Summary
La comprensión de la función del sistema nervioso central de vertebrados requiere grabaciones de muchas neuronas porque la función cortical surge en el nivel de las poblaciones de neuronas. Aquí se describe un método óptico para registrar la actividad neuronal con suprathreshold resolución unicelular y único punta-, vaciló al azar escaneado en acceso. Este método graba somáticas fluorescencia señales de calcio de hasta 100 neuronas con alta resolución temporal. Un algoritmo de máxima probabilidad deconvolves la actividad neural subyacente suprathreshold partir de las señales de fluorescencia de calcio somáticas. Este método detecta de forma fiable con los picos de alta eficiencia de detección y una baja tasa de falsos positivos y se puede utilizar para estudiar las poblaciones neuronales
Abstract
Señalización de información en el sistema nervioso central de vertebrados se realiza a menudo por las poblaciones de neuronas en vez de las neuronas individuales. También propagación de la actividad suprathreshold spiking implica poblaciones de neuronas. Los estudios empíricos que abordan directamente la función cortical por lo tanto requieren las grabaciones de las poblaciones de neuronas con alta resolución. Aquí se describe un método óptico y un algoritmo de deconvolución para registrar la actividad neuronal de hasta 100 neuronas con resolución unicelular y único punta-. Este método se basa en la detección de los aumentos transitorios en la concentración intracelular de calcio somático asociado con picos suprathreshold eléctricas (potenciales de acción) en las neuronas corticales. Alta resolución temporal de las grabaciones ópticas se consigue mediante una técnica de escaneo rápido de acceso aleatorio utilizando deflectores acústico-ópticos (ordenadores delegados) 1. Excitación de dos fotones de los resultados sensible al calcio de tinte en una alta resolución espacial en tis cerebrales opacosdemandar 2. Reconstrucción de los picos de las grabaciones de fluorescencia de calcio se consigue mediante un método de máxima probabilidad. Simultáneas registros electrofisiológicos y óptica indican que nuestro método detecta de forma fiable espigas (> 97% de eficiencia de detección de pico), tiene una baja tasa de detección de falsos positivos espiga (<0,003 espigas / s), y una alta precisión temporal (aproximadamente 3 ms) 3. Este método óptico de detección de pico puede utilizarse para registrar la actividad neuronal in vitro y en animales anestesiados in vivo 3,4.
Protocol
1. Configuración óptica (Figura 1)
- Para dos fotones de excitación un sistema de infrarrojos láser pulsado con pulsos de femtosegundos se utiliza. Un láser de potencia de salida alta (en algunos casos> 2W en longitud de onda nm 890) es necesaria para compensar las grandes pérdidas introducidas por los componentes ópticos del sistema.
- Un sistema prechirper que consta de dos prismas imparte una dispersión grupo velocidad negativa (EVI) en los pulsos de láser antes de los deflectores acústico-ópticos (ordenadores delegados) para compensar la dispersión temporal introducida por el ordenadores delegados 1.
- Dos ordenadores delegados con aberturas grandes (10 mm para un objetivo de inmersión en agua 40x con NA 0,8) desviar el haz de láser en dos dimensiones.
- Una red de difracción reflexivo con 100 huertos / mm se coloca 13 cm por detrás de los ordenadores delegados para compensar la dispersión espacial introducida por los ordenadores delegados al usar pulsos cortos de láser.
- El rayo láser se dirige con dos telescopios de relé en el puerto de la cámara de un montante microscope.
- Iris están colocados a intervalos regulares para la alineación de los componentes ópticos.
- Un divisor de haz dicroico en frente del objetivo transmite la luz de excitación infrarroja para la muestra y refleja la luz de fluorescencia de la muestra a un detector.
- Detectores de Epi-y transfluorescence (fotomultiplicadores, PMT) recoger la señal de fluorescencia a través del objetivo y - en su caso - a través del condensador.
- Filtros de vidrio de color (BG-39, 3-5 mm) se colocan delante de los detectores para evitar que la luz de excitación alcanzar los detectores.
- Los ángulos de deflexión de AOD están controlados por un ordenador equipado con una tarjeta digital-analógico convertidor (156,25 kHz frecuencia de reloj), que a su vez acciona tensión osciladores controlados.
