Summary
Forstå funksjonen av virveldyr sentralnervesystemet trenger opptak fra mange neuroner fordi kortikal funksjon oppstår på nivået av populasjoner av nerveceller. Her beskriver vi en optisk metode for å registrere suprathreshold nevrale aktiviteten med encellede og single-spike oppløsning, rastrert tilfeldig tilgang skanning. Denne metoden registrerer somatiske fluorescens kalsium signaler fra opptil 100 nevroner med høy tidsoppløsning. Maksimalt-likelihood algoritme deconvolves den underliggende suprathreshold nevrale aktiviteten fra de somatiske fluorescens kalsium signaler. Denne metoden registrerer pålitelig pigger med høy deteksjon virkningsgrad og lav hastighet på falske positiver og kan brukes til å studere nevrale populasjoner
Abstract
Signaliserer informasjon i virveldyr sentrale nervesystemet er ofte båret av populasjoner av nerveceller i stedet for individuelle nerveceller. Også spredning av suprathreshold skyter aktivitet innebærer bestander av nerveceller. Empiriske studier adressering kortikal funksjon direkte dermed kreve opptak fra populasjoner av nerveceller med høy oppløsning. Her beskriver vi en optisk metode og et dekonvolusjon algoritme for å registrere nevrale aktiviteten fra opp til 100 nevroner med encellede og single-spike oppløsning. Denne metoden er avhengig av påvisning av forbigående økninger i intracellulær somatisk kalsiumkonsentrasjon forbundet med suprathreshold elektriske spikes (aksjonspotensialer) i kortikale nevroner. Høy tidsoppløsning av de optiske opptak oppnås ved en rask tilfeldig tilgang skanning teknikken med Akusto optiske deflektorer (AODs) 1. To-foton eksitasjon av kalsium-følsom dye resulterer i høy romlig oppløsning i ugjennomsiktig hjernen tissaksøke 2. Rekonstruksjon av pigger fra fluorescens kalsium opptak oppnås ved en maksimum-likelihood metoden. Samtidige elektrofysiologiske og optiske innspillinger indikerer at vår metode pålitelig registrerer spisser (> 97% topp deteksjon effektivitet), har en lav hastighet på falske positive spike deteksjon (<0,003 pigger / s), og en høy tidsmessig presisjon (ca 3 ms) 3. Denne optisk metode til nålen deteksjon kan brukes til å registrere nevrale aktivitet in vitro og i bedøvede dyr in vivo 3,4.
Protocol
1. Optisk oppsett (figur 1)
- For to-foton eksitasjon en infrarød pulset laser-system med femtosecond pulser brukes. En høy laser utgangseffekt (i noen tilfeller> 2W ved 890 nm bølgelengde) er nødvendig for å oppveie de store tap introdusert av de optiske komponentene i systemet.
- En prechirper system bestående av to prismer formidler et negativ gruppehastighet dispersjon (GVD) bort på laserpulser forut for de akusto-optiske deflektorer (AODs) for å kompensere for den temporale dispersjon introdusert av AODs 1.
- To AODs med store åpninger (10 mm for en 40x vann nedsenking objektiv med NA 0,8) avlede laserstrålen i to dimensjoner.
- En reflekterende diffraksjonsgitter med 100 lunder / mm er plassert 13 cm bak AODs å kompensere den romlige dispersjon introdusert av AODs ved bruk korte laserpulser.
- Laserstrålen er rettet med to relé teleskoper i kameraporten av en oppreist microscope.
- Iris er plassert med jevne mellomrom for innretting av de optiske komponentene.
- En dikroisk beamsplitter foran målet overfører infrarødt magnetisering lys til prøven og reflekterer fluorescens lyset fra prøven på en detektor.
- Epi-og transfluorescence detektorer (fotomultiplikatorer, PMTs) samle fluorescens signal gjennom objektiv og - eventuelt - gjennom kondensatoren.
- Farget glassfiltre (BG-39, 3-5 mm) er plassert i fronten av detektorene for å hindre lys som når eksitasjon detektorene.
- AOD nedbøyning vinkler styres av en datamaskin utstyrt med en digital-analog-konverter bord (156,25 kHz klokke rate), som i sin tur driver spennings-kontrollerte oscillatorer.
