرة واحدة تم إضافة حل بيسلفيت إلى رهو أنبوب، ينبغي تغطية الأنبوب بورق أو كيس الظلام يغطي عندما تفرخ في 50 درجة مئوية. نستخدم أكياس رقائق فارغ من GE للرعاية الصحية التي تحتوي أصلا على الساخن بداية الخرز PCR.

أخيرا، كما هو الحال مع معظم تقارير إتمام المشروعات، ونحن نوصي إعداد كل جولة في الوقت المناسب. والتأخير المفرط، وخصوصا بعد خلط في 70 درجة مئوية، والحد من نسبة نجاح التضخيم.

في الوقت الراهن، واحد الحد من هذا البروتوكول هو أن نسبة نجاح التضخيم بيسلفيت الحمض النووي تحويلها من البويضات فرد يتراوح بين 40٪ إلى 65٪ اعتمادا على قطعة الجين تضخيمها. في حين إضافية حل المشاكل قد تزيد هذه النسبة، وهناك مفاضلة بين معاملة تحويل بيسلفيت كونها طويلة جدا أو القاسية وعدم وجود ما يكفي من معدلات التحويل (> 85-90٪). والقيد الثاني هو أن الطفرات حاليا بيسلفيت لا يمكن التمييز بين القمعية methylcytosine-5 وسيطة نزع الميثيل 5-HYdroxymethylcytosine 13.

قد تكون هناك حاجة تعديلات عدة على أساس الجينات أو منطقة من اهتمام. ربما يكون الوقت تحويل بيسلفيت تتطلب التحسين لأعلى نسبة التحويل مع الضرر أدنى الحمض النووي. نقترح مجموعة من 2.5 إلى 4 ساعات (بزيادة نصف ساعة) لتلقي العلاج بيسلفيت. يمكن أن تنطوي على مزيد من التحسين PCR التصميم التمهيدي لمتواليات تحويلها من مصلحة (على سبيل المثال http://www.urogene.org/methprimer/ )، فضلا عن الاستفادة المثلى من برامج PCR بناء على طول جزء ومحتوى CG (انظر باترسون وآخرون. لل خيارات إضافية لتحسين بيسلفيت الطفرات 7). قد تكون هناك حاجة لتعديل الأخير هو أن استخراج الهلام من المنتج الثاني 2 PCR الجولة إذا كان هناك وفرة التمهيدي-dimers أو غير محددة amplicons التي من شأنها أن الاندماج في ناقلات عندما المستنسخة.

لقد أظهرنا في وقت سابق ان هذابروتوكول فعال لصناعة المعلومات البويضات فرد 12. لقد اختبرنا أيضا كفاءتها في البويضات تنمو في مجموعة من أقطار مختلفة البويضة، مع نفس معدلات التضخيم الناجحة من الحمض النووي المحولة. الأهم من ذلك، بالمقارنة مع غيرها من الإجراءات الطفرات بيسلفيت، والتي ليست فعالة للدراسات مثيلة في خلية واحدة، وهذا البروتوكول يتيح للتحليل الحامض النووي من البويضات والأجنة الفردية في وقت مبكر. هذا أمر ضروري لدراسات البيولوجيا الإنجابية والتنموية، وعلى وجه التحديد ما تتصل التلاعب من الخلايا التناسلية والأجنة في وقت مبكر. قد التطبيقات المستقبلية وتشمل تحليل أنماط الحامض النووي في الخلايا واحد من أي مصدر، بما في ذلك في الخلايا الحية المستمدة من ومثقف. بالإضافة إلى ذلك، طورنا فحص الكيسة فرد أن يسترد الحمض النووي والحمض النووي الريبي من الجنين نفسه، مما يسمح لكلا التعبير والبيانات مثيلة التي يمكن الحصول عليها. وهناك تطبيق في المستقبل تنطوي على تعديل سينغله فحص البويضة لاستعادة الحمض النووي الريبي لتحاليل التعبير، فضلا عن فحوصات الحمض النووي للمثيلة. سوف يكون آخر التحسين لأداء فحوصات مزدوجة للبويضة نفسها، على غرار الحاج وآخرون 14، من شأنها أن تسمح للكشف عن مثيلة في الجين ميثليته جسديا البويضة، جنين، unmethyated، مما يسمح الكشف عن تلوث الخلية الركامية.

