Summary
Förstå funktionen hos vertebraten centrala nervsystemet kräver inspelningar från många neuroner eftersom kortikal funktion uppstår på nivån av populationer av neuroner. Här beskriver vi en optisk metod för att registrera suprathreshold neural aktivitet med encelliga och enda spik upplösning, rastrerade random-access scanning. Denna metod spelar in somatiska fluorescens kalcium signaler från upp till 100 nervceller med hög tidsupplösning. En maximal sannolikhet algoritm deconvolves underliggande suprathreshold neural aktivitet från de somatiska fluorescens kalcium signaler. Denna metod upptäcker tillförlitligt toppar med hög upptäckt effektivitet och en låg grad av falsklarm och kan användas för att studera neurala populationer
Abstract
Signalering av information i ryggradsdjur centrala nervsystemet är ofta bärs av populationer av nervceller snarare än enskilda neuroner. Även spridningen av suprathreshold tillsatta verksamhet innefattar populationer av nervceller. Empiriska studier som behandlar kortikal funktion direkt kräver således inspelningar från populationer av nervceller med hög upplösning. Här beskriver vi en optisk metod och en avfaltning algoritm för att registrera neural aktivitet från upp till 100 nervceller med en enda cell och enda spik upplösning. Denna metod bygger på detektering av övergående ökningar av intracellulär somatisk kalciumkoncentration i samband med suprathreshold elektriska spikar (aktionspotentialer) i kortikala neuron. Hög temporal upplösning av de optiska inspelningar uppnås genom en snabb direktminne avsökningsteknik med akusto-optiska deflektorer (AODs) 1. Tvåfotonexcitering av kalcium-känsligt färgämne resulterar i hög rymdupplösning i ogenomskinliga hjärnan tisstämma 2. Rekonstruktion av spikar från fluorescensen kalcium inspelningar uppnås genom en maximal sannolikhet metoden. Samtidig elektrofysiologiska och optiska inspelningar visar att vår metod tillförlitligt upptäcker spikar (> 97% spik upptäckt effektivitet), har en låg falskt positiva spik detektion (<0,003 spikar / s) och en hög tidsmässig precision (ca 3 ms) 3. Denna optiska metod spik detektering kan användas för att registrera neural aktivitet in vitro och i bedövade djur in vivo 3,4.
Protocol
1. Optisk installation (figur 1)
- För tvåfotonexcitering en infraröd pulsad laser system med femtosecond pulser används. En hög laseruteffekt (i vissa fall> 2W vid 890 nm våglängd) krävs för att kompensera för de stora förluster införs genom de optiska komponenterna i systemet.
- Ett prechirper bestående av två prismor ger en negativ dispersion grupphastighet (GVD) på laserpulserna före akusto-optiska deflektorer (AODs) för att kompensera för den temporala dispersionen infördes genom AODs 1.
- Två AODs med stora öppningar (10 mm för en 40x nedsänkning i vatten mål med NA 0,8) avleda laserstrålen i två dimensioner.
- En reflekterande diffraktionsgitter med 100 dungar / mm placeras 13 cm bakom AODs att kompensera geografisk spridning som införs genom AODs vid användning korta laserpulser.
- Laserstrålen riktas med två relä teleskop i kameran hamn en upprätt microscope.
- Iris är placerade med jämna mellanrum för inriktning av de optiska komponenterna.
- En dikroisk stråldelare framför målet överför infraröda excitationsljus med förlagan och reflekterar fluorescens ljus från provet på en detektor.
- Epi-och transfluorescence detektorer (fotomultiplikatorer, PMT) samla fluorescenssignal genom mål och - i förekommande fall - genom kondensorn.
- Färgade glasfilter (BG-39, 3-5 mm) placeras framför detektorerna för att förhindra exciteringsljus når detektorerna.
- AOD nedböjning vinklar styrs av en dator utrustad med en digital-analog-omvandlare kortet (156,25 kHz klockfrekvens), vilket i sin tur driver spänningsstyrda oscillatorer.