- Signalet fra fotomultiplikatorer er videresendt gjennom en lav-pass Butterworth filter (cut-off frekvens av 100 kHz) og digitalisert av en analog-digital-konverter (156,25 kHz klokke rate) før de lagres ien datamaskin for analyse.
- Innretting og elektrisk støy blir testet ved å registrere fordelingen av fluorescence signaler med og uten laserlys, ved lav og høy gevinst av fotomultiplikatorer, samt med og uten indikator. Skanneren er oppsettet riktig og skjermet når bredden av fordelingen av de fluorescens-signaler ved høy forsterkning og med indikatoren er mye større enn bredden på de andre fordelinger av fluorescence signaler (fig. 2).
2. Eksperimentelle prosedyrer
- Utjamna tilfeldig tilgang skanning avhengig påvisning av intracellulære økninger i kalsium. Et stort antall av neuroner, kan farges ved hjelp av bolusinjeksjon av esteren form av en kalsium-indikator (f.eks Oregon Grønn 488 Bapta-1 AM) inn nervevev 5.
- Flere steder fra hvert neuron soma blir registrert, hver for en kort tid ("utjamning", 4 steder, 6,4 mS for hvert sted = 25,6 mS opptakstid for each nevron i hver syklus, fig. 3C). Slik velger nevroner av interesse full ramme som består av 256x256 piksler er ervervet (Fig. 3A). Midten av hver Nevron soma skal registreres velges manuelt innen dette bildet. Styreprogramvaren legger automatisk tre poeng på to mikrometer avstand rundt dette senteret.
- I hver syklus blir fluorescens-signalet registreres fra hvert av de 40 nevroner (fig. 3B). Denne prosessen gjentas for hele varigheten av et opptak (5 andre opptak = 3255 sykluser, en syklus = 1,536 ms).
3. Online programvare verktøy for å maksimere pigg deteksjon effektivitet
- Spike påvisning fra fluoressens somatiske kalsium signaler er avhengig av en høyt signal-til-støy (S / N) forholdet av de somatiske fluorescens kalsium signaler. En høyt S / N kan oppnås ved å øke eksitasjon intensitet. Eksitasjon intensitet, kan imidlertid bare økes til en viss grense på grunn av photodamage. Spike deteksjon er høy innenfor et svært lite window av eksitasjon intensiteter bare der fluorescens signaler har en høy S / N, men bare svært lite photodamage er observert tre. For å sikre at de registrerte signaler er innenfor vinduet av høy spike deteksjon under opptak overvåker vi foton hastighet (se likning 3.2) og nedgang av baseline fluorescens bruker elektronisk analyse.
- Omtrentlig foton per nevron er beregnet ut fra en kort tidsvindu (100-200 ms) av baseline støy. Antall fotoner (N λ) og foton sats (λ = N λ / DT) er beregnet ut fra verdiene fluorescens ved å montere fordelingen (σ) av relative fluorescensen forandringer med følgende ligning:
Denne ligningen representerer poisson-distribusjon for foton skutt støy med en endring av variabel til relativ fluorescens endring: Af / F = (G * N λ (t)-G * N & lamBDA,, 0) / G * N λ, 0 hvor G betegner akkumulert gevinst av photomultiplier og alle andre elektroniske komponenter. Merk at denne ligningen ikke kan fastslå antall detekterte fotoner for in vivo innspillinger fordi det er andre støykilder (bevegelse artefakter), i tillegg til foton skudd støy. Likevel denne ligningen er nyttig for in vivo opptak å beregne støy.
- Baseline fluorescens beregnes fra samme tidsvinduet og plottet som en funksjon av tid eller forsøk. Gjennomsnittlig nedgang på baseline holdes under 0,0002 / s ved å justere laser makt fordi pigg deteksjon raskt avtar når overstiger denne grensen.
- Hver 10-20 min nervecellen somata posisjoner er verifisert av igjen å anskaffe en fullformat bilde. Hvis det er nødvendig, er opptak steder justert. Steder kan justeres for alle neurons på en gang, eller for individuelle nerveceller.
4. Reconstruction av pigg timings fra fluorescens signaler (dekonvolusjon)
- De fluorescens signaler som følge av nevral aktivitet ofte summate i tid fordi forfallet av kalsium transienter er lang (flere hundre millisekunder). En dekonvolusjon rekonstruerer pigg og spike timing fra fluorescens signaler.
