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Neuroscience

कार्यात्मक न्यूरोइमेजिंग अल्ट्रासोनिक रक्त मस्तिष्क बाधा विघटन और मैंगनीज बढ़ाकर एमआरआई का उपयोग

Published: July 12, 2012 doi: 10.3791/4055
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2
1Department of Radiology, Stanford University, 2Center for In Vivo Microscopy, Duke University Medical Center, 3Department of Biomedical Engineering, Duke University

Summary

एक तकनीक में microbubbles और अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर माउस में मोटे तौर पर रक्त मस्तिष्क बाधा को खोलने के लिए वर्णित है. इस तकनीक का उपयोग करना, मैंगनीज माउस मस्तिष्क के लिए प्रशासित किया जा सकता है. क्योंकि मैंगनीज एक एमआरआई इसके विपरीत एजेंट है कि depolarized न्यूरॉन्स में जम जाता है, इस दृष्टिकोण neuronal गतिविधि के इमेजिंग में सक्षम बनाता है.

Protocol

1. इकट्ठा और अल्ट्रासाउंड सिस्टम जांचना

  1. अल्ट्रासाउंड सिस्टम एक एकल तत्व पर्याप्त चौड़ा करने के लिए माउस और 2 मेगाहर्ट्ज की रेंज में एक केंद्र आवृत्ति मस्तिष्क को कवर व्यास के साथ अल्ट्रासाउंड transducer के साथ शुरू होता है. transducer एक प्रवर्धक 50 डीबी बिजली, जो एक संकेत जनरेटर कि अल्ट्रासाउंड पल्स अनुक्रम का उत्पादन करने के लिए जुड़ा हुआ है के द्वारा संचालित है.
  2. अल्ट्रासाउंड प्रणाली के ध्वनिक दबाव जांचना, हाइड्रोफ़ोन उपयोग के परिणामी ध्वनिक दबाव के लिए लागू वोल्टेज से संबंधित है. हाइड्रोफ़ोन पर एक पानी की टंकी में transducer रखें. Transducer का एक साधारण पल्स (जैसे, नाड़ी 10 हर्ट्ज की पुनरावृत्ति आवृत्ति के साथ एक 10 चक्र है transducer आवृत्ति पर sinusoid) लागू होते हैं. अनुवाद 3 अक्ष चरण शिखर प्रतिक्रिया है, जो ट्रांसड्यूसर की प्राकृतिक ध्यान केंद्रित (हमारे 13 मिमी व्यास 2.15 मेगाहर्ट्ज transducer के लिए लगभग 60 मिमी) में अल्ट्रासाउंड बीम के केंद्र में होना चाहिए.
  3. पर एक बजाई कई माप करेंइनपुट voltages के ई (उदाहरण के लिए, 50-400 mV पीपी) प्रणाली की linearity को सत्यापित करने के लिए. एक सरल रेखीय प्रतिगमन का उपयोग करने के लिए इनपुट वोल्टेज और ध्वनिक दबाव के बीच संबंध का अनुमान है. हमारी प्रणाली में, 258 और 167 mV पीपी के इनपुट voltages 0.52 और 0.36 MPa के शिखर नकारात्मक ध्वनिक दबाव के लिए corresponded.
  4. संकेत जनरेटर कार्यक्रम के लिए एक अल्ट्रासाउंड नाड़ी फट प्रति 50,000 चक्र और 64 एमएस की एक फट अवधि के साथ transducer आवृत्ति में sinusoidal दालों के फटने से मिलकर अनुक्रम उत्पादन. अंशांकन माप के आधार पर, स्पंद आयाम स्थापित करने के लिए पीक नकारात्मक ध्वनिक दबाव transducer का प्राकृतिक ध्यान के केंद्र में 0.36 MPa की.

2. अभिकर्मकों तैयार

  1. 100 (300 mOsM) मिमी और फिल्टर बाँझ की एकाग्रता में मैंगनीज क्लोराइड tetrahydrate (MnCl 2 · 4H हे 2) बाँझ पानी में भंग.
  2. "Activatin द्वारा perflutren लिपिड microspheres के उत्पादनजी "प्रयोगों की एक दिन के लिए 45 है के लिए निर्माता की आपूर्ति आंदोलनकारी. शीशी, एक ही शीशी दिन की शुरुआत में एक बार सक्रिय कर सकते हैं और दिन के आराम के लिए पुनर्सक्रियन के बिना इस्तेमाल किया.
  3. तुरंत microsphere प्रशासन से पहले, हाथ से 1 microspheres resuspend मिनट के लिए शीशी आंदोलन. जब शीशी से microbubbles वापस लेने, शीशी में कमरे में हवा नहीं इंजेक्षन नहीं है, के रूप में इस शेष microbubbles degrades है. शीशी छोड़ दो दिन के अंतिम उपयोग तक, और फिर यह एक रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत. कई दिनों के इस फैशन में बनाए रखा, एक एकल शीशी पिछले कर सकते हैं. बाद के दिन पर पहले उपयोग करने के लिए पहले आंदोलनकारी में संग्रहीत शीशी, पुन: सक्रिय.