- Signalen från fotomultiplikatorerna vidarebefordras genom ett lågpass-Butterworth-filter (cut off frekvens av 100 kHz) och digitaliseras av en analog-digital-omvandlare-(156,25 kHz klockfrekvensen) innan de lagras ien dator för analys.
- Justering och elektriska störningar testas genom att registrera fördelningen av fluorescens signaler med och utan laserljus, vid låg och hög förstärkning av fotomultiplikatorerna, samt med och utan indikator. Skannern är rätt inställd och skärmade när bredden av fördelningen av de fluorescenssignaler vid hög förstärkning och med indikator är mycket större än bredden på andra distributioner av fluorescenssignaler (Fig. 2).
2. Experimentella förfaranden
- Gitter random-access scanning bygger på detektion av intracellulära ökningar kalcium. Ett stort antal neuroner kan färgas med användning bolusinjektion av esterformen av en kalcium indikator (t.ex. Oregon Grön 488 BAPTA-1 AM) till neural vävnad 5.
- Flera platser från varje neuron soma registreras, var för en kort tid ("dithering", 4 platser, 6,4 xs för varje plats = 25,6 ps inspelningstid för each neuron i varje cykel, Fig.. 3C). För att välja nervceller av intresse en hel bild som består av 256x256 pixlar förvärvas (Fig. 3A). I mitten av varje neuron soma som ska spelas in väljs manuellt inom denna bilden. Styrmjukvaran lägger automatiskt tre poäng på 2 um avstånd runt detta centrum.
- I varje cykel, är fluorescenssignal registreras från var och en av de 40 neuroner (fig. 3B). Denna process upprepas för hela den tid en inspelning (5 sekund under tagningen = 3255 cykler, 1 cykel = 1,536 ms).
3. Online programvara för att maximera spika upptäckt effektivitet
- Spike detektering från fluorescens somatiska kalcium signaler bygger på ett högt signal-till-brus (S / N)-förhållande av de somatiska fluorescens kalcium signaler. En hög S / N kan uppnås genom att öka excitering intensitet. Excitation intensitet kan dock endast ökas till en viss gräns på grund av fotoskador. Spike detektering är hög inom ett mycket litet window excitation intensitet endast om fluorescenssignaler har en hög S / N, men bara väldigt lite fotoskada observeras 3. För att säkerställa att de registrerade signalerna ligger inom fönstret av hög spik upptäckt under inspelningar vi övervakar fotonen ränta (se ekvation 3,2) och minskning av baslinje fluorescens använder online-analys.
- Ungefärlig foton pris per neuron beräknas från en kort tidsfönster (100-200 ms) baslinjen buller. Antal fotoner (N λ) och foton-hastighet (λ = N λ / At) beräknas från de fluorescensvärdena genom att passa fördelningen (σ) i relativa fluorescens förändras med följande ekvation:
Denna ekvation representerar Poisson-fördelningen för foton skott buller med en förändring av variabel relativ fluorescens förändring: AF / F = (G * N λ (t)-G * N & lamBDA,, 0) / G * N λ, 0 där G betecknar den kumulativa vinst på fotomultiplikatorn och alla andra elektroniska komponenter. Observera att denna ekvation inte korrekt avgör antalet upptäckta fotoner för in vivo inspelningar eftersom det finns andra ljudkällor (rörelse artefakter), förutom foton skott buller. Ändå denna ekvation är användbar för in vivo inspelningar att uppskatta bullret.
- Baslinje fluorescens beräknas från samma tidsfönster och avsattes som en funktion av tid eller försök. Den genomsnittliga minskningen av baslinjen hålls under 0,0002 / s genom att justera lasereffekt eftersom spik detektion snabbt avtar om de överstiger denna gräns.
- Var 10-20 min neuron somata positionerna kontrolleras av åter förvärva en hel bild bild. Om det behövs, spelar platser justeras. Platser kan justeras för alla neuroner samtidigt eller för enskilda neuroner.
4. Reconstruction spik tider från fluorescenssignaler (dekonvolution)
- De fluorescenssignaler följd neural aktivitet ofta summate i tid på grund sönderfallet av kalcium transienter är lång (flera hundra millisekunder). En avfaltning metod rekonstruerar Spike och spik tidsinställningar från fluorescens signaler.