- La señal de los fotomultiplicadores se retransmite a través de un filtro de paso bajo Butterworth (frecuencia de corte de 100 kHz) y digitalizada por un convertidor analógico-digital converter (156,25 tasa de reloj kHz) antes de ser almacenado enun ordenador para su análisis.
- La alineación y el ruido eléctrico se prueban mediante el registro de la distribución de las señales de fluorescencia con y sin luz láser, en ganancia baja y alta de los fotomultiplicadores, así como con y sin indicador. El escáner está correctamente configurado y protegido cuando la anchura de la distribución de las señales de fluorescencia en ganancia alta y con indicador es mucho más grande que las anchuras de las otras distribuciones de señales de fluorescencia (Fig. 2).
2. Los procedimientos experimentales
- Dithered azar escaneado en acceso se basa en la detección de los aumentos intracelulares de calcio. Un gran número de neuronas se pueden teñir utilizando inyección en bolo de la forma de éster de un indicador de calcio (por ejemplo Oregon Green 488 Bapta-1 AM) en el tejido neural 5.
- Varios lugares de cada soma neuronal se registran, cada uno por un corto tiempo ("dithering", 4 lugares, 6,4 ms para cada ubicación = 25,6 ms de tiempo de grabación para el correoACH neurona en cada ciclo, la fig. 3C). Para seleccionar las neuronas de interés un marco completo que consta de 256x256 píxeles se adquiere (Fig. 3A). El centro de cada soma neuronal a grabar se selecciona manualmente dentro de esta imagen. El software de control añade tres puntos a una distancia de 2 m alrededor de este centro.
- En cada ciclo, la señal de fluorescencia se registra a partir de cada una de las 40 neuronas (Fig. 3B). Este proceso se repite para toda la duración de una grabación (5 segundos de grabación = 3255 ciclos, 1 ciclo = 1,536 ms).
3. Las herramientas en línea de software para maximizar la eficiencia de detección de pico
- Detección de pico de las señales de fluorescencia de calcio somáticas se basa en una alta relación señal-ruido (S / N) de las señales de calcio somáticas de fluorescencia. Una alta relación S / N se puede lograr mediante el aumento de la intensidad de excitación. Intensidad de excitación, sin embargo, sólo se puede aumentar hasta un cierto límite, porque de fotodaño. Detección Spike es alta dentro de una windo muy pequeñow de las intensidades de excitación sólo cuando las señales de fluorescencia tienen una alta relación S / N, pero sólo muy poco daño solar es observado 3. Con el fin de garantizar que las señales grabadas están dentro de la ventana de detección de pico de alta durante grabaciones que controlar la frecuencia de fotones (véase la ecuación 3,2) y disminución del nivel de referencia de fluorescencia utilizando el análisis en línea.
- Tasa de fotón aproximado por neurona se calcula a partir de una ventana de tiempo corto (100-200 ms) de ruido de línea base. Tasa de número de fotones (N λ) y el fotón (λ = λ N / Dt) se calcula a partir de los valores de fluorescencia mediante el ajuste de la distribución (σ) de los cambios relativos de fluorescencia con la siguiente ecuación:
Esta ecuación representa la distribución de Poisson para el ruido de disparo fotón con un cambio de variable con el cambio de fluorescencia relativa: Df / F = (G * N λ (t)-G * N + lambda, 0,) / G * N λ, 0 donde G denota la ganancia acumulada del fotomultiplicador y todos los componentes electrónicos. Tenga en cuenta que esta ecuación no determina correctamente el número de fotones detectados para grabaciones en vivo porque hay otras fuentes de ruido (artefactos de movimiento), además de ruido de disparo fotón. Sin embargo, esta ecuación es útil para grabaciones en vivo para estimar el ruido.
- De fluorescencia base se calcula a partir de la misma ventana de tiempo y se representa como una función del tiempo o ensayos. El descenso medio de línea de base se mantiene por debajo de 0,0002 / s mediante el ajuste de la potencia del láser ya que la detección pico disminuye rápidamente cuando se excede este límite.
- Cada 10-20 minutos las posiciones somas neuronales son verificados por la adquisición de nuevo una imagen a pantalla completa. Si es necesario, las ubicaciones de grabación son ajustados. Las localizaciones pueden ser ajustados para todas las neuronas a la vez, o para las neuronas individuales.
4. Reconstruction de horarios pico de las señales de fluorescencia (deconvolución)
- Las señales de fluorescencia resultantes de la actividad neural a menudo summate en el tiempo debido a la descomposición de los transitorios de calcio es largo (varios cientos de milisegundos). Un método de deconvolución reconstruye horarios pico y pico de las señales de fluorescencia.
- Para determinar el tren pico más probable que subyace a la señal de fluorescencia registrada, diferentes modelos se comparan. Aquí hemos utilizado un algoritmo genético para determinar el modelo - y por tanto el tren de pico y tiempos de punta - con la máxima verosimilitud.
- En las poblaciones no homogéneas de las neuronas, la espiga-evocado señal de calcio puede variar entre las neuronas. Para el análisis no supervisado de los conjuntos de datos que hemos diseñado un algoritmo que tiene en cuenta la variación de la señal de calcio espiga-evocada de una neurona a otra.
- Para evitar un gran número de detecciones de falsos positivos es útil para constreñir la amplitud permitida y el tiempo constante de desintegración del modelo de la señal de calcio punta-evocado. La distribución conjunta de la amplitud y el tiempo constante de desintegración de un solo pico transitorios de calcio evocadas se registran en un conjunto separado de experimentos del mismo tipo de neuronas en las mismas condiciones experimentales usando simultáneas registros electrofisiológicos y óptica.
- Para dar cuenta de los cambios lentos de referencia y reducir los costes computacionales de deconvolving, grabaciones más largas se dividen en varios trazos cortos de 1-5 segundos.
- Para cada neurona y cada grabación, el algoritmo de deconvolución puede probar un gran número de modelos (de hasta un millón de diferentes modelos o más). Para acelerar la deconvolución, un experimento se deconvolved en hasta 10 equipos diferentes en paralelo.
- Después de la deconvolución, la espiga de datos se analiza y se inspeccionó. Un histograma de tiempo de peri-estímulo, la probabilidad de espiga, y la tasa de disparo (media espiga por las neuronas) se calculan de una manera automatizada.
5.Los resultados representativos
El éxito de espiga bisagras de detección en una alta relación señal a ruido de las señales de fluorescencia grabadas calcio somáticas. Simplemente usando altas tasas de excitación (láser de alta potencia) puede resultar en un impacto adverso de photoeffects en material biológico (fotoenvejecimiento). En fotodaño interpolado de exploración de acceso aleatorio se manifiesta como una disminución en la fluorescencia basal y disminuye las señales de calcio punta-evocados fluorescencia. La disminución en la señal de pico-evocó rápidamente puede resultar en una falta de detección de picos. Sólo hay una ventana muy pequeña de la intensidad de excitación en la detección de pico de las señales de fluorescencia es alta. En el extremo superior esta ventana está limitada por fotodaño, en el extremo inferior de las señales de fluorescencia tienen una baja relación señal-ruido. Para neuronas corticales en rodajas agudas usamos la potencia del láser se traduce en tasas de fotones de unos 400,000-1,500,000 fotones / s cuando se graba a unos 100 m por debajo de la superficie de corte. Cuando se usa un alto-Afinidad indicador - aquí Oregon Green 488 BAPTA - 1 - Esta señal es suficiente para detectar picos individuales. La figura. 3E muestra un ejemplo de una señal de fluorescencia de excitación grabar a una velocidad muy baja, un ejemplo de una grabación dentro de la ventana de detección, y uno a la tasa de excitación muy alta.
En comparación con otras técnicas para registrar la actividad neuronal en la resolución de una sola célula y de un solo pico, interpolado de acceso aleatorio exploración puede grabar de un mayor número de neuronas de la misma población, local, y es menos invasiva, por ejemplo, en comparación con las grabaciones tetrodo / multielectrode . Así interpolado de acceso aleatorio escaneado se puede utilizar para registrar la actividad neural de muchas neuronas para medir la información mutua señalado por la actividad supra-6 (Fig. 4A), los cambios de actividad neural en una población de neuronas (plasticidad cortical), y la propagación de la actividad suprathreshold a través de poblaciones de neuronas 14 (Fig. 4B)
Figura 1. Diseño óptico de la configuración de acceso aleatorio interpolado-exploración.
Figura 2 Alineación y pruebas:. Distribuciones de señales de fluorescencia grabadas en diferentes condiciones. A) No hay luz láser y la ganancia del fotomultiplicador bajo, B) En PMT ganancia más alta, pero no la luz láser, la distribución es más amplia debido a la actual fotomultiplicador oscuro. C) Con el láser y grabado en alta ganancia PMT. Una diferencia entre las distribuciones se muestran en B y distribución, esto indicaría que la luz de excitación llega a los detectores PMT. D) La distribución de las señales de fluorescencia grabado en alta ganancia de neurona somata. Si no hay ninguna otra fuente de ruido contribuye, esta distribución surge de fotón único disparo-ruido.
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Figura 3 A) Imagen de marco completo de fluorescencia para detectar y seleccionar las posiciones de neuronas Somata, B) trayectoria de exploración de un ciclo, C) Ilustración del principio tramado;. En cada Soma (círculo) varios lugares se registran antes de mover el haz hacia la siguiente soma, D) Ilustración de la salida del convertidor D / dos canales A. Para cada soma neuronal, la señal de fluorescencia se registraron desde 4 puntos diferentes en cada soma (S1-S4). La ubicación de cada punto viene dada por su posición x e y. El posiciones x e y para todos los puntos y las neuronas se envían todos al convertidor digital a analógico de una manera secuencial. Mientras que el haz se mueve entre dos cuerpos celulares de neuronas, la señal no ha adquirido (en blanco). E) Los ejemplos de señales de fluorescencia. Tenga en cuenta que cada ejemplo se muestra la respuesta a una espiga (según se mide con electrofisiológico celular conectado a la grabación).
Figura 4. Estudiar cortifunción de cal usando tramado aleatorio escaneado en acceso. A) Medición de la información mutua señalado por poblaciones de neuronas. La imagen superior muestra una fotomicrografía de cortes de cerebro agudo y dos pipetas de estimulación situados en la misma columna cortical en la capa 4 (L4). Centro gráficos muestran respuestas neuronales para cada repetición de un estímulo. Gráfico inferior muestra la información mutua de Shannon señalado por la población registrada de neuronas. B) Medición de propagación de la actividad suprathreshold enriquecimiento (propagación de la señal) entre las poblaciones de neuronas corticales. Gráfico superior ilustra el diseño experimental, la imagen del centro muestra la imagen de fluorescencia, las líneas punteadas indican las fronteras barril, gráfico inferior muestra picos detectados en respuesta a la estimulación eléctrica de las fibras talamocorticales (triángulos).
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Discussion
Dithered azar escaneado en acceso indirecto detecta actividad suprathreshold adición de los incrementos en el calcio intracelular somático asociado con cada aumento en una somata neurona. Los incrementos en el calcio intracelular se detecta por los colorantes de calcio fluorescentes. Las limitaciones de interpolado de acceso aleatorio escaneado surgen en gran medida de la de la limitada señal-a-ruido de las señales de fluorescencia de calcio. La relación de señal-a-ruido es a su vez limitada por fotodaño, que no permite utilizar altas tasas de excitación. Debido a la limitada señal-a-ruido, la detección de pico de falla en algunas neuronas y también puede fallar por actividad sostenida y de alta frecuencia. Por ejemplo, cuando la grabación en vivo, la detección de pico se reduce fuertemente para las tasas de pico a 40 Hz y superior 4. La razón para la detección de pico reducida es que las diferencias de probabilidad para modelos correctas e incorrectas cada vez más pequeñas para cortos intervalos inter-espiga. Además, Interpolado de acceso aleatorio exploración sólo puede ser utilizado para las poblaciones de neuronas donde somática incrementos en el calcio están muy correlacionados con spiking 7 actividad que no es el caso para todas las áreas del cerebro y tipos celulares (por ejemplo, para las células granulares en el bulbo olfatorio renacuajo 8 ).
Como una alternativa al diseño óptico hemos utilizado aquí un solo prisma se puede utilizar para compensar la dispersión espacial y temporal de los ordenadores delegados en lugar de prismas dos y una rejilla de difracción 4,9. La ventaja de un diseño de prisma solo es un mayor rendimiento de potencia del láser. Como una alternativa al control analógico de los generadores de frecuencia que hemos utilizado aquí, un esquema de control digital se puede utilizar 1,4,10. Un control analógico es sencillo de implementar, pero también es más propensa a distorsiones de ruido eléctrico. El ruido eléctrico puede afectar a la posición del haz y en consecuencia un mayor ruido de las señales de fluorescencia grabadas de calcio, reduciendo así la espiga detección eficiencia. Un sistema de control digital, por otra parte, pueden estar sujetos a artefactos de digitalización.
Varios algoritmos han sido propuestos para la deconvolución de los picos de las señales de fluorescencia. Estos incluyen un algoritmo de plantilla a juego, un "peeling" algoritmo 4, secuencial Monte-Carlo métodos 11, un método de probabilidad máxima 3, y otros 12. Sólo unos pocos de estos métodos explicar las diferencias en punta-evocados señales de calcio en las poblaciones no homogéneas. Nuestras cuentas algoritmo de las diferencias en la amplitud de la señal de calcio punta-evocado entre las neuronas. Por lo tanto, puede utilizarse para deconvolucionar grandes conjuntos de datos a partir de poblaciones homogéneas de neuronas en una forma automatizada y sin supervisión.
In vivo de grabaciones utilizando detección óptica espiga se limita a las neuronas en las capas superficiales. Además, in vivo grabaciones frente a la dificultad adicional de los artefactos de movimiento que surgen de la cabeza movENTOS con libertad de movimientos en los animales y los latidos del corazón en animales anestesiados o inmovilizados. Estos artefactos de movimiento puede impedir fácilmente la detección de pico de porque incluso los pequeños movimientos dará lugar a cambios de fluorescencia que exceden los evocados por spiking actividad. Soluciones potenciales incluyen correcciones sobremuestreo y el movimiento métodos.
Los últimos años han visto un rápido desarrollo de la tecnología y los métodos de análisis para detectar ópticamente la actividad suprathreshold neural. Las futuras mejoras tecnológicas pueden aumentar aún más la utilidad de interpolado de acceso aleatorio escaneo mediante el aumento del ciclo de trabajo. Tanto la eficiencia de detección de pico, así como el número de neuronas registrada beneficiarse de un ciclo de trabajo alto. Genéticamente codificados indicadores de calcio puede eliminar la tinción bolo de neuronas o permitir la tinción y el registro de subpoblaciones específicas de neuronas. Actualmente, sin embargo, los cambios más bajos de fluorescencia de calcio indicadores codificados genéticamente hacerno permitir la detección fiable de los picos individuales 13. Por último, una compensación en tiempo real para los artefactos de movimiento permitiría a las grabaciones en animales despiertos y de comportarse.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Randy Chitwood para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Whitehall y la Alfred P. Sloan Foundation otorga a HJK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optical components are listed in order, starting from the laser | |||
| Titan:Sapphire Laser | Coherent Inc. | Chameleon Ultra 2 | High power output recommended (>2W at 900 nm) |
| Achromatic lens f = 30 mm | Thor labs | AC254-030-B | Anti-reflection (AR) coating for 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 75 mm | Thor labs | LA1608-B | AR 650-1050 nm |
| lens f = 175 mm | Thor labs | LA1229-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 300 mm | Thor labs | AC254-300-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Achromatic lens f = 100 mm | Thor labs | AC254-100-B | AR 650-1050 nm |
| Acousto-optical deflectors | Intraaction Corp | ATD 6510CD2 | |
| Reflective diffraction grating | Newport | 53-011R | 100 grooves/mm for AODs with 65 MHz bandwidth and scan angle of 45 mrad |
| 21.6 mm Brewster prisms | Lambda Research Optics Inc. | IBP21.6SF10 | |
| Colored Glass | Schott | BG-39 | |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp | Z532RDC | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu | H9305-03 | |
| DAC-ADC board | National Instruments | PCI-6115 | |
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O-6807 | |
References
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