- Å bestemme den mest sannsynlige pigg tog underliggende innspilt fluorescens signal, er ulike modeller sammenlignes. Her har vi brukt en genetisk algoritme for å bestemme modellen - og dermed pigg tog og pigg timings - med maksimal sannsynlighet.
- I inhomogene populasjoner av nerveceller kan spike-fremkalt kalsium signal variere mellom nerveceller. For unsupervised analyse av datasett har vi designet en algoritme som tar hensyn til variasjonen av spike-fremkalt kalsium signal fra nervecelle til nervecelle.
- Å unngå et stort antall falske positive deteksjoner er det nyttig å constrict tillatte amplitude og desintegrasjonstid konstant av model av spike-fremkalt kalsium signal. Den felles distribusjonen av amplituden og desintegrasjonstid konstant av single-pigg fremkalt kalsium transienter blir registrert i en separat sett av eksperimenter fra samme type nevroner under samme eksperimentelle betingelser med samtidige elektrofysiologiske og optiske innspillinger.
- Å ta hensyn til langsomme baseline endringer og for å redusere beregningsorientert kostnader deconvolving, lengre opptak deles inn i flere kortere spor av 1-5 sekunder.
- For hver neuron og hvert opptak, kan dekonvolusjon algoritmen teste et stort antall modeller (opptil 1.000.000 forskjellige modeller eller mer). Å fremskynde dekonvolusjon, er ett eksperiment deconvolved på opptil 10 forskjellige datamaskiner i parallell.
- Etter dekonvolusjon, blir piggen dataene analysert og inspisert. En peri-stimulans tid histogrammet spike sannsynlighet, og avfyring hastighet (middeltall pigg pr nevroner) beregnes på en automatisert måte.
5.Representant Resultater
Vellykkede spike deteksjon hengsler på et høyt signal-til-støy-forhold på de innspilte fluorescence somatiske kalsium signaler. Bare ved hjelp av høy magnetisering priser (høy laser makt) kan resultere i en negativ innvirkning på photoeffects på biologisk materiale (photodamage). I utjamna tilfeldig tilgang skanning photodamage manifesterer som reduksjon i baseline fluorescens og avtar av spike-fremkalt kalsium fluorescens signaler. Nedgangen i spike-fremkalt signal kan raskt resultere i en manglende evne til å oppdage toppene. Det er bare en svært liten vindu av eksitasjon intensitet hvor pigg deteksjon fra fluorescens signaler er høy. Den høyere enden dette vinduet er begrenset av photodamage, på den nedre enden fluorescens signaler har et lavt signal-støy-forhold. For kortikale nevroner i akutte skiver bruker vi laser som resulterer i foton priser på rundt 400,000-1,500,000 foton / s ved opptak på rundt 100 mikrometer under skive overflaten. Ved bruk av en høyAffinitet indikator - her Oregon Grønn 488 BAPTA - 1 - dette signalet er tilstrekkelig til å oppdage enkelte toppene. Fig. 3E viser et eksempel på en fluorescens signalet innspilt ved meget lave eksitasjon rate, ett eksempel på et opptak i registreringsområdet vinduet, og en på meget høy magnetisering rate.
Sammenlignet med andre teknikker for å registrere nevrale aktiviteten med encellede og single-spike oppløsning, rastrert tilfeldig tilgang skanning kan ta opp fra et større antall nerveceller fra samme, lokalbefolkningen, og er mindre inngripende for eksempel i forhold til tetrode / multielectrode opptak . Dermed utjamna tilfeldig tilgang skanning kan brukes til å registrere nevrale aktiviteten fra mange nerveceller til å måle gjensidig informasjon signalisert av suprathreshold aktivitet 6 (Fig. 4A), endringer i nevrale aktiviteten i en populasjon av nevroner (kortikal plastisitet), og utbredelsen av suprathreshold aktivitet gjennom bestander av nevroner 14 (fig. 4b)
Figur 1. Optisk design av utjamna-random access scanning oppsett.