- För att bestämma den mest sannolika spetsen tåg bakom den inspelade fluorescenssignalen, olika modeller jämförs. Här har vi använt en genetisk algoritm för att bestämma den modell - och därmed spetsen tåg och spik tidpunkter - med maximal sannolikhet.
- I inhomogena populationer av nervceller, kan spetsen-framkallade kalcium signalen variera mellan nervceller. För oövervakad analys av datamängder vi utformat en algoritm som tar hänsyn till variationen i spetsen-framkallade kalcium signal från neuron till neuron.
- För att undvika ett stort antal falska positiva detekteringar är det lämpligt att sammandra den tillåtna amplituden och avklingning tidskonstant av mOdel av spetsen-framkallade kalcium-signal. Gemensam distribution av amplituden och förfall tidskonstant enda spik framkallade kalcium transienter redovisas i en separat uppsättning experiment från samma typ av nervceller under samma experimentella förhållanden med samtidiga elektrofysiologiska och optiska inspelningar.
- Att ta hänsyn till långsamma baslinje förändringar och minska beräkningsmässiga kostnader deconvolving är längre inspelningar delas upp i flera kortare spår av 1-5 sekunder.
- För varje neuron och varje inspelning kan deconvolution algoritmen testa ett stort antal modeller (upp till en miljon olika modeller eller mer). För att påskynda dekonvolution är ett experiment deconvolved på upp till 10 olika datorer parallellt.
- Efter avfaltning är spetsen data analyseras och kontrolleras. En peri-stimulans tid histogram, spika sannolikhet och eldhastighet (genomsnittlig spik per neuroner) beräknas på ett automatiserat sätt.
5.Representativa resultat
Framgångsrika spike detektion hänger på ett högt signal-till-brusförhållandet för de registrerade fluorescens somatiska kalcium signaler. Enkelt att använda hög excitation priser (hög lasereffekt) kan resultera i en negativ påverkan photoeffects på biologiskt material (fotoskada). I gitter random-access scanning fotoskada yttrar sig som minskningar i baslinje fluorescens och minskar i spik-framkallade kalcium fluorescenssignaler. Minskningen i spetsen, framkallade signalen kan snabbt resultera i ett misslyckande att upptäcka spikar. Det finns endast ett mycket litet fönster av excitation intensitet där spik detektion av fluorescenssignaler är hög. På den högre änden detta fönster begränsas av fotoskador, på den nedre änden av fluorescenssignaler har en låg signal-till-brus-förhållande. För kortikala nervceller i akuta skivor använder vi lasereffekt resulterar i fotonen andelen cirka 400,000-1,500,000 foton / s vid inspelning på runt 100 nm under skiva yta. Vid användning av ett högtAffinitet indikator - här Oregon Grön 488 BAPTA - 1 - denna signal är tillräckligt för att upptäcka enskilda spikar. FIG. 3E visar ett exempel på en fluorescenssignal registreras vid mycket låg excitation hastighet, ett exempel på en inspelning i detekteringsfönstret, och en vid mycket hög hastighet excitation.
Jämfört med andra tekniker för att registrera neural aktivitet med encelliga och enda spik upplösning, rastrerade random-access scanning kan spela in från ett större antal neuroner från samma, lokalbefolkningen, och är mindre invasiv exempelvis jämfört med tetrodens / multielectrode inspelningar . Således gitter random-access scanning kan användas för att spela neural aktivitet från många nervceller för att mäta ömsesidig information signaleras av suprathreshold aktivitet 6 (Fig. 4A), förändringar i neural aktivitet i en population av neuroner (kortikal plasticitet), samt spridning av suprathreshold aktivitet genom populationer av nervceller 14 (fig 4B)
Figur 1. Optisk konstruktion gitter-RAM skanning inställningar.