3. पशु तैयारी

  1. Isoflurane साथ पशुओं चतनाशून्य करना, नाक शंकु के द्वारा दिया. नाक शंकु उपकरण हर बार एक ही स्थिति में पशु सिर ठीक है और मज़बूती से ठीक करने के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए. हमारे 15 डिवाइस वीं में सिर रखता हैई "खोपड़ी फ्लैट" (यानी, पृष्ठीय की खोपड़ी सतह क्षैतिज है) स्थिति Paxinos मस्तिष्क एटलस में 16 इस्तेमाल किया. संवेदनाहारी टाइट्रेट 85 और 125 साँस प्रति मिनट के बीच एक सांस की दर को बनाए रखने के लिए. एक गर्मी दीपक या उड़ा हवा का उपयोग कर शरीर के तापमान बनाए रखें. स्नेहक के साथ आंखों की रक्षा करें.
  2. निकालें माउस खोपड़ी से बालों को एक बिजली trimmer का उपयोग.
  3. एक पूंछ नस कैथेटर और intraperitoneal कैथेटर (आईपी) रखें. अस्तित्व के अध्ययन के लिए, के लिए उपयुक्त बाँझ तकनीक का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित हो, आईपी कैथेटर इस लेख के लिए वीडियो में प्रदर्शन प्लेसमेंट गैर अस्तित्व प्रयोगों के लिए ही उपयुक्त है.
  4. किसी अतिरिक्त neuronal उत्तेजना प्रयोग के लिए आवश्यक तैयारी करने के. बैरल क्षेत्र प्रांतस्था की vibrissae उत्तेजना के मानचित्रण के लिए, एक विदारक माइक्रोस्कोप और microsurgical कैंची का उपयोग करने के लिए परेशान कूप या आसपास त्वचा के बिना vibrissae कटौती के रूप में त्वचा की सतह के लिए करीब संभव है.
  5. जगह पर अल्ट्रासाउंड जेलखोपड़ी, और फिर कम पानी स्तंभ सिर पर एक पतली प्लास्टिक शीट (जैसे, एक 7.6 माइक्रोन कचरा बिन लाइनर) द्वारा निहित है. एक कपास इत्तला दे दी झाड़ू के साथ पानी स्तंभ के साथ के माध्यम से बाहर तक पहुँचने के लिए किसी भी हवाई बुलबुले कि अल्ट्रासाउंड जेल में फंस पाने के लिए धक्का. इसकी प्राकृतिक फोकल दूरी (58 मिमी) में सीधे पानी के स्तंभ में माउस मस्तिष्क पर अल्ट्रासाउंड transducer, स्थिति और एक उंगली टिप के साथ transducer पोंछ किसी भी फंस हवाई बुलबुले को दूर.

4. रक्त मस्तिष्क microbubbles और अल्ट्रा ध्वनि (BOMUS) के साथ बैरियर खोलने

  1. 0.5 mmol / किग्रा आईपी की एक खुराक में मैंगनीज समाधान की intraperitoneal इंजेक्शन दे. Intraperitoneal कैथेटर कैप तो मैंगनीज बाहर प्रवाह नहीं करता है और 10 मिनट तक प्रतीक्षा करने के लिए इसे वितरित करने की अनुमति (चित्रा 1).
  2. बीबीबी को खोलने के लिए, perflutren लिपिड microspheres (सक्रिय DEFINITY) की पूंछ नस कैथेटर के माध्यम से 30 μL प्रशासन, और एक साथ, अल्ट्रासाउंड पल्स अनुक्रम आरंभ. सी3 मिनट के लिए insonification जारी रखें.

5. Neuronal उत्तेजना

  1. 2 करोड़ के मस्तिष्क के स्तर के लिए लगभग 40 मिनट की अनुमति दें + neuronal उत्तेजना शुरू होने से पहले स्थिर. इस तरह, नाटकीय 2 करोड़ के लिए आधारभूत कारण वृद्धि BBB भर में प्रसार सूक्ष्म अंतर उत्तेजना के कारण वृद्धि से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. फिर, अपनी पसंद के प्रतिमान (चित्रा 1) के साथ उत्तेजना शुरू करते हैं.
  2. Vibrissae उत्तेजना के लिए, बंद isoflurane बारी और नाक शंकु को हटा दें. एक नरम कलाकार तूलिका मैन्युअल रूप से लगभग त्वचा से 2-5 मिमी की दूरी पर vibrissae सरणी के माध्यम से एक परिपत्र गति (1-5 हर्ट्ज) में ले जाएँ. 90 मिनट के लिए उत्तेजना जारी रखें. मैंगनीज एक शामक प्रभाव है, जो जानवर की अनर्गल उत्तेजना की अनुमति देता है. यदि पशु बेचैन हो जाता है, तो 5% लगभग 15 सेकंड के लिए नाक शंकु के माध्यम से isoflurane प्रशासन.

6. Magnetic अनुनाद इमेजिंग

  1. उत्तेजना के बाद, नाक शंकु के माध्यम से संज्ञाहरण फिर से शुरू. शरीर के तापमान को बनाए रखने और 85-125 साँस प्रति मिनट की एक सांस की दर लिए isoflurane स्तर titrating जारी रखें.
  2. एक एमआर इमेजिंग कुंडली में माउस प्लेस और एमआरआई प्रणाली को हस्तांतरण. उच्च संकल्प 3 डी 1 भारित एमआर छवियों टी मोल. उदाहरण के लिए, एक 3 डी खराब निम्नलिखित मानकों के साथ गूंज अनुक्रम (SPGR) की चर्चा की ढाल का प्रयोग करें:, 2 एमएस की गूंज समय, 30 डिग्री के कोण फ्लिप, 15.63 kHz के बैंडविड्थ, 25 एमएस की पुनरावृत्ति समय के क्षेत्र 20 के दृश्य × 20 × 12 मिमी, 128 × 60 × 128 मैट्रिक्स.

7. छवि विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण उत्तेजना इस्तेमाल किया प्रतिमान विशिष्ट है. Vibrissae उत्तेजना प्रयोग के लिए (चित्रा 2), कई जानवरों से एक उपयुक्त विश्लेषण वातावरण में छवियाँ आयात. यदि कुछ जानवरों सही पर उत्तेजित थे, जबकि दूसरों को छोड़ दिया, FL पर उत्तेजित थेआईपी ​​इतना कुछ है कि सभी छवियों को प्रभावी ढंग से कर रहे हैं "छोड़ दिया उत्तेजित." फिर, इसके contralateral unstimulated पक्ष के लिए प्रत्येक मस्तिष्क की ओर प्रेरित तुलना करने के लिए, एक दोहराया बनाने और बाएँ unstimulated छवि सेट बनाया है नजर आता है. एक आम अंतरिक्ष के लिए सभी छवियों पंजीकरण और फिर उन्हें एक 3 × 3 × 3 पिक्सेल गाऊसी कर्नेल के साथ चिकनी.
  2. MATLAB के रूप में एक गणितीय विश्लेषण पर्यावरण, डेटा निर्यात. वैकल्पिक रूप से, डेटासेट में मुखौटा अप्रासंगिक शरीर रचना. Venot एट अल की विधि पुनरावृत्ति द्वारा छवियों को तीव्रता सामान्य 17,18.
  3. प्रत्येक मस्तिष्क के unstimulated पक्षों पर इसी contralateral voxel प्रत्येक मस्तिष्क की प्रेरित पक्षों के प्रत्येक voxel की तुलना में एक जोड़ी, टी एकल पूंछ परीक्षण का उपयोग.
  4. परिणामी पी मूल्य अंतर गतिविधि (चित्रा 3) के क्षेत्रों की पहचान नक्शे प्रदर्शित करें.

8. प्रतिनिधि परिणाम

विधि यहाँ प्रस्तुत दो निधि है (1) microbubbles और अल्ट्रासाउंड (BOMUS) के साथ बीबीबी खोलने और (2) सक्रियकरण प्रेरित मैंगनीज बढ़ाकर एमआरआई (AIM एमआरआई): amental कदम क्योंकि उत्तरार्द्ध कदम पूर्व पर निर्भर करता है, यह महत्वपूर्ण है सफल कार्यान्वयन BOMUS सत्यापित.

एक टी 1 छोटा विपरीत एजेंट (जैसे मैंगनीज या एक gadolinium आधारित एजेंट के रूप में) मस्तिष्क पैरेन्काइमा में टी पर एक संकेत वृद्धि हुई है 1 भारित इमेजिंग में परिणाम के प्रशासन के बाद रक्त मस्तिष्क बाधा के विघटन जब दिमाग की तुलना में BOMUS जो में प्रदर्शन नहीं किया गया था (चित्रा 4). इस मैंगनीज वृद्धि का वितरण पूरी तरह से वर्दी नहीं है, हालांकि यह काफी जानवरों के बीच लगातार है. वितरण BBB के उद्घाटन में नहीं inhomogeneity ही दर्शाता है, लेकिन 19 मस्तिष्क के भीतर आंतरिक करोड़ की गैर वर्दी वितरण भी है. BBB के उद्घाटन के स्थानिक और लौकिक गतिशीलता को आगे किया गया है 12 के पहले से वर्णित है.

> ईएनटी "एक बार BOMUS सफलतापूर्वक लागू किया गया है, अगले कदम के लिए AIM एमआरआई प्रदर्शन कई प्रयोगात्मक मानदंड को संभव हो रहे हैं, हालांकि, क्योंकि वहाँ कई संभावित घालमेल कर दिया है, नियंत्रण और विश्लेषण कर रहे हैं ध्यान से डिजाइन किया जाना चाहिए confounding प्रभाव inhomogeneous BBB के उद्घाटन में शामिल हैं, इस प्रदर्शन में, मस्तिष्क करोड़ प्रसार के अस्थायी गतिशीलता, और nonspecific neuronal गतिविधि में करोड़ की inhomogeneous संचय. vibrissae की एकतरफा उत्तेजना के लिए neuronal प्रतिक्रिया मैप. inhomogeneities और करोड़ प्रवाह, मस्तिष्क की unstimulated प्रत्येक पक्ष के लिए खाते एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था के nonspecific neuronal गतिविधि है कि पशुओं के बीच भिन्न हो सकता है के लिए खाते., सांख्यिकीय विश्लेषण परीक्षण इस्तेमाल के लिए क्षेत्रों है कि जानवरों (चित्रा 2) के बीच लगातार अलग थे की पहचान परिणाम एक फर्क तीन आयामी नक्शा और थे. तीन आयामी पी मूल्य (चित्रा 3) मानचित्र, सही पक्ष जो के क्षेत्रों संकेत दियाउच्च प्रेरित vibrissae contralateral संकेत की. नक्शे के बाईं ओर संकेत दिया है जो क्षेत्रों में काफी अधिक उत्तेजित vibrissae ipsilateral संकेत था. नक्शा पी - मूल्य ऊंचा प्रेरित vibrissae जो बैरल क्षेत्र प्राथमिक संवेदी प्रांतस्था, जिसका प्रतिक्रिया उत्तेजना vibrissae बड़े पैमाने पर 20,21 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और 2 deoxyglucose अध्ययन द्वारा प्रलेखित किया गया है के लिए corresponded contralateral संकेत के एक व्यापक क्षेत्र की पहचान की. इन परिणामों की एक अधिक संपूर्ण चर्चा 13 पहले प्रकाशित किया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रोटोकॉल BOMUS और AIM एमआरआई (Howles एट अल से अनुकूलित 13.) के साथ कार्यात्मक न्यूरोइमेजिंग के लिए इस समय.

चित्रा 2
आंकड़ा 2. क्षेत्रों ओ पहचान विश्लेषण के लिए योजनाच प्रत्येक मस्तिष्क उत्तेजित और unstimulated पक्षों के बीच अलग तीव्रता. इसके contralateral unstimulated पक्ष को प्रत्येक मस्तिष्क की ओर प्रेरित तुलना करने के लिए, एक दोहराया और बाएँ unstimulated छवि सेट बनाया है नजर आता है. इन छवियों को दर्ज कर रहे हैं, फ़िल्टर, और normalized. अंत में, परीक्षण पर बाईं उत्तेजित और बाएँ unstimulated छवियों तुलना. टी परीक्षण "बनती" इतना है कि प्रत्येक मस्तिष्क की ओर प्रेरित केवल एक ही मस्तिष्क की unstimulated पक्ष की तुलना में है. टी परीक्षण है तो "एक पूंछ है कि नक्शा पी - मूल्य के एक तरफ मस्तिष्क की ओर प्रेरित काफी अधिक संकेत इंगित करता है, जबकि नक्शे पी के मूल्य के दूसरे पक्ष की ओर unstimulated पर काफी उच्च संकेत इंगित करता है मस्तिष्क (Howles एट अल से अनुकूलित 13.).

चित्रा 3
चित्रा 3 7 पशुओं की दो अलग अलग अक्षीय पदों पर जमा विश्लेषण का परिणाम है. टी वह प्रथम स्तंभ के सभी पंजीकृत गठबंधन छवियों का मतलब पता चलता है, ताकि प्रभावी रूप से सभी चूहों उनके बाएँ vibrissae प्रेरित था. इन छवियों को एक रंग नक्शा contralateral गोलार्द्ध प्रत्येक voxel सापेक्ष संकेत में औसत प्रतिशत वृद्धि का संकेत के साथ मढ़ा जाता है, के रूप में रंग पट्टी द्वारा संकेत दिया. छवि के सही पक्ष पर रंग के क्षेत्रों का पता चलता है जहां उत्तेजना के लिए contralateral गोलार्द्ध उच्च संकेत था. छवि के बाईं ओर पर रंगीन क्षेत्रों का पता चलता है जहां उत्तेजना के लिए ipsilateral गोलार्द्ध उच्च संकेत था. दूसरे स्तंभ पी मूल्य नक्शा संकेत में वृद्धि के सांख्यिकीय महत्व का संकेत है साथ ही मढ़ा छवियों से पता चलता है. तीसरे स्तंभ एक ही पी मूल्य संवेदी प्रांतस्था छायांकित (Howles एट अल से अनुकूलित 13.) की बैरल क्षेत्रों के साथ Paxinos stereotaxic एटलस से 16 इसी आंकड़े पर मढ़ा नक्शे से पता चलता है.

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चित्रा 4 मस्तिष्क + 2 करोड़ की स्थानिक वितरण. छवियाँ 0.5 mmol / किग्रा आईपी 2 MnCl के बाद से 170 (n = 5) और नियंत्रण (n = 4) चूहों BOMUS इलाज मिनट हासिल किया गया है. सामान्य के बाद मतलब है, और मानक विचलन के नक्शे (बाएं पैनल) गणना की गई. संवर्धन BOMUS इलाज चूहों में अधिक से अधिक था. हालांकि इस वृद्धि के मस्तिष्क में एक समान नहीं था, यह काफी सुसंगत मस्तिष्क और निलय के किनारों के पास छोड़कर था. हित के क्षेत्रों (ROIs) विभिन्न संरचनाओं के चारों ओर खींचा का प्रयोग, मतलब SNR (+ 1 एसडी) प्रत्येक समूह (सही पैनल) भर में गणना की गई. BOMUS इलाज पशुओं को अधिक से अधिक SNR है पता चला है लेकिन यह भी संरचनाओं के बीच और पशुओं के बीच अधिक से अधिक विचरण (Howles एट अल से अनुकूलित 13. है).

चित्रा 5
चित्रा 5 BOMUS के ऊतक प्रभाव की जांच., BOMUS इलाज चूहों से दिमाग तय थे, से500 पर ctioned माइक्रोन अंतराल, और hematoxylin और लाल भामसान रंग के साथ दाग. लाल रक्त कोशिका मस्तिष्क के प्रत्येक अनुभाग में देखा extravasations का मतलब संख्या MPa 0.36 (n = 3), 0.52 (n = 4) MPa, और 5.0 MPa (n = 1) के ध्वनिक दबाव के लिए दिखाया गया है. त्रुटि सलाखों के मानक त्रुटि दिखा. दूसरे पैनल 5.0 MPa (Howles एट अल से अनुकूलित 12. है) को उजागर मस्तिष्क से गंभीर लाल रक्त कोशिका परिस्त्राव का एक उदाहरण से पता चलता है.

चित्रा 6
6 चित्रा मात्रात्मक व्यवहार का परीक्षण करने के लिए संज्ञाहरण से पहले गतिविधि, उत्तेजना, और प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और 3 और संज्ञाहरण से वसूली के बाद 24 घंटे. स्कोरिंग प्रणाली, 12 पहले से वर्णित है, अच्छी तरह से स्थापित मात्रात्मक माउस व्यवहार मूल्यांकन के विकास पर आधारित था22 1968 में इरविन द्वारा एड. औसत व्यवहार नियंत्रण के लिए (± SEM) स्कोर (n = 3) और BOMUS (0.36 MPa) इलाज (n = 8) जानवरों दिखाया गया है. सापेक्ष पूर्व संज्ञाहरण आधारभूत करने के लिए, सभी जानवरों संज्ञाहरण के बाद 3 घंटे के व्यवहार स्कोर में कमी दिखाने के लिए, लेकिन वे अगले दिन से काफी हद तक ठीक है. हर समय बिंदु पर, दो समूहों के बीच कोई अंतर नहीं देखा गया था, यह दर्शाता है कि कुछ हद तक BOMUS पशु व्यवहार (Howles एट अल से अनुकूलित 12.) को प्रभावित नहीं किया.

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Discussion

यहाँ, एक विधि से noninvasively अल्ट्रासाउंड और microbubbles (BOMUS) के साथ पूरे माउस मस्तिष्क भर बीबीबी खोलने के लिए प्रस्तुत किया गया था. BBB के साथ खुला, 2 करोड़ + प्रशासित किया गया था और सक्रियण प्रेरित मैंगनीज बढ़ाकर एमआरआई (AIM एमआरआई) छवि हल्के से बेहोश चूहों में उत्तेजना कम अवधि के लिए neuronal प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया था.

पर्याप्त BBB के उद्घाटन की एक चोटी पर नकारात्मक 0.36 MPa की ध्वनिक दबाव के साथ हासिल की थी. नोट: यह खोपड़ी की सतह पर अल्ट्रासाउंड बीम का केंद्र पर दबाव है. एकल तत्व transducer का बीम प्रोफाइल की माप का संकेत मिलता है कि बीम के किनारे पर ध्वनिक दबाव के बारे में केवल 0.12 MPa है. बाद में, खोपड़ी के माध्यम से क्षीणन एक अनुमान के अनुसार 25% द्वारा मस्तिष्क तक पहुंचने के दबाव को कम कर देता है (चोई एट अल के आधार पर स्थानीय कर से मुक्ति 23. और आवृत्ति के लिए समायोजित). यह इंगित करता है कि BBB के विघटन 0.09 MPa के शिखर नकारात्मक ध्वनिक दबाव हुई (हमारे बीम के केंद्र में है) 0.03 MPa (किनारे पर). इन दबावों के (.4 आम तौर पर 0.5 MPa) स्तर 24 कहीं और की रिपोर्ट की तुलना में कम कर रहे हैं. यह कम दबाव सीमा के लिपिड दूसरों की तुलना में इस कार्य (1.2 लगभग एमएल / किलोग्राम) में इस्तेमाल किया microbubbles की उच्च खुराक के कारण हो सकता है. इस्तेमाल किया microbubbles की खुराक सिफारिश नैदानिक ​​मानव खुराक (10 μL / किग्रा) की तुलना में अधिक था, नकारात्मक प्रभाव नहीं मनाया गया.

यहाँ के रूप में निर्दिष्ट, BOMUS तकनीक noninvasive और पलटवाँ है, तथापि, यह संभावित नुकसान का कारण है. पिछले 12 काम में, BOMUS साथ इलाज चूहों के histologic (चित्रा 5) नुकसान और व्यवहार में बदलाव (चित्रा 6) के लिए मूल्यांकन किया गया. 0.36 MPa के शिखर नकारात्मक ध्वनिक दबाव नहीं मनाया नकारात्मक प्रभाव (चित्रा 6) के साथ जुड़े थे. हालांकि, 0.52 MPa BOMUS पशुओं के एक सबसेट में एक intracerebral लाल रक्त कोशिका extravasations के की एक छोटी संख्या के साथ जुड़े थे (

बस रूप में BOMUS तकनीक संभावित हानिकारक है, मैंगनीज भी 25 विषाक्तता अच्छी तरह से जाना जाता है. + करोड़ 2 neuromuscular 26 जंक्शन और तंत्रिका 27 प्रणाली पर विषाक्त प्रभाव है जाना जाता है. इस विषाक्तता की संभावना प्रशासन के बाद चूहों की तन्द्रा के लिए जिम्मेदार है, हालांकि इस आशय के लिए तंत्र अज्ञात है. लगभग उत्तेजना के पहले 60 मिनट के लिए, माउस कुछ उनींदा, लेकिन अभी भी एक पैर की अंगुली चुटकी जैसे दर्दनाक उत्तेजनाओं के लिए उत्तरदायी रहता है. इस माउस के शारीरिक संयम लिए की आवश्यकता के बिना उत्तेजना सहन करने के लिए अनुमति देता है. हमारे अनुभव में, यह तन्द्रा जिसके बाद पशु बेचैन हो सकता है के बारे में 60 मिनट के लिए पर्याप्त है. अतिरिक्त रासायनिक संयम हो सकता हैchieved के रूप में 5% के बारे में 15 सेकंड nosecone के माध्यम से isoflurane के साथ की जरूरत है. इस प्रदर्शन में, तन्द्रा vibrissae की उत्तेजना में मदद की है, तथापि, यह भी प्रति बैरल प्रांतस्था में neuronal प्रतिक्रिया कम हो सकता है.

बस + 2 करोड़ प्रशासन के अलावा, BOMUS तकनीक अन्य निदान या चिकित्सात्मक एजेंटों के लिए विश्व स्तर पर प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पूर्व काम में, BOMUS मस्तिष्क के लिए जी.डी. DTPA, एक एमआरआई इसके विपरीत एजेंट, प्रशासन इस्तेमाल किया गया है 12 फिर भी., BBB BOMUS साथ हासिल की पारगम्यता की प्रकृति के बारे में कई सवाल रहते हैं. सबसे पहले, यह स्पष्ट नहीं है क्या आकार एजेंटों BOMUS के बाद बीबीबी पार कर रहे हैं. दोनों 2 करोड़ + और ​​जी.डी. DTPA (500 दा) काफी छोटे अणुओं हैं. दूसरा, यह स्पष्ट कितना BBB के पारगम्यता मस्तिष्क पर बदलता नहीं है. तीसरा, यह स्पष्ट नहीं है कि BBB के उद्घाटन के एक अपेक्षाकृत द्विआधारी प्रभाव नहीं है, या अगर कुछ खोलने के मापदंडों आकार या सामग्री की दर को प्रभावित कर सकते हैंपारगमन. हालांकि जी.डी. DTPA ऊपर अध्ययन में मस्तिष्क के माध्यम से काफी समान रूप से वितरित, यह बहुत छोटा है और भी प्रसारण पारगम्यता में कोई मतभेद प्रकट हो सकता है.

इन BOMUS के बारे में अनिश्चितताओं के बावजूद, विधि जल्दी AIM-एमआरआई के प्रयोजन के लिए 2 करोड़ के प्रशासन के लिए प्रभावी है. AIM-एमआरआई चूहों में इस्तेमाल किया गया है लंबे समय तक चूहों 28-30 में उत्तेजना (1-2 दिन) के लिए neuronal प्रतिक्रिया नक्शा, लेकिन इस नए दृष्टिकोण के साथ, अल्पकालिक उत्तेजना प्रयोगों अब संभव है. इससे पहले, 2 करोड़ का तेजी से प्रशासन + आसमाटिक बीबीबी अतितनावी mannitol की intracarotid जलसेक का उपयोग विघटन के साथ ही संभव था. यह दृष्टिकोण केवल चूहों और बड़े पशु मॉडल में व्यावहारिक था, लेकिन चूहों में भी, इन अध्ययनों और तकनीक के invasiveness unilaterality द्वारा सीमित थे. क्योंकि BOMUS noninvasively किया जा सकता है, अब जाग उत्तेजना और अनुदैर्ध्य अध्ययन संभव होना चाहिए. इसके अलावा beca2 करोड़ उपयोग + दोनों मस्तिष्क गोलार्द्धों के लिए प्रशासित किया जा सकता है, उत्तेजना मानदंड का एक व्यापक रेंज संभव हो रहे हैं. ऊपर प्रदर्शन,. द्विपक्षीय प्रशासन 2 करोड़ + unstimulated गोलार्द्ध एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए, ताकि गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि उत्तेजना neuronal प्रतिक्रिया एकपक्षीय vibrissae उत्तेजना के जवाब से अलग किया जा सकता है की अनुमति दी.

गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि उत्तेजना को नियंत्रित करने के लिए इसके अलावा में, unstimulated गोलार्द्ध लिए मैंगनीज प्रशासन की एकरूपता और स्थिरता के लिए नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था. अन्य मैंगनीज बढ़ाकर एमआरआई 19 प्रयोगों में देखा, वितरण डेटा (चित्रा 4) का संकेत मिलता है कि BOMUS तकनीक मस्तिष्क के एक सजातीय वृद्धि प्रदान नहीं करता है. इस प्रकार, पर्याप्त नियंत्रण (नियंत्रण जानवरों या एक unstimulated गोलार्द्ध) के बिना, उच्च आधारभूत वृद्धि के साथ क्षेत्रों क्षेत्रों तत्वों जिसका भेद करना मुश्किल हैबढ़ा संकेत neuronal गतिविधि के कारण है.

हालांकि आधारभूत दो करोड़ + वृद्धि सजातीय नहीं है, काफी व्यक्तियों के बीच लगातार पैटर्न है. फिर भी, इस आधारभूत वृद्धि में मामूली बदलाव के लिए AIM-एमआरआई संकेत अस्पष्ट सकता है. इस प्रदर्शन में, हम कई पशुओं पर एमआरआई संकेत AIM के औसत से इस संभावित समस्या को संबोधित किया. वैकल्पिक रूप से, आधारभूत वृद्धि में मतभेद पूर्व उत्तेजना छवियों को प्राप्त करने के लिए जिम्मेदार हो सकता है.

यहाँ प्रस्तुत विधि पर्याप्त सांख्यिकीय छवि विश्लेषण, जो बारी में, उच्च विश्वस्तता छवि पंजीकरण की आवश्यकता की आवश्यकता है. बेशक, ऐसे पंजीकरण केवल सार्थक है यदि स्रोत डेटा (सभी तीन आयामों में) संकल्प है कि पर्याप्त रूप से ब्याज की संरचनाओं की तुलना में बेहतर है के साथ हासिल है. इस प्रदर्शन में, 3 डी छवियों लगभग isotropic voxels साथ प्रत्येक आयाम में लगभग 160 microns हासिल किया गया है, जो उत्कृष्ट के लिए अनुमति दीसंरचनात्मक पंजीकरण. फिर भी, छवि पंजीकरण इस पद्धति का एक मामूली औसत से बाहर misregistration वृद्धि की बहुत छोटी सकता है क्षेत्रों के स्थानिक संकल्प को सीमित कर सकता है. सेरिबैलम और घ्राण बल्ब विशेष रूप रजिस्टर करने के लिए मुश्किल हो सकता है, क्योंकि वे एक पतले स्तरित वृद्धि है और संरेखण से बाहर अक्सर मस्तिष्क के साथ कर सकते हैं.

यहाँ, हम जाग चूहों में लघु अवधि stimuli करने के लिए neuronal प्रतिक्रिया मानचित्रण के लिए एक विधि प्रस्तुत है. हालांकि नहीं सरल, विधि अपेक्षाकृत व्यावहारिक है और सुलभ है. सीमाओं और बारीकियों के इस विस्तृत चर्चा उम्मीद है कि पाठक अपने स्वयं के प्रयोगात्मक सवालों के तकनीक लागू करने के लिए सक्षम होना चाहिए.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

सभी काम के Vivo माइक्रोस्कोपी के लिए ड्यूक केंद्र, एक NIH / NIBIB किया गया था राष्ट्रीय जैव चिकित्सा प्रौद्योगिकी संसाधन केंद्र (EB015897 P41) और NCI के छोटे पशु इमेजिंग संसाधन प्रोग्राम (CA092656 U24). NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (2003014921) से अतिरिक्त सहायता प्रदान की गई थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrophone Sonora Medical Systems, Longmont, CA SN S4-251
Translation stage Newport Corporation, Irvine, CA
Ultrasound transducer Olympus NDT, Inc., Waltham MA A306S-SU Review the manufacturer's test sheet that accompanies the transducer to find the exact center frequency of that particular transducer, which may differ from the nominal frequency listed in the catalog. (e.g., the nominal frequency of our transducer was 2.25 MHz, but the actual center frequency was 2.15 MHz.)
Vevo Imaging Station VisualSonics, Inc. Toronto, Canada
50 dB power amplifier E&I, Rochester, NY model 240L
Signal generator Agilent Technologies, Santa Clara, CA model 33220A
MnCl2-(H2O)4 Sigma Molecular weight varies by batch, call manufacturer for exact measurement
Perflutren lipid microspheres Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA DEFINITY
Microsphere agitator Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA VIALMIX
MR imaging coil m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH 35 mm diameter quadrature transmit/receive volume coil
MRI system GE Healthcare, Milwaukee, WI GE EXCITE console operating a 7-T horizontal bore magnet
Image analysis environment Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA Amira MATLAB

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References

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Howles, G. P., Qi, Y., Rosenzweig, S. J., Nightingale, K. R., Johnson, G. A. Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI. J. Vis. Exp. (65), e4055, doi:10.3791/4055 (2012).

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