Figur 2 Justering og testing:. Distribusjoner av fluorescens signaler registrert under ulike forhold. A) Ingen laserlys og lav fotomultiplikator gevinst, B) Ved høyere PMT vinning, men ingen laserlys, er fordelingen bredere på grunn av fotomultiplikator mørk strøm. C) Med laser på og registrert ved høy PMT gevinst. En forskjell mellom fordelingene i vist i B, og denne fordeling ville indikere at eksitasjon lys når PMT detektorer. D) Fordelingen av fluorescens signaler bokført til høy gevinst fra nervecelle somata. Hvis ingen andre støykilde bidrar, oppstår denne fordelingen fra foton shot-noise bare.
. Jpg "/>
Figur 3 A) Full ramme fluorescens bildet for å oppdage og velge Nevron somata posisjoner, B) Scan banen en syklus, C) Illustrasjon av utjamning prinsippet;. I hver Soma (sirkel) flere steder er registrert før du flytter strålen til neste soma, D) Illustrasjon av utgangssignalet fra de to D / A-kanaler. For hver neuron soma, er fluorescens signal registreres fra 4 forskjellige steder i hver soma (s1-s4). Plasseringen av hver spot er gitt ved hjelp av x-og y-posisjon. X-og y posisjoner for alle flekker og alle neurons sendes til digital-til-analog-omformer i en sekvensiell måte. Mens strålen flyttes mellom to nevroner somata, ingen signal ervervet (blank). E) Eksempler på fluorescens signaler. Merk at hvert av eksemplene viser respons på en pigg (målt med elektrofysiologisk celle-tilkoblede opptak).
Figur 4. Studerer Cortical funksjon med utjamna tilfeldig tilgang skanning. A) Måling gjensidig informasjon signalisert av populasjoner av nerveceller. Øvre bilde viser mikrofotografi av en akutt hjerne stykke og to stimulering pipetter er plassert i samme kolonne i kortikalt lag 4 (L4). Senter grafene viser nevrale responser for hver repetisjon av en stimulus. Lavere Grafen viser Shannon gjensidig informasjon signalisert ved innspilt befolkningen i nerveceller. B) måle spredning av suprathreshold skyter aktivitet (signal forplantning) mellom bestander av kortikale nevroner. Øvre grafen illustrerer eksperimentell design, viser senterlydbilde fluorescens bilde, stiplede linjer indikerer fat grenser, viser lavere graf oppdagede spikes respons til elektrisk stimulering av thalamocortical fibre (trekanter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utjamna tilfeldig tilgang skanning oppdager indirekte suprathreshold skyter aktivitet fra økninger i intracellulært somatisk kalsium knyttet til hver topp i et nevron somata. Økningene i intracellulær kalsium oppdages av fluorescerende kalsium fargestoffer. Begrensningene ved rastrert tilfeldig tilgang skanning oppstå i hovedsak fra den begrensede signal-til-støy-forhold av kalsium fluorescence signaler. Signal-til-støy-forhold er i sin tur er begrenset av photodamage, som ikke tillater bruk av høye eksitasjon priser. På grunn av den begrensede signal-til-støy-forhold, mislykkes spike detektering under enkelte nevroner og kan også svikte for vedvarende og høyfrekvente aktivitet. For eksempel, når opptak i vivo, er pigg deteksjon sterkt redusert for pigg priser på 40 Hz og høyere 4. Grunnen for redusert pigg påvisning er at sannsynligheten forskjeller for riktige og feil modellene blir stadig mindre for kortere inter-spike intervaller. VidereKan utjamna tilfeldig tilgang skanning bare brukes til populasjoner av nerveceller der somatiske øker i kalsium er høyt korrelert med spiking aktivitet 7 som ikke er tilfelle for alle områder av hjernen og celletyper (for eksempel for granule celler i rumpetroll luktelappen 8 ).
Som et alternativ til den optiske utformingen har vi brukt her et enkelt prisme kan brukes til å kompensere for romlig og tidsmessig dispersjon av AODs istedenfor to prismer og et diffraksjonsgitter 4,9. Fordelen med et enkelt prisme design er en høyere gjennomstrømning av laser makt. Som et alternativ til den analoge styring av frekvensressursene generatorer vi har brukt her, kan en digital kontroll ordningen brukes 1,4,10. En analog kontroll er enklere å implementere, men det er også mer utsatt for elektrisk støy forvrengninger. Elektrisk støy kan påvirke strålens stilling og resultat i høyere støy av de registrerte kalsium fluorescens signaler, og dermed redusere pigg DeteDette skjer effektivitet. En digital kontroll ordningen, på den annen side, kan være gjenstand for digitalisering artefakter.