Figur 2 Inriktning och testning:. Fördelningar av fluorescens signaler inspelade under olika förhållanden. A) Ingen laserljus och låg förstärkning fotomultiplikator, B) Vid högre PMT förstärkning, men ingen laserljus, är fördelningen bredare på grund av fotomultiplikatorn mörka strömmen. C) med lasern på och registreras vid hög PMT vinst. En skillnad mellan fördelningarna i visas i B och denna fördelning skulle indikera att exciteringsljus når PMT detektorerna. D) Fördelningen av fluorescenssignaler registrerades vid hög förstärkning från neuron somata. Om ingen annan bullerkälla bidrar uppstår denna fördelning av foton skott-buller bara.
. Jpg "/>
Figur 3 A) Full ram fluorescens bild för att upptäcka och välja neuron somata positioner, B) Scan väg en cykel, C) Illustration av gitter principen,. På varje Soma (cirkel) flera platser registreras innan du flyttar strålen till nästa soma, D) Illustration av utsignalen från två D / A-kanaler. För varje neuron soma är fluorescenssignal registreras från 4 olika ställen i varje soma (S1-S4). Placeringen av varje fläck ges av dess x-och y-position. X-och y positioner för alla fläckar och alla neuroner skickas till digital-till-analog-omvandlare i ett sekventiellt sätt. Medan strålen flyttas mellan två neuroner somata är ingen signal förvärvas (blank). E) Exempel på fluorescenssignaler. Observera att varje exempel visar svar på en spik (uppmätt med elektrofysiologiska cell-bifogad inspelning).
Figur 4. Studera Cortical funktionen med gitter random-access scanning. A) Mätning ömsesidig information signaleras av populationer av nervceller. Övre bilden visar fotomikrograf av en akut hjärna skiva och två pipetter stimulering placerade i samma kortikala kolumn i lager 4 (L4). Center Diagrammen visar neurala svar för varje upprepning av en retning. Nedre diagrammet visar Shannons ömsesidig information signaleras av den inspelade populationen av nervceller. B) Mätning förökning av suprathreshold tillsatta aktivitet (signalutbredning) mellan populationer av kortikala neuroner. Övre diagram visar experimentell design, visar mitt bild fluorescens bild streckade linjerna indikerar fat gränser, visar nedre diagrammet detekterade toppar i respons på elektrisk stimulering av thalamocortical fibrer (trianglar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gitter random-access scanning känner indirekt suprathreshold tillsatta aktivitet från de höjningar av intracellulärt somatisk kalcium i samband med varje spik i en neuron somata. Ökningarna i intracellulärt kalcium detekteras genom fluorescerande kalcium färgämnen. Begränsningarna hos gitter direktminne skanning uppstår huvudsakligen från den begränsade signalen-till-brusförhållandet för signalerna kalcium fluorescens. Signal-till-brus-förhållandet är i sin tur begränsas av fotoskador, som inte tillåter användning av höga exciterings priser. På grund av den begränsade signalen-till-brus-förhållande, misslyckas spike detektering i vissa neuroner och kan även misslyckas för fördröjd och högfrekvent aktivitet. Till exempel när inspelningen in vivo, är spik detektion starkt reducerad för spik priser på 40 Hz och högre 4. Anledningen till minskade spik upptäckt är att sannolikheten skillnaderna för korrekta och felaktiga modeller blir allt mindre för kortare inter-spike intervall. DessutomKan gitter random-access scanning endast användas för populationer av nervceller där somatiska ökar på kalcium är starkt korrelerade med tillsatta aktivitet 7 vilket inte är fallet för alla områden i hjärnan och celltyper (till exempel för granulat celler i grodyngel luktbulben 8 ).
Som ett alternativ till den optiska utformningen har vi använt här en enda prisma kan användas för att kompensera för rumslig och tidsmässig dispersion av AODs istället för två prismor och ett diffraktionsgitter 4,9. Fördelen med en enda prisma design är en högre genomströmning av lasereffekt. Som ett alternativ till den analoga styrningen av frekvensgeneratorer vi har använt här, kan en digital styrschema användas 1,4,10. En analog kontroll är enklare att implementera, men det är också mer benägna att elektriskt brus snedvridningar. Elektriska störningar kan påverka strålens ställning och resultat i högre buller av de registrerade signalerna kalcium fluorescens och därmed minska spike försämInsatser effektivitet. En digital kontroll system, å andra sidan, kan bli föremål för digitalisering artefakter.
