Summary
En teknikk er beskrevet for bredt åpne blod-hjerne barrieren hos mus ved hjelp av mikrobobler og ultralyd. Ved hjelp av denne teknikken, kan mangan gis til musen hjernen. Fordi mangan er en MR kontrastmiddel som akkumuleres i depolarized nevroner, gjør denne tilnærmingen avbildning av neuronal aktivitet.
Abstract
Selv om mus er den dominerende modellen system for å studere de genetiske og molekylære grunnlaget for nevromedisin, funksjonell Bildediagnostiske i mus forblir teknisk utfordrende. En tilnærming, Activation-Induced manganfosfatbelegg forbedret MR (AIM MRI), har blitt brukt med hell for å kartlegge neuronal aktivitet i gnagere 1-5. I AIM MR, Mn 2 + fungerer en kalsium analog og akkumuleres i depolarized nevroner 6,7. Fordi Mn 2 + forkorter T 1 vev eiendom, vil regioner av forhøyet nerveaktiviten forbedre i MR. Videre Mn 2 + forsvinner sakte fra de aktiverte regionene, og derfor kan stimulering utføres utenfor magneten før bildebehandling, slik at større eksperimentell fleksibilitet. Men fordi Mn 2 + ikke krysser lett blod-hjerne barrieren (BBB), behovet for å åpne BBB har begrenset bruken av AIM MR, særlig i mus.
Ett verktøy for å åpne BBB er ultrasound. Selv om potensielt skadelig, hvis ultralyd gis i kombinasjon med gassfylte mikrobobler (dvs. ultralyd kontrastmidler), er den akustiske trykket som er nødvendig for BBB åpningen betydelig lavere. Denne kombinasjonen av ultralyd og mikrobobler kan brukes til pålitelig åpne BBB uten å forårsake vevsskade 8-11.
Her er en metode presenteres for utføring AIM MRI ved hjelp av mikrobobler og ultralyd for å åpne BBB. Etter en intravenøs injeksjon av perflutren mikrobobler, er en ufokusert pulset ultralyd strålen brukes på barbert mus hodet i 3 minutter. For enkelhets skyld kaller vi denne teknikken av BBB Åpning med mikrobobler og ultralyd som BOMUS 12. Bruke BOMUS å åpne BBB gjennom begge hjernens hemisfærer, er mangan gis til hele musen hjernen. Etter eksperimentell stimulering av lett sederte mus, er AIM MR brukes til å kartlegge nerveaktivitet.
Tildemonstrere denne tilnærmingen, er her BOMUS og AIM MR brukes til å kartlegge ensidig mekanisk stimulering av vibrissae i lett sederte mus 13. Fordi BOMUS kan åpne BBB gjennom begge halvkuler er unstimulated side av hjernen som brukes til å kontrollere for ikke-spesifikk bakgrunn stimulering. Den resulterende 3D-aktivering kart stemmer godt med publisert fremstillinger av vibrissae regioner av fat feltet cortex 14. Den ultrasoniske åpningen av BBB er rask, noninvasive, og reversible, og dermed denne tilnærmingen er egnet for høy gjennomstrømning og / eller longitudinelle studier i våken mus.
Protocol
1. Monter og Kalibrer Ultrasound System
- Ultralyd systemet begynner med en enkelt-element ultralyd svinger med en diameter bred nok til å dekke musen hjernen og et senter frekvens i størrelsesorden 2 MHz. Svingeren er drevet av en 50-dB-effektforsterker, som er koblet til en signal generator som produserer ultralyd puls sekvens.
- For å kalibrere lydtrykk av ultralyd, kan du bruke en hydrofon å forholde spenningen til den resulterende lydtrykk. Plasser svingeren i en vanntank over hydrofonen. Påfør en enkel puls (for eksempel en 10-syklus sinusoid på svingeren frekvens med puls repetisjon frekvens på 10 Hz) til svingeren. Bruk en 3-akse oversettelse scenen for å finne topp respons, som bør være i sentrum av ultralydstrålen på svingeren naturlige fokus (ca 60 mm for vår 13 mm diameter 2,15 MHz svinger).
- Gjør flere målinger over en range av inngangsspenninger (f.eks 50-400 mV pp) for å kontrollere lineariteten av systemet. Bruk en enkel lineær regresjon for å estimere forholdet mellom inngangsspenningen og lydtrykk. I vårt system, korresponderte inngangsspenninger av 258 og 167 mV pp til topp-negative akustiske press fra 0,52 og 0,36 MPa.
- Programmer signal generator for å produsere en ultralyd puls sekvens bestående av utbrudd av sinusformet pulser på svingeren frekvensen med 50000 sykluser per burst og et utbrudd periode på 64 ms. Basert på kalibrering målingene, sette Pulsamplitude å generere topp-negative akustiske press på 0,36 MPa i sentrum av svingeren naturlige fokus.
2. Forbered Reagenser
- Løs Mangan Klorid tetrahydrate (MnCl 2 · 4H 2 O) i sterilt vann i en konsentrasjon på 100 mm (300 mOsm) og filter sterilisere.
- Produsere perflutren lipid mikrosfærer av "activating "hetteglasset i fra produsenten agitator for 45 tallet. For en dag med eksperimenter, kan en enkelt hetteglass aktiveres en gang på starten av dagen og brukes uten reaktivering for resten av dagen.
- Umiddelbart før mikrosfære administrasjon, beveg hetteglasset hånd i 1 min til resuspender den mikrosfærer. Ved uttak av mikrobobler fra hetteglasset, ikke injisere romluft inn i glasset, da dette forringer de resterende mikrobobler. La hetteglasset ut til den siste bruken av dagen, og deretter lagre den i kjøleskap. Opprettholdt i denne moten, kan en enkelt hetteglass vare flere dager. Re-aktivere den lagrede hetteglasset i agitator, før første bruk på påfølgende dager.
3. Animal Forberedelse
- Anesthetize dyrene med isofluran, levert av nesen kjegle. Nesen kjegle Apparatet bør utformes for å fikse dyrets hode presist og pålitelig i samme stilling hver gang. Vår enhet 15 opprettholder hodet i the "skull-flat"-stilling (dvs. dorsal skallen overflaten er horisontal) som brukes i Paxinos hjernen atlas 16. Titrere bedøvelse for å opprettholde en respirasjonsfrekvens mellom 85 og 125 åndedrag per minutt. Opprettholde kroppstemperatur ved hjelp av en varmelampe eller blåst luft. Beskytt øynene med smøremiddel.
- Fjern hår fra musa hodebunnen ved hjelp av en elektrisk trimmer.
- Plasser en hale vene kateter og en intraperitoneal (IP) kateter. For overlevelse studier, sørg for å bruke egnet steril teknikk; IP kateteriseringen demonstrert i videoen til denne artikkelen er kun hensiktsmessig for ikke-overlevelse eksperimenter.
- Gjør eventuelle forberedelser som kreves for nevronale stimulering eksperimentet. For kartlegging av vibrissae stimulering av fatet feltet cortex, bruk en dissekere mikroskop og mikrokirurgiske saks for å klippe vibrissae så nært som mulig til hudoverflaten uten irriterende hårsekken eller omkringliggende hud.
- Plasser ultralyd gel påhodebunnen, og deretter lavere en vannsøyle omsluttet av en tynn plast ark (f.eks en 7,6 mikrometer trash bin liner) på hodet. Nå gjennom med vannsøyle med en bomull-tipped tip for å presse ut eventuelle luftbobler som blir fanget i ultralyd gel. Plasser ultralyd transducer på sitt naturlige brennvidde (58 mm) direkte over musen hjernen i kolonnen av vann, og tørk svingeren med en finger tips for å fjerne eventuelle luftbobler.
4. Blod-hjerne barrieren