Summary
대뇌 피질의 기능이 뉴런의 인구의 수준에 발생하기 때문에 척추 중추 신경계의 기능을 이해하는 것은 많은 뉴런의 녹음이 필요합니다. 다음은 단일 셀 및 단일 스파이크 해상도로 suprathreshold 신경 활동을 기록 할 수있는 광학 방법을 설명, 랜덤 액세스 검사는 디더링. 까지의 높은 시간적 해상도 100 뉴런이 방법을 기록 체세포 형광 칼슘 신호. 최고 확률이 알고리즘은 체세포의 형광 칼슘 신호의 기본 suprathreshold 신경 활동을 deconvolves. 이 방법은 안정적으로 높은 검출 효율과 잘못된 반응의 낮은 속도로 스파이크를 감지하고 신경 인구를 공부하는 데 사용할 수 있습니다
Abstract
척추 중추 신경계의 정보 신호는 종종 뉴런이 아닌 개별 뉴런의 인구에 의해 수행됩니다. 또한 suprathreshold의 난리 활동의 전파는 뉴런의 인구를 포함합니다. 대뇌 피질의 기능을 해결 경험적 연구는 직접 따라서 고해상도로 뉴런의 인구에서 녹음이 필요합니다. 여기 광학 방법 및 최대 단일 셀 및 단일 스파이크 해상도 100 뉴런에서까지 신경 활동을 기록 할 수있는 deconvolution 알고리즘을 설명합니다. 이 방법은 대뇌 피질의 뉴런의 suprathreshold 전기 스파이크 (활동 전위)와 관련된 세포 체세포의 칼슘 농도의 일시적 증가 감지에 의존하고 있습니다. 광학 녹음의 높은 시간적 해상도는 음향 광학 편 향기 (AODs) 1을 사용하여 빠른 랜덤 액세스 스캐닝 기술에 의해 달성된다. 불투명 뇌 소유의 높은 공간 해상도의 칼슘에 민감한 염료 결과의 2 광자 여기2 고소 해요. 형광 칼슘 녹음에서 스파이크의 재건은 최고 가능성 방법에 의해 달성된다. 동시 electrophysiological 및 광학 녹음은 우리의 방법은 안정적으로 스파이크를 (> 97% 스파이크 검출 효율) 검색을 나타냅니다, 허위 긍정적 인 스파이크 감지 (<0.003 스파이크 / s)로, 높은 시간적 정밀 (MS 3) 3의 낮은 속도가 있습니다. 스파이크 검출이 광학 방식은 체외과 생체 3,4에 anesthetized 동물의 신경 활동을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. 광 설치 (그림 1)
- 두 광자 여기 들어 femtosecond 펄스와 적외선 펄스 레이저 시스템이 사용됩니다. 높은 레이저 출력 전력은 (> 2W 890 nm의 파장에서 경우에 따라) 시스템의 광학 구성 요소가 도입 된 대형 손실을 상쇄하기 위해 필요합니다.
- 이 프리즘으로 구성된 prechirper 시스템은 AODs 1 소개 시간적 분산을 보상하기 전에 음향 광학 편 향기 (AODs)에 레이저 펄스에 부정적인 그룹 속도 분산 (GVD)를 부여.
- 큰 구멍이 두 개 AODs (NA 0.8과 40x 물 침지 목표를위한 10mm)는 2 차원 레이저 빔을 편향.
- 100 숲 / mm와 반사 회절 격자는 짧은 레이저 펄스를 사용하는 경우 AODs 뒤 13cm가 AODs에 의해 도입 된 공간 분산을 보상하기 위해 배치됩니다.
- 레이저 빔이 수직 microsco의 카메라 포트에 두 릴레이 윤곽을 지향하는PE.
- 창포는 광학 부품의 정렬을 위해 정기적으로 게재됩니다.
- 목표 앞의 이색 beamsplitter는 표본에 적외선 여기 빛을 전송하고 검출기로 시료의 형광 빛을 반영합니다.
- 에피네프린과 transfluorescence 감지기 (photomultipliers, PMTs)는 객관적으로 형광 신호를 수집하고 - 해당되는 경우 - 콘덴서를 통해.
- 컬러 유리 필터 (BG-39, 3~5mm)은 감지기에 도달 여기 빛을 방지하기 위해 검출기 앞에 위치하게된다.
- AOD 편향 각도는 결과적으로 전압 제어 발진기를 구동 디지털 - 아날로그 컨버터 보드 (156.25 kHz에서 클럭 속도),가 장착 된 컴퓨터에 의해 제어됩니다.
- photomultipliers에서 신호에 저장되기 전에 로우 패스 버터 필터 (100 kHz에서의 컷 - 오프 주파수)를 통해 릴레이와 아날로그 디지털 컨버터 (156.25 kHz에서 클럭 속도)에 의해 디지털화되어분석을 위해 컴퓨터.
- 정렬 및 전기 노이즈뿐만 아니라 함께하고 표시없이 photomultipliers 낮은과 높은 게인에서 레이저 빛과없는 형광 신호의 분포를 기록하여 테스트됩니다. 스캐너가 올바르게 설정과 높은 게인에서와 표시기과 형광 신호의 분포의 폭이 형광 신호의 다른 배포판 (그림 2)의 폭보다 훨씬 큰 경우 차폐되어 있습니다.
2. 실험 절차
- 디더링 랜덤 액세스 검색 칼슘이 세포 증가의 감지에 의존하고 있습니다. 뉴런의 큰 숫자는 신경 조직을 5로 칼슘 표시기의 에스테르 양식 (예를 들어, 오레곤 그린 488 Bapta-1 AM)의 bolus 주사를 사용하는 물들 일 수 있습니다.
- 각 뉴런 소마의 여러 위치는 ( "디더링", 4 위치, 각 위치에 대한 6.4 μs 전자에 = 25.6 μs 녹음 시간, 짧은 시간 동안 각각 기록됩니다각주기에서 ACH 신경, 그림. 3C). 관심 뉴런을 선택하려면 256x256 픽셀로 구성된 풀 프레임 (그림 3A) 획득됩니다. 기록 할 각 뉴런 소마의 중심이 이미지에서 수동으로 선택됩니다. 제어 소프트웨어가 자동으로이 센터 주변 2 μm 거리에서 세 가지 문제점을 추가합니다.
- 각 사이클에서 형광 신호가 40 뉴런 (그림 3B)의 각에서 기록됩니다. 이 과정은 한 기록 (오초 녹음이 = 3,255 사이클, 1 사이클 = 1.536 밀리 초)의 전체 기간 동안 반복됩니다.
3. 스파이크 감지 효율성을 극대화하는 온라인 소프트웨어 도구
- 형광 체세포의 칼슘 신호의 스파이크 감지 체세포 형광 칼슘 신호의 높은 신호 대 잡음 (S / N) 비율에 의존하고 있습니다. S / N 고는 여기 강도를 높임으로써 달성 될 수있다. 여기 강도 그러나, 단 한 photodamage의 특정 제한으로 증가 할 수 있습니다. 스파이크 감지는 매우 작은 windo 내에서 높은형광 신호가 높은 S / N하지만이 여기 농도의 w 만있는 매우 작은 photodamage 3을 관찰하고 있습니다. 기록 된 신호는 우리가 광자 속도 (방정식 3.2 참조) 및 온라인 분석을 사용하여 기본 형광의 감소를 모니터링 녹음하는 동안 높은 스파이크 감지의 창 내에되도록하기 위해.
- 뉴런 당 대략 광자 요금은 기준 노이즈의 짧은 시간 창 (100-200 MS)에서 계산됩니다. 광자의 수 (N λ)와 광자 속도 (λ = N λ / Δt)이 다음과 같은 식으로 상대 형광 변화의 분포를 (σ) 맞는하여 형광 값에서 계산됩니다 :
이 방정식은 상대적으로 형광 변화에 변수의 변화와 광자 샷 노이즈에 대한 푸 아송 분포를 나타냅니다 : ΔF / F = (G * N λ (t)-G * N & 램BDA,, 0) / G * N λ, G는 광전자 증의 누적 이득과 다른 모든 전자 부품을 나타냅니다 0. 광자 샷 소음과 더불어 소음의 다른 소스 (운동 유물)가 있기 때문에이 수식이 제대로 생체 녹음에 대한 감지 광자의 수를 확인하지 않습니다. 그럼에도 불구하고이 방정식은 소음을 추정하기 위해 생체 녹음에 유용합니다.
- 기본 형광은 같은 시간 창에서 계산 시간이나 시험의 함수로 도시된다. 기준의 평균 감소가이 제한을 초과 할 때 스파이크 검색이 빠르게 거부하기 때문에 레이저 파워를 조정하여 0.0002 / s의 아래 보관됩니다.
- 뉴런의 somata 위치마다 10-20 분 다시 전체 프레임 이미지를 획득하여 확인합니다. 필요한 경우, 녹음 위치는 조정됩니다. 위치는 한 번에, 또는 개별 뉴런의 모든 뉴런에 조정할 수 있습니다.
4. ReconstructioN 형광 신호 (deconvolution)에서 스파이크 타이밍의
- 칼슘 과도의 부패가 길어서 시간에 자주 summate 신경 활동에서 발생하는 형광 신호 (수백 밀리 초). deconvolution 방법은 형광 신호의 스파이크와 스파이크 타이밍을 reconstructs.
- 기록 된 형광 신호를 근간 가능성이 가장 높은 스파이크 열차를 확인하려면 다른 모델 비교됩니다. 여기 우리는 모델을 결정하기 위해 유전자 알고리즘을 사용 - 그리고 스파이크 열차와 스파이크 타이밍 때문에 - 최대 가능성이 있습니다.
- 뉴런의 inhomogeneous 인구에서 스파이크-evoked 칼슘 신호는 뉴런 사이에 다를 수 있습니다. 데이터의 혼자 가잖 분석 설정을 위해이 계정으로 뉴런에서 뉴런의 스파이크-evoked 칼슘 신호의 변화를 소요하는 알고리즘을 설계했습니다.
- 거짓 긍정적 인 탐지 많은 수의를 피하려면이 m의 상수를 허용 진폭 및 붕괴 시간을 수축하는 데 유용합니다스파이크 - evoked 칼슘 신호의 odel. 단일 스파이크 evoked 칼슘 과도의 상수 진폭 및 부패 시간의 공동 분배 동시 electrophysiological 및 광학 녹음을 사용하여 동일한 실험 조건에서 뉴런의 같은 종류의 실험 별도의 세트에 기록됩니다.
- 느린 기준 변경에 대한 설명과 deconvolving의 전산 비용을 절감하기 위해 더 이상 녹음 1~5초의 여러 짧은 흔적으로 나누어집니다.
- 각 뉴런 각 녹화를 들어, deconvolution 알고리즘은 모델의 큰 번호 (최대 1,000,000 다른 모델 이상) 테스트 할 수 있습니다. deconvolution의 속도를 높이기 위해 하나의 실험은 병렬 10 개 컴퓨터에에 deconvolved 있습니다.
- deconvolution 후, 스파이크 데이터 분석 검사합니다. 아름다운 요정 - 자극 시간 히스토그램, 스파이크 확률, 그리고 발사 속도는 (뉴런 당 평균 스파이크) 자동화 된 방식으로 계산됩니다.
5.대표 결과
기록 된 형광 체세포의 칼슘 신호의 높은 신호 대 노이즈 비에 성공 스파이크 감지 한겁니다. 단순히 높은 여기 속도 (높은 레이저 전원)를 사용하여 생물학적 물질 (photodamage)에 photoeffects의 부정적인 영향이 발생할 수 있습니다. 디더링 랜덤 액세스 스캐닝 photodamage에서 기준 형광의 감소로 명부와 스파이크-evoked 칼슘 형광 신호의 감소. 스파이크 - evoked 신호의 감소가 빠르게 스파이크를 감지 할 수있는 오류가 발생할 수 있습니다. 형광 신호의 스파이크 감지가 높은 여기 강도 만 매우 작은 창이 있습니다. 높은 끝에이 창은 낮은 끝에있는 형광 신호가 낮은 신호 대 잡음 비율을 가지고 photodamage에 의해 제한됩니다. 급성 조각의 대뇌 피질의 뉴런에 우리는 슬라이스 표면 아래 약 100 μm에서 녹음 할 때 400,000-1,500,000에 대한 광자 / s의 광자 속도의 결과로 레이저 전원을 사용합니다. 높은을 사용하는 경우화성 표시기는 - 여기 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 -이 신호는 개별 스파이크를 감지하기에 충분한 것입니다. 그림. 3E는 매우 낮은 여기 속도, 검색 창에서 녹화 중 하나를 예를 들어, 매우 높은 여기 속도로 하나를 기록 형광 신호의 예를 보여줍니다.
단일 셀 및 단일 스파이크 해상도 신경 활동을 기록하기 위해 다른 기술에 비해 랜덤 액세스 검색이 동일한 지역 인구의 뉴런의 큰 숫자에서 기록 할 수 디더링 및 tetrode / multielectrode 녹음에 비해 예를 들어, 이하 침입입니다 . 따라서 디더링 랜덤 액세스 검사는 suprathreshold 활동 6 (그림 4A), 뉴런 (대뇌 피질의 소성)의 인구의 신경 활동의 변화에 의해 신호를 상호 정보를 측정하는 여러 뉴런의 신경 활동을 기록하고, suprathreshold 활동 전파하는 데 사용할 수 있습니다 뉴런 14 인구 (그림 4B)를 통해
그림 1. 디더링 - 랜덤 액세스 검사 설정의 광학 설계.
그림 2 정렬 및 테스트 :. 다른 상황에서 기록 된 형광 신호를 분배. A) 높은 PMT 증가,하지만 레이저 광에서 레이저 광과 낮은 광전자 증 증가, B) 아니오, 배포 때문에 광전자 증 어두운 전류의 넓은 없습니다. C)에서 레이저로 높은 PMT 증가로 기록. B에 표시의 배포판이 배포 사이의 차이는 여기 빛이 PMT 검출기에 도달 나타냅니다. D) 형광 신호의 분포는 신경 somata에서 높은 게인에서 기록했다. 다른 잡음 소스가 기여하지 않으면,이 분포 샷 노이즈 광자에서만 발생합니다.
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그림 3 디더링 원칙 중 하나 사이클의 신경 세포의 somata 위치를 검색하고 선택 A) 전체 프레임 형광 이미지, B) 스캔 경로, C)이 그림,. 각 소마 (원) 여러 장소에서는 다음에 빔을 이동하기 전에 기록됩니다 두 D / A 채널의 출력 소마, D) 그림. 각 뉴런 소마를 들어, 형광 신호는 각 소마의 4 가지 명소 (S1-S4)에서 기록됩니다. 각 지점의 위치는 그 x와 y 위치에 의해 주어진다. x와 모든 장소와 모든 뉴런에 Y 위치는 순차적 방식으로 디지털 - 아날로그 변환기로 전송됩니다. 빔은 두 뉴런의 somata 사이에 이동하는 동안 신호가 (빈) 취득하지 않습니다. E 형광 신호의) 예. 각 예제는합니다 (electrophysiological 셀 - 첨부 된 기록으로 측정) 한 스파이크에 대한 응답을 보여줍니다합니다.
그림 4. corti 유학칼 기능은 디더링 랜덤 액세스 검색을 사용합니다. A) 뉴런의 인구에 의해 신호를 상호 정보를 측정. 위의 이미지는 급성 뇌 조각과 레이어 4 (L4)에서 동일한 대뇌 피질의 열에서 배치 두 자극의 피펫의 현미경 사진을 보여줍니다. 센터 그래프는 자극의 각 반복에 대해 신경 반응을 보여줍니다. 낮은 그래프는 뉴런의 기록 인구에 의해 신호 섀넌의 상호 정보를 보여줍니다. 대뇌 피질의 뉴런의 인구 사이 suprathreshold 솟고 활동의 B) 측정 전파 (신호 전파). 상단 그래프는 실험 디자인을 보여줍니다, 중심 이미지는 형광 이미지를 보여줍니다, 점선은 배럴 국경을 나타냅니다, 낮은 그래프 thalamocortical 섬유 (삼각형)의 전기 자극에 대한 응답으로 검색 스파이크를 보여줍니다.
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Discussion
디더링 랜덤 액세스 검사는 간접적으로 신경 세포의 somata의 각 스파이크와 관련된 세포 체세포 칼슘의 증가에서 suprathreshold 솟고 활동을 감지합니다. 세포 내 칼슘의 증가는 형광 칼슘 염료에 의해 감지됩니다. 디더링 랜덤 액세스 검색의 한계는 칼슘 형광 신호의 제한된 신호 대 잡음 비율에서 크게 발생한다. 신호 대 잡음 비율이 높은 여기 요금을 사용하실 수 없습니다 photodamage에 의해 제한 차례에 있습니다. 때문에 제한된 신호 대 잡음 비율, 스파이크 감지 일부 뉴런에 실패하고도 지속적인 높은 주파수 활동을 위해 실패 할 수 있습니다. 예를 들어, 생체에서 녹화가 스파이크 감지가 강력하게 40 Hz에서 스파이크 요금에 대한 감소 및 4 이상 때. 감소 스파이크 감지하는 이유는 정확하고 잘못된 모델 가능성 차이가 짧아 간 스파이크 간격에 대한 점점 더 작은 될 것입니다. 게다가, 디더링 랜덤 액세스 검사 만 체세포는 칼슘의 증가 뉴런의 인구에 사용할 수는 매우 모든 뇌 영역과 세포 유형 (과립 세포에 대한 예를 들어 올챙이 후각 망울 8의 경우이 아닌 활동 7 솟고과 상관 아르 ).