ويمكن للتحليلات الحامض النووي تتراوح بين الجينوم على نطاق واسع مكان محدد. الجينوم على نطاق وسائل مثل مناعي الحمض النووي ميثليته (MeDIP) بالتزامن مع ميكروأرس أو التسلسل عادة ما تتطلب كميات وفيرة من المواد. موضع محدد الأساليب التي تشمل الجمع بين تحليل تقييد بيسلفيت (كوبرا) باستخدام أنزيمات تقييد مثلأيشن محددة، أو عدة MethylDetector (الحافز بالموقع)، هي أقل من المستوى الأمثل لتحاليل الكيسة واحدة، مما أدى إلى انتعاش غير كافية من الحمض النووي، والتحيز PCR وعدم وجود استنساخ. نهج بديل للبويضة واحدة والبريدآرلي تحليل مثيلة جنين الاستفادة من عدة مثلأيشن EZ-DNA (الإنزيم للبحوث) مع بيسلفيت تخفيف محدود pyrosequencing تقنية 14، على الرغم من أن معدلات النجاح وذكرت من تضخيم الحمض النووي بيسلفيت تحويل أقل مما كان الأسلوب هو موضح هنا.

الطفرات بيسلفيت هو معيار الذهب لتحليل الحامض النووي، ومن الواضح أن تحليل الخلايا واحد هو خطوة هامة إلى الأمام. الاغاروز التضمين يسمح أصغر حجما عينة لتحليلها مع العلاج بيسلفيت، كما يحمي من تدهور الاغاروز الحمض النووي DNA، ويمنع فقدان خلال خطوات عديدة بروتوكول. ومع ذلك، بالمقارنة مع الكيسة، وبويضة واحدة لديها ما يقرب من 3-6 خريج من الحمض النووي الجيني. بروتوكول لدينا تعديل، والذي يضمن البويضات واحدة في المخزن الاغاروز تحلل تحتوي على، ويمنع الحمض النووي بداية خسارة في الخطوة الأولي تحلل والمعتدلين في علاج بيسلفيت قاسية. في ملخص، والاستفادة من تحليل بويضة واحدة هو أنه يتيحالكشف عن تلوث الخلية الركامية غير مقصود، فضلا عن فضح أحداث نادرة والقضاء على أي تحيز PCR في العينات المجمعة. تماما، هذا بروتوكول تعديل ليوفر جودة البيانات عن حالة مثيلة من البويضات والأجنة الفردية في وقت مبكر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل جامعة ويسترن اونتاريو، وقسم التوليد وأمراض النساء، ومنحة ER06-02-188 من البحوث Ministryof والابتكار، في وقت مبكر جائزة الباحث. وأيدت الاحزاب من قبل برنامج التدريب CIHR في التكاثر، والتنمية في وقت مبكر وتأثير ذلك على الصحة منحة دراسات عليا (REDIH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oocyte Collection
Hyaluronidase Sigma H4272
Acidic Tyrode Sigma T1788
Proteinase K Sigma P5568
10% IGEPAL Bioshop NON999.500
Lysis Solution
Tris pH 7.5 Bioshop TRS001.5
LiCl Sigma L9650
EDTA pH 8.0 Sigma E5134
LiDS Bioshop LDS701.10
DTT Invitrogen P2325
SDS Lysis Buffer
TE pH 7.5 Bioshop(Tris)Sigma (EDTA) TRS001.5 E5134
10% SDS Bioshop SDS001.500
Bisulfite Conversion
Sodium Hydroxide Sigma S8045
Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) Sigma 243973
Hydroquinone Sigma H9003
Low Melting Point (LMP) Agarose Sigma A9414
Mineral Oil Sigma M8410
M2 Medium Sigma M7167
GIBCO Distilled water Invitrogen 15230-196
Autoclaved double distilled (dd) water
PCR
Illustra Hot Start Mix RTG GE Healthcare 28-9006-54
240 ng/ml yeast tRNA Invitrogen 15401-011
Inner and outer nested primers Sigma
Ligation
Promega pGEM-T Easy Vector Fisher Scientific A1360
TA Cloning
Competent E.coli cells Zymo Research Corp. T3009
Equipment
Dissecting Microscope
70 °C and 90 °C Heat Blocks
37 °C and 50 °C Waterbaths (42 °C for transformations)
Rocker
PCR machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  2. Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
  3. Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
  4. Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
  5. Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
  6. Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
  7. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
  8. Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
  9. Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
  10. Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
  11. Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
  12. Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
  13. Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  14. Hajj, N. E. l Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
وحيد الطفرات سيت بيسلفيت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. W. Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis. J. Vis. Exp. (64), e4046, doi:10.3791/4046 (2012).More

Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. W. Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis. J. Vis. Exp. (64), e4046, doi:10.3791/4046 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter