Summary
Inzicht in de functie van de gewervelde centrale zenuwstelsel heeft opnames van vele neuronen omdat corticale functie ontstaat op het niveau van populaties van neuronen. Hier hebben we een optische methode om suprathreshold neurale activiteit op te nemen met single-cell en single-spike resolutie te beschrijven, dithered random-access scanning. Deze methode neemt somatische fluorescentie calcium signalen van tot 100 neuronen met een hoge temporele resolutie. Een maximum-likelihood-algoritme deconvolves de onderliggende suprathreshold neurale activiteit van de somatische fluorescentie calcium signalen. Deze methode detecteert betrouwbaar spikes met een hoge detectie-efficiëntie en een laag aantal valse meldingen en kan worden gebruikt om neurale populaties te bestuderen
Abstract
Signalering van informatie in de gewervelde centrale zenuwstelsel wordt vaak gedragen door populaties van neuronen in plaats van individuele neuronen. Ook de verspreiding van suprathreshold spiking activiteit betrekking populaties van neuronen. Empirische studies over corticale functie direct vereist dus opnamen van populaties van neuronen met een hoge resolutie. Hier beschrijven we een optische methode en deconvolutie algoritme neurale activiteit opnemen tot 100 neuronen met single-cell en single-spike resolutie. Deze methode berust op detectie van de tijdelijke toename in intracellulaire calciumconcentratie somatische verbonden suprathreshold elektrische pieken (actiepotentialen) in corticale neuronen. Hoge tijdsresolutie van het optische opname wordt bereikt door een snelle willekeurige toegang scantechniek gebruik acousto-optische deflectoren (gedelegeerd ordonnateur) 1. Twee-fotonexcitatie van de calcium-gevoelige kleurstof resulteert in hoge ruimtelijke resolutie in ondoorzichtige hersenen tisaanklagen 2. Reconstructie van spikes van de fluorescentie calcium opnamen wordt bereikt door een maximum-likelihood methode. Gelijktijdig elektrofysiologische en optische opnamen geven aan dat onze methode betrouwbaar spikes (> 97% spike detectie-efficiëntie) detecteert, heeft een laag aantal valse positieve spike detectie (<0,003 spikes / s) en een hoge temporele precisie (ongeveer 3 ms) 3. Deze optische methode spike detectie kan worden gebruikt om neurale activiteit opnemen in vitro en in vivo in dieren verdoofd 3,4.
Protocol
1. Optische opstelling (figuur 1)
- Voor twee-fotonexcitatie een infrarood laser gepulst systeem femtoseconde pulsen gebruikt. Een hoge laser uitgangsvermogen (soms> 2W bij 890 nm golflengte) nodig om de grote verliezen die door de optische componenten van het systeem te compenseren.
- Een prechirper bestaande uit twee prisma zorgt voor een negatieve groep snelheidsdispersie (GVD) op de laserpulsen voor de acousto-optische deflectoren (gedelegeerd ordonnateur) ter compensatie van de temporele dispersie die door de gedelegeerd ordonnateur 1.
- Twee gedelegeerd ordonnateur met grote openingen (10 mm voor een 40x water immersie objectief met NA 0,8) buigen de laserstraal in twee dimensies.
- Een reflecterende diffractierooster met 100 bosjes / mm geplaatst van 13 cm achter de gedelegeerd ordonnateur van de ruimtelijke spreiding geïntroduceerd door gedelegeerd ordonnateur compenseren bij gebruik van korte laserpulsen.
- De laserstraal wordt gericht met twee relais telescopen in de camera-poort van een rechtopstaande microscope.
- Irissen worden geplaatst op regelmatige tijdstippen voor het uitlijnen van de optische componenten.
- Een dichroïsche bundelsplitser voor het doel zendt het infrarood excitatielicht met het model en weerspiegelt de fluorescentie van het monster op een detector.
- Epi-en transfluorescence detectoren (fotomultiplicatoren, PMT's) te verzamelen fluorescentie-signaal door de objectieve en - indien van toepassing - door de condensor.
- Gekleurd glas filters (BG-39, 3-5 mm) worden geplaatst voor de detectoren aan excitatielicht voorkomen bereiken van de detectoren.
- De AOD afbuighoeken gestuurd door een computer uitgerust met een digitaal-analoog-converter board (156,25 kHz kloksnelheid), dat op zijn beurt spanningsgestuurde oscillatoren.