광학 설계의 대안으로 우리는 하나의 프리즘이 AODs 대신 두 개의 프리즘과 회절 격자 4,9의 공간과 시간적 분산을 보상하는 데 사용할 수 있습니다 여기에 사용했습니다. 하나의 프리즘 디자인의 장점은 레이저 전력의 높은 처리량입니다. 우리가 사용했던 주파수 생성기의 아날로그 제어에 대한 대안으로, 디지털 제어 방식은 1,4,10을 사용할 수 있습니다. 아날로그 제어 구현하는 간단하지만, 또한 전기 노이즈의 왜곡에 더 자주 발생합니다. 전기 노이즈 따라서 스파이크 dete를 줄여 기록 된 칼슘 형광 신호의 높은 소음에 빔 위치와 결과에 영향을 미칠 수 있습니다ction 효율. 디지털 제어 방식은 반면에, 디지털화 유물 될 수 있습니다.
여러 알고리즘은 형광 신호의 스파이크의 deconvolution을 위해 제안되었습니다. 다음은 템플릿 매칭 알고리즘, "필링"알고리즘 4 연속 몬테카를로 방법 11, 최고 확률 방법 3, 다른 12이 있습니다. 이러한 방법 중 단 몇은 inhomogeneous 인구의 증가 - evoked 칼슘 신호의 차이를 설명. 우리 알고리즘 뉴런 사이의 스파이크-evoked 칼슘 신호의 진폭의 차이에 대한 계정. 그것은 따라서 자동화와 혼자 가잖 방식으로 뉴런의 inhomogeneous 인구에서 큰 데이터 세트를 deconvolve하는 데 사용할 수 있습니다.
광학 스파이크 감지를 사용하여 인 생체 녹음이 얕은 층의 뉴런으로 제한됩니다. 또한, 인 생체 녹음은 머리 MOV에서 발생하는 운동 유물의 추가 어려움에 직면자유롭게 동물과 anesthetized 또는 고정 동물의 심장 박동을 이동에 ements. 심지어 작은 움직임이 활동을 솟고에 의해 evoked 사람들을 초과 형광 변화 될 수 있기 때문에 이러한 운동 유물 쉽게 스파이크 감지를 방지 할 수 있습니다. 잠재적 인 솔루션은 오버 샘플링과 움직임 수정 방법이 포함되어 있습니다.
지난 몇 년간은 기술과 광학 suprathreshold 신경 활동을 감지 할 수있는 분석 방법의 급속한 발전을 보았다. 미래의 기술 향상은 또한 듀티 사이클을 증가하여 디더링 랜덤 액세스 검색의 유용성을 증가시킬 수있다. 두 스파이크 검출 효율뿐만 아니라 기록 뉴런의 수는 높은 듀티 사이클 혜택을 누리 실 수 있습니다. 유전자 인코딩 칼슘 지표는 뉴런의 bolus 얼룩을 제거 또는 얼룩과 뉴런의 특정 subpopulations에서 녹화 허용 할 수 있습니다. 현재, 그러나, 유전자 코드 칼슘 지표의 낮은 형광 변화 할하나의 스파이크 13 신뢰할 수있는 감지 할 수 없습니다. 마지막으로, 모션 아티팩트의 실시간 보상 깨어과 행동 동물에서 레코딩을 허용합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 매우 원고를 읽기 위해 박사 랜디 Chitwood 감사드립니다. 이 작품은 관청 재단과 HJK 할 수있는 알프레드 P. 슬로안 재단 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optical components are listed in order, starting from the laser | |||
| Titan:Sapphire Laser | Coherent Inc. | Chameleon Ultra 2 | High power output recommended (>2W at 900 nm) |
| Achromatic lens f = 30 mm | Thor labs | AC254-030-B | Anti-reflection (AR) coating for 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 75 mm | Thor labs | LA1608-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 175 mm | Thor labs | LA1229-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 300 mm | Thor labs | AC254-300-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Acousto-optical deflectors | Intraaction Corp | ATD 6510CD2 | |
| Reflective diffraction grating | Newport | 53-011R | 100 grooves/mm for AODs with 65 MHz bandwidth and scan angle of 45 mrad |
| 21.6 mm Brewster prisms | Lambda Research Optics Inc. | IBP21.6SF10 | |
| Colored Glass | Schott | BG-39 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp | Z532RDC | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu | H9305-03 | |
| DAC-ADC board | National Instruments | PCI-6115 | |
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O-6807 | |
References
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