Mutagenèse bisulfite est l'étalon-or pour l'analyse de méthylation de l'ADN. Notre protocole modifié permet une analyse méthylation de l'ADN au niveau unicellulaire et a été spécialement conçu pour les ovocytes individuels. Il peut également être utilisé pour le clivage-embryons au stade.
L'épigénétique englobe toutes héréditaires et des modifications réversibles de la chromatine que l'accessibilité des gènes alter, et sont donc les principaux mécanismes de régulation de la transcription du gène 1. Méthylation de l'ADN est une modification épigénétique qui agit principalement comme une marque de répression. Grâce à l'addition covalente d'un groupement méthyle sur les cytosines dans les dinucléotides CpG, on peut recruter d'autres protéines de répression et les modifications des histones pour lancer le processus impliqués dans la condensation de la chromatine et faire taire des gènes 2. Méthylation de l'ADN est essentielle pour le développement normal car elle joue un rôle essentiel dans la programmation du développement, la différenciation cellulaire, la répression des éléments rétroviraux, inactivation du chromosome X et l'empreinte génomique.
Une des méthodes les plus puissants pour l'analyse méthylation de l'ADN est la mutagenèse bisulfite. Bisulfite de sodium est un agent mutagène ADN qui désamine cytosines en uraciles. Après amplification par PCR et seque ncing, ces phénomènes de conversion sont détectés comme thymines. Cytosines méthylées sont protégés de la désamination et restent donc en cytosines, permettant l'identification de la méthylation de l'ADN au niveau individuel nucléotide 3. Développement de l'essai de mutagenèse bisulfite a progressé de ceux initialement déclarés 4-6 vers ceux qui sont plus sensible et reproductible 7. Un progrès important a été l'incorporation de petites quantités d'ADN dans un bourrelet d'agarose, protégeant ainsi l'ADN provenant du traitement bisulfite dure 8. Cette analyse de la méthylation permis à être exécuté sur des pools d'ovocytes et embryons au stade blastocyste-9. Le protocole le plus sophistiqué du bisulfite de mutagenèse à ce jour est pour individuels blastocyste-embryons au stade 10. Toutefois, étant donné que les blastocystes ont en moyenne 64 cellules (contenant 120-720 pg d'ADN génomique), cette méthode n'est pas efficace pour les études de méthylation sur les ovocytes individuels ou clivage au stade d'embryons.
tente "> Prendre des indices de plongement d'agarose des montants d'ADN minute, y compris les ovocytes 11, nous présentons ici une méthode par laquelle les ovocytes sont directement intégrés dans une solution de lyse agarose et perles de récupération qui suit immédiatement et le retrait de la zone pellucide de l'ovocyte. Cela nous permet de contourner les deux principaux défis de la mutagenèse ovocyte unique: bisulfite. protégeant une infime quantité d'ADN de la dégradation et la perte subséquente au cours des étapes du protocole de nombreuses important, car les données sont obtenues à partir d'ovocytes simples, la question de la partialité PCR au sein des pools est éliminée plus. , par inadvertance la contamination de cellules du cumulus est détectable par cette méthode depuis n'importe quel échantillon avec plus d'un modèle de méthylation peuvent être exclus de l'analyse 12. Ce protocole fournit une méthode améliorée pour les analyses réussies et reproductibles de méthylation de l'ADN au niveau unicellulaire et est parfaitement adapté des ovocytes individuels ainsi que le clivage au stade d'embryons.Ce test seul ovocyte contient de nombreuses étapes avec un certain nombre qui sont essentiels et nécessitent des soins spéciaux. La première est le lavage des ovocytes. Il est particulièrement important de se laver chaque ovocyte à plusieurs reprises dans un milieu frais tombe suite à un traitement hyaluronidase pour enlever le plus les cellules du cumulus plus grand nombre possible. En outre, lors du transfert des ovocytes à la solution acide de Tyrode pour zone pellucide retrait assurez-vous du milieu environn…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par l'Université de Western Ontario, le Département d'obstétrique et de gynécologie, et une subvention ER06-02-188 à partir de la recherche et l'innovation Ministryof, bourse de nouveau chercheur. MMD a été soutenue par un programme de formation des IRSC sur la reproduction, le développement des jeunes et l'impact sur les bourses d'études supérieures de la santé (REDIH).
Table of specific reagents and equipment.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Oocyte Collection | |||
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
Proteinase K | Sigma | P5568 | |
10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
Lysis Solution | |||
Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
LiCl | Sigma | L9650 | |
EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
DTT | Invitrogen | P2325 | |
SDS Lysis Buffer | |||
TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
Bisulfite Conversion | |||
Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
M2 Medium | Sigma | M7167 | |
GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
Autoclaved double distilled (dd) water | |||
PCR | |||
Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
Inner and outer nested primers | Sigma | ||
Ligation | |||
Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
TA Cloning | |||
Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
Equipment | |||
Dissecting Microscope | |||
70°C and 90°C Heat Blocks | |||
37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
Rocker | |||
PCR machine |