- Het signaal van de fotomultiplicatoren wordt doorgegeven via een laagdoorlaatfilter Butterworth filter (cut-off frequentie van 100 kHz) en gedigitaliseerd door een analoog-digitaal-omzetter (156,25 kHz kloksnelheid) voordat deze wordt opgeslagen ineen computer voor analyse.
- Uitlijning en elektrische ruis getest door registratie van de verdeling van fluorescentiesignalen met en zonder laserlicht, bij lage en hoge gain van de fotomultiplicatoren, en met en zonder indicator. De scanner correct is ingesteld en afgeschermd wanneer de breedte van de verdeling van de fluorescentiesignalen bij hoge gain en indicator is veel groter dan de breedte van de andere distributies van fluorescentiesignalen (Fig. 2).
2. Experimentele procedures
- Geditherde random-access scanning is gebaseerd op de detectie van intracellulaire stijging van calcium. Een groot aantal neuronen kan worden gekleurd met bolus injectie van de ester vorm van een calcium indicator (bijvoorbeeld Oregon Green 488 Bapta AM-1) in zenuwweefsel 5.
- Verschillende locaties van elk neuron soma opgenomen, elk voor een korte tijd ("dithering", 4 plaatsen, 6,4 microseconden voor elke locatie = 25,6 us opnametijd voor each neuron in elke cyclus, Fig. 3C). Om neuronen plaats selecteren full frame bestaande uit 256x256 pixels wordt verkregen (Fig. 3A). Het midden van elke neuron soma worden geregistreerd handmatig gekozen binnen het beeld. De controle software voegt automatisch drie punten bij 2 micrometer afstand rond dit centrum.
- In elke cyclus wordt de fluorescentie signaal dat van elk van de 40 neuronen (Fig. 3B). Dit proces wordt herhaald voor de gehele duur van een opname (5 tweede registratie = 3,255 cycli, 1 cyclus = 1,536 ms).
3. Online software tools om spike detectie-efficiëntie te maximaliseren
- Spike detectie van fluorescentie somatische calcium signalen berust op een hoge signaal-ruisverhouding (S / N) verhouding van de somatische fluorescentie calcium signalen. Een hoge S / N kan worden bereikt door excitatie-intensiteit. Excitatie-intensiteit kan echter alleen worden verhoogd tot een bepaalde limiet door zonbeschadigde. Spike detectie is hoog in een zeer kleine Window excitatie intensiteiten wanneer fluorescentiesignalen een hoge S / N, maar slechts weinig zonbeschadigde waargenomen 3. Om ervoor te zorgen dat de geregistreerde signalen binnen het raam van hoge piek detectie tijdens opnames we controleren foton rate (zie vergelijking 3.2) en een afname van de basislijn fluorescentie met behulp van online analyse.
- Geschatte foton rate per neuron wordt berekend uit een korte tijdspanne (100-200 ms) van basislijnruis. Aantal fotonen (N λ) en foton rate (λ = N λ / At) wordt berekend uit de fluorescentiewaarden door het aanbrengen van de verdeling (σ) van relatieve fluorescentie verandert met de volgende vergelijking:
Deze vergelijking geeft de Poissonverdeling voor foton opname ruis met een verandering van variabele relatieve fluorescentie change: AF / F = (G * N λ (t)-N * G & lamBDA,, 0) / G * N λ, 0 waarbij G staat voor de cumulatieve winst van fotomultiplicator en alle andere elektronische componenten. Merk op dat deze vergelijking niet correct het aantal gedetecteerde fotonen in vivo opnames bepalen omdat er andere geluidsbronnen (bewegingsartefacten) naast foton schot ruis. Echter deze vergelijking is bruikbaar voor in vivo opnames de ruisschatting.
- Baseline fluorescentie na diezelfde tijdvenster en uitgezet als functie van tijd of trials. De gemiddelde daling van de uitgangswaarde wordt gehouden onder 0,0002 / s door het aanpassen van laservermogen omdat spike detectie snel daalt bij het overschrijden van deze limiet.
- Elke 10-20 min het neuron somata posities zijn gecontroleerd door opnieuw het verwerven van een full frame beeld. Indien nodig, worden de opname locaties aangepast. Locaties kunnen worden aangepast voor alle neuronen in een keer, of voor individuele neuronen.