Flera algoritmer har föreslagits för dekonvolution av spikar från fluorescenssignaler. Dessa inkluderar en mall som matchar algoritm, en "peeling" algoritmen 4, sekventiell Monte Carlo metoder 11, en maximal sannolikhet metod 3 och andra 12. Endast ett fåtal av dessa metoder står för skillnaderna i spike framkallade kalcium signaler i inhomogena populationer. Vår algoritm står för skillnader i spetsen-framkallade kalcium signalamplitud mellan nervceller. Det kan således användas för att deconvolve stora datamängder från inhomogena populationer av nervceller i ett automatiserat och oövervakad sätt.
In vivo inspelningar med optisk spik detektion är begränsade till nervceller i ytliga lager. Dessutom in vivo inspelningar inför den extra svårigheten rörelse artefakter som uppstår från huvud movements i fritt rörliga djur och hjärtrytm i sövda eller immobiliserade djur. Dessa rörelseartefakter kan enkelt förhindra spik upptäckt eftersom även små rörelser kommer att resultera i fluorescens förändringar som överstiger de framkallade av tillsatta aktivitet. Möjliga lösningar inkluderar översampling och rörelse korrigeringar metoder.
De senaste åren har sett en snabb utveckling av den teknik och de analysmetoder som optiskt upptäcka suprathreshold neural aktivitet. Framtida tekniska förbättringar kan ytterligare öka användbarheten av gitter RAM-skanning genom att öka duty cycle. Både spik upptäckt effektivitet samt antalet registrerade neuroner dra nytta av en hög intermittens. Genetiskt kodade kalcium indikatorer kan eliminera bolus färgning av nervceller eller tillåta färgning och inspelning från specifika subpopulationer av neuroner. Men för närvarande de lägre fluorescens förändringar av genetiskt kodade kalcium indikatorer görinte tillåta tillförlitlig detektering av enstaka spikar 13. Slutligen skulle en realtid ersättning för rörelseartefakter tillåta inspelningar i Vakna och beter djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Randy Chitwood för kritiskt läsa manuskriptet. Detta arbete stöddes av Whitehall stiftelsen och Alfred P. Sloan Foundation för att HJK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optical components are listed in order, starting from the laser | |||
| Titan:Sapphire Laser | Coherent Inc. | Chameleon Ultra 2 | High power output recommended (>2W at 900 nm) |
| Achromatic lens f = 30 mm | Thor labs | AC254-030-B | Anti-reflection (AR) coating for 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 75 mm | Thor labs | LA1608-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 175 mm | Thor labs | LA1229-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 300 mm | Thor labs | AC254-300-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Acousto-optical deflectors | Intraaction Corp | ATD 6510CD2 | |
| Reflective diffraction grating | Newport | 53-011R | 100 grooves/mm for AODs with 65 MHz bandwidth and scan angle of 45 mrad |
| 21.6 mm Brewster prisms | Lambda Research Optics Inc. | IBP21.6SF10 | |
| Colored Glass | Schott | BG-39 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp | Z532RDC | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu | H9305-03 | |
| DAC-ADC board | National Instruments | PCI-6115 | |
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O-6807 | |
References
- Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy. J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73 (1990).
- Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision. J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).
- Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex. J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb. J. Physiol. 582, 163-175 (2007).
- Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. R. Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors for two-dimensional scanning with a single prism. Opt. Lett. 31, 1091-1093 (2006).
- Otsu, Y., Bormuth, V., Wong, J., Mathieu, B. Optical monitoring of neuronal activity at high frame rate with a digital random-access multiphoton (RAMP) microscope. J. Neurosci. Methods. 173, 259-270 (2008).
- Vogelstein, J. T., Watson, B. O., Packer, A. M., Yuste, R. Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods. Biophys. J. 97, 636-655 (2009).
- Yaksi, E., Friedrich, R. W. Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging. Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).
- Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).
- Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex. Front Neural Circuits. 5, 8 (2011).