Flere algoritmer har blitt foreslått for dekonvolusjon av pigger fra fluorescens signaler. Disse inkluderer en mal matchende algoritme, en "peeling" algoritmen 4, sekvensiell Monte Carlo 11 metoder, maksimum-likelihood metode 3, og andre 12. Bare få av disse metodene står for forskjellene i pigg-fremkalt kalsium signaler i inhomogene populasjoner. Våre algoritmen står for forskjeller i spike-fremkalt kalsium signalamplitude mellom nerveceller. Det kan således brukes til å deconvolve store datasett fra inhomogene populasjoner av nevroner i en automatisert og ukontrollert måte.
In vivo-opptak ved hjelp av optiske pigg deteksjon er begrenset til nevroner i overfladiske lag. Videre in vivo-opptak møte ytterligere problemer for bevegelse gjenstander som oppstår fra hodet movements i fritt bevegelige dyr og hjerterytme i bedøvede eller immobilisert dyr. Disse bevegelsene gjenstander kan enkelt hindre pigg deteksjon fordi selv små bevegelser vil resultere i fluorescens endringer som overstiger de fremkalt ved å tilsette aktivitet. Potensielle løsninger omfatter oversampling og bevegelse korreksjoner metoder.
De siste årene har sett en rivende utvikling av teknologien og de analytiske metoder for å optisk oppdage suprathreshold nevrale aktiviteten. Fremtidige teknologiske forbedringer kan ytterligere øke nytten av utjamna tilfeldig tilgang skanning ved å øke driftssyklus. Både pigg deteksjon effektivitet samt antall registrerte nevroner får høy driftssyklus. Genetisk kodet kalsium indikatorer kan eliminere bolus farging av nevroner eller tillate flekker og opptak fra bestemte subpopulasjoner av nerveceller. Foreløpig imidlertid de lavere fluorescens endringene av genetisk kodet kalsium indikatoreneIkke la pålitelig deteksjon av single pigger 13. Til slutt ville en real-time kompensasjon for bevegelsesartefakter tillate opptak i våken og oppfører dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Randy Chitwood for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Whitehall Foundation og Alfred P. Sloan Foundation tilskudd til HJK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optical components are listed in order, starting from the laser | |||
| Titan:Sapphire Laser | Coherent Inc. | Chameleon Ultra 2 | High power output recommended (>2W at 900 nm) |
| Achromatic lens f = 30 mm | Thor labs | AC254-030-B | Anti-reflection (AR) coating for 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 75 mm | Thor labs | LA1608-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 175 mm | Thor labs | LA1229-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 300 mm | Thor labs | AC254-300-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Acousto-optical deflectors | Intraaction Corp | ATD 6510CD2 | |
| Reflective diffraction grating | Newport | 53-011R | 100 grooves/mm for AODs with 65 MHz bandwidth and scan angle of 45 mrad |
| 21.6 mm Brewster prisms | Lambda Research Optics Inc. | IBP21.6SF10 | |
| Colored Glass | Schott | BG-39 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp | Z532RDC | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu | H9305-03 | |
| DAC-ADC board | National Instruments | PCI-6115 | |
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O-6807 | |
References
- Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy. J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73 (1990).
- Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision. J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).
- Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex. J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb. J. Physiol. 582, 163-175 (2007).
- Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. R. Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors for two-dimensional scanning with a single prism. Opt. Lett. 31, 1091-1093 (2006).
- Otsu, Y., Bormuth, V., Wong, J., Mathieu, B. Optical monitoring of neuronal activity at high frame rate with a digital random-access multiphoton (RAMP) microscope. J. Neurosci. Methods. 173, 259-270 (2008).
- Vogelstein, J. T., Watson, B. O., Packer, A. M., Yuste, R. Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods. Biophys. J. 97, 636-655 (2009).
- Yaksi, E., Friedrich, R. W. Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging. Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).
- Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).
- Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex. Front Neural Circuits. 5, 8 (2011).