4. Reconstruction van de spike timing van fluorescentie signalen (deconvolutie)
- De fluorescentiesignalen gevolg van neurale activiteit vaak summate in tijd omdat het verval van de calcium transiënten lang is (enkele honderden milliseconden). Een deconvolutie methode reconstrueert spike en spike timing van fluorescentie signalen.
- Om de meest waarschijnlijke spike trein ten grondslag liggen aan het opgenomen fluorescentie signaal te bepalen, zijn verschillende modellen vergeleken. Hier gebruikten we een genetische algoritme om het model te bepalen - en daarmee de trein en spike spike timings - de maximum likelihood.
- In inhomogene populaties van neuronen, kan de spike-opgeroepen calcium signaal variëren tussen neuronen. Voor clustering analyse van gegevens die we gemaakt van een algoritme dat rekening houdt met de variatie van de spike-opgewekte signaal van calcium neuron tot neuron.
- Om te voorkomen een groot aantal vals positieve detectie is het nuttig vernauwen het toegestane amplitude en verval tijdsconstante van de model van de spike-opgeroepen calcium signaal. De gezamenlijke verdeling van de amplitude en verval tijdsconstante van single-spike opgewekte calcium transiënten worden in een aparte reeks experimenten uit hetzelfde type van neuronen onder dezelfde proefomstandigheden simultaan elektrofysiologische en optische opnamen.
- Om rekening te houden langzame basislijn wijzigingen en om computationele kosten van deconvolving te verminderen, zijn langere opnames onderverdeeld in verschillende kortere sporen van 1-5 seconden.
- Voor elke neuron en elke opname kan de deconvolutie algoritme testen een groot aantal modellen (tot 1.000.000 of meer verschillende modellen). Om het tempo van deconvolutie, is een experiment deconvolved op maximaal 10 verschillende computers in parallel.
- Na deconvolutie, wordt de piek data geanalyseerd en gecontroleerd. Een peri-stimulus time histogram, spike waarschijnlijkheid, en vuursnelheid (gemiddelde piek per neuronen) worden berekend op een geautomatiseerde manier.
5.Representatieve resultaten
Spike succesvolle detectie berust op een hoge signaal-ruisverhouding van de opgenomen fluorescentie somatische calcium signalen. Gewoon met behulp van hoge excitatie tarieven (hoog laservermogen) kan leiden tot een negatief effect van photoeffects op biologisch materiaal (zonbeschadigde). In geditherde random-access scanning zonbeschadigde manifesteert zich als afname van de uitgangswaarde fluorescentie en vermindert van de spike-opgeroepen calcium fluorescentie signalen. De daling in de spike opgewekte signaal kan snel leiden tot niet spikes detecteren. Er is slechts een zeer klein venster van de excitatie-intensiteit waar spike detectie van fluorescentie signalen is hoog. Op het hogere eind dit venster wordt beperkt door zonbeschadigde op het ondereinde van de fluorescentiesignalen een laag signaal-ruisverhouding. Voor corticale neuronen in acute plakjes gebruiken we laservermogen resulteert in foton tarieven van ongeveer 400,000-1,500,000 foton / s bij het opnemen van ongeveer 100 micrometer hieronder plak oppervlak. Bij gebruik van een-Affiniteit indicator - hier Oregon Green 488 BAPTA - 1 - dit signaal voldoende is om individuele pieken te detecteren. Fig. 3E toont een voorbeeld van een fluorescentiesignaal opgeslagen bij zeer lage excitatie komt een voorbeeld van een opname in het detectievenster, en een zeer hoge excitatie rate.
Vergeleken met andere technieken om neurale activiteit nemen met single-cell en enkele piek resolutie, geditherd random-access scanning kan opnemen van een groter aantal neuronen uit dezelfde bevolking, en is minder invasief bijvoorbeeld in vergelijking met tetrode / multielectrode opnames . Zo geditherde random-access scanning kan worden gebruikt om neurale activiteit opnemen van vele neuronen wederzijdse informatie gesignaleerd suprathreshold activiteit 6 (Fig. 4A), veranderingen van neurale activiteit in een populatie neuronen (corticale plasticiteit) meten en propagatie van suprathreshold activiteit door populaties van neuronen 14 (Fig. 4B)
Figuur 1. Optische ontwerp van de geditherde-random access scanning setup.
Figuur 2 Uitlijning en testen:. Distributies van fluorescentie signalen die worden opgenomen onder verschillende omstandigheden. A) No laserlicht en laag photomultiplier gain, B) bij hogere gain PMT, maar laserlicht, de verdeling breder is door de fotomultiplicator donkerstroom. C) Met de laser op en opgenomen bij hoge PMT winst. Een verschil tussen de verdelingen in getoond in B en deze verdeling zou blijken dat excitatielicht bereikt PMT detectoren. D) De verdeling van fluorescentie signalen opgenomen met hoge versterking van neuron somata. Als er geen andere geluidsbron draagt, deze verdeling komt voort uit foton shot-noise alleen.
. Jpg "/>
Figuur 3 A) Schermvullend fluorescentie beeld op te sporen en te selecteren neuron somata posities, B) Scan pad van een cyclus, C) Illustratie van de dithering principe;. Per soma (cirkel) diverse locaties zijn opgenomen voordat u de balk naar de volgende soma, D) Illustratie van de output van de twee D / A kanalen. Voor elke neuron soma wordt opgenomen fluorescentiesignaal van 4 verschillende plaatsen in elke soma (S1-S4). De locatie van elke spot wordt bepaald door de x en y-positie. De x-en y posities voor alle vlekken en alle neuronen worden verzonden naar de digitaal-analoog omzetter op een sequentiële wijze. Terwijl de bundel wordt bewogen tussen twee neuron somata, wordt geen signaal verkregen (blanco). E) Voorbeelden van fluorescentiesignalen. Merk op dat elk voorbeeld verband met een spike toont (zoals gemeten met elektrofysiologische cell-ingeschreven opname).
Figuur 4. Studeren Cortical functie met behulp van geditherde random-access scanning. A) Het meten van wederzijdse informatie gesignaleerd door populaties van neuronen. Bovenste beeld toont microfoto van een acuut hersenletsel slice en twee pipetten stimulatie in dezelfde kolom in corticale laag 4 (L4). Center grafieken tonen neurale antwoorden voor elke herhaling van een stimulus. Onderste grafiek toont wederzijdse informatie Shannon's gesignaleerd door de geregistreerde bevolking van neuronen. B) het meten voortplanting van suprathreshold spiking activiteit (signaalvoortplanting) tussen populaties van corticale neuronen. Bovenste grafiek toont proefopzet middenbeeld fluorescentie beeld toont, stippellijnen vat grenzen aangeven onderste grafiek toont gedetecteerd spikes in antwoord op elektrische stimulatie van thalamocorticale vezels (driehoeken).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geditherde random-access scanning detecteert indirect suprathreshold spiking activiteit van de stijging van de intracellulaire calcium somatische die bij elke piek in een neuron somata. De toename in intracellulaire calcium gedetecteerd door fluorescente kleurstoffen calcium. De beperkingen van geditherde random-access scanning zijn grotendeels uit de beperkte signaal-ruisverhouding van het calcium fluorescentiesignalen. De signaal-ruisverhouding weer beperkt door zonbeschadigde, waarvan geen gebruik van hoge excitatie rates. Vanwege de beperkte signaal-ruisverhouding, piek detectie niet in sommige neuronen en kan ook niet voor aanhoudende en hoogfrequente activiteit. Bijvoorbeeld bij opname in vivo, spike detectie sterk verminderd spike prijzen bij 40 Hz en hoger 4. De reden voor verminderde spike detectie is dat de kans op verschillen voor juist en onjuist modellen steeds kleiner voor kortere inter-spike intervallen. Bovendien, Geditherde random-access scanning kan alleen worden gebruikt voor populaties van neuronen waar somatische verhoogt in calcium sterk gecorreleerd met gepulst activiteit 7 dat niet het geval is voor alle hersengebieden en celtypes (bijvoorbeeld voor granule cellen in het kikkervisje reukkwab 8 ).
Als alternatief voor het optische ontwerp hebben we hier gebruik gemaakt van een prisma kan worden gebruikt ter compensatie van ruimtelijke en temporele spreiding van de gedelegeerd ordonnateur plaats van twee prisma's en een diffraktieraster 4,9. Het voordeel van een prisma uitvoering is een grotere doorstroming van het laservermogen. Als alternatief voor de analoge besturing van de frequentiegeneratoren we hier gebruikt kan een digitale besturing worden 1,4,10. Een analoge regeling eenvoudiger te implementeren, maar het is ook gevoelig voor elektrische ruis verstoringen. Elektrische ruis van invloed kunnen zijn straalpositie en leiden tot hogere geluid van de opgenomen calcium fluorescentie signalen, waardoor de spike verslechteringctie efficiëntie. Een digitale besturing, anderzijds, kunnen worden onderworpen aan digitalisering artefacten.
Verschillende algoritmes voorgesteld voor deconvolutie van spikes van fluorescentiesignalen. Deze omvatten een sjabloon matching algoritme, een "peeling" algoritme 4, sequentiële Monte-Carlo methoden 11, een maximum-likelihood methode 3, en anderen 12. Slechts enkele van deze methoden verklaren van de verschillen in spike opgewekte signalen calcium in inhomogene populaties. Ons algoritme is goed voor de verschillen in de piek-opgeroepen calcium amplitude tussen neuronen. Derhalve kan worden gebruikt om grote hoeveelheden gegevens Deconvolutie van inhomogene populaties van neuronen in een geautomatiseerde wijze en zonder toezicht.
In-vivo opnamen met optische detectie spike beperkt tot neuronen in oppervlakkige lagen. Bovendien, in-vivo-opnamen te maken van de extra moeilijkheid van bewegingsartefacten die voortvloeien uit het hoofd movements in vrij bewegende dieren en hartslag in verdoofde of geïmmobiliseerd dieren. Deze beweging artefacten kunnen eenvoudig voorkomen spike detectie, omdat zelfs kleine bewegingen zal resulteren in fluorescentie verandert dat die opgeroepen worden door spiking activiteit overschrijden. Mogelijke oplossingen zijn onder meer oversampling en beweging correcties methoden.
De laatste paar jaren is er een snelle ontwikkeling van de technologie en de analytische methoden om optisch detecteren suprathreshold neurale activiteit. Toekomstige technologische verbeteringen kan de bruikbaarheid van geditherde random-access scanning verder verhogen door de duty cycle. Beide spike detectie-efficiëntie en het aantal geregistreerde neuronen profiteren van een hoge duty cycle. Genetisch gecodeerd calcium indicatoren kunnen elimineren de bolus kleuring van neuronen en laat vlekken en opnemen van specifieke subpopulaties van neuronen. Op dit moment, echter, de lagere fluorescentie verandert van genetisch gecodeerde calcium indicatoren doenniet toe dat betrouwbare detectie van enkele spikes 13. Ten slotte zou een real-time compensatie voor bewegingsartefacten maken opnamen in wakker en gedragen dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken dr. Randy Chitwood voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Whitehall Foundation en de Alfred P. Sloan Foundation subsidies aan HJK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optical components are listed in order, starting from the laser | |||
| Titan:Sapphire Laser | Coherent Inc. | Chameleon Ultra 2 | High power output recommended (>2W at 900 nm) |
| Achromatic lens f = 30 mm | Thor labs | AC254-030-B | Anti-reflection (AR) coating for 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 75 mm | Thor labs | LA1608-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 175 mm | Thor labs | LA1229-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 300 mm | Thor labs | AC254-300-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Acousto-optical deflectors | Intraaction Corp | ATD 6510CD2 | |
| Reflective diffraction grating | Newport | 53-011R | 100 grooves/mm for AODs with 65 MHz bandwidth and scan angle of 45 mrad |
| 21.6 mm Brewster prisms | Lambda Research Optics Inc. | IBP21.6SF10 | |
| Colored Glass | Schott | BG-39 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp | Z532RDC | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu | H9305-03 | |
| DAC-ADC board | National Instruments | PCI-6115 | |
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O-6807 | |
References
- Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy. J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73 (1990).
- Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision. J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).
- Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex. J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb. J. Physiol. 582, 163-175 (2007).
- Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. R. Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors for two-dimensional scanning with a single prism. Opt. Lett. 31, 1091-1093 (2006).
- Otsu, Y., Bormuth, V., Wong, J., Mathieu, B. Optical monitoring of neuronal activity at high frame rate with a digital random-access multiphoton (RAMP) microscope. J. Neurosci. Methods. 173, 259-270 (2008).
- Vogelstein, J. T., Watson, B. O., Packer, A. M., Yuste, R. Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods. Biophys. J. 97, 636-655 (2009).
- Yaksi, E., Friedrich, R. W. Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging. Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).
- Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).
- Ranganathan, G. N., Koester, H. J. Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex. Front Neural Circuits. 5, 8 (2011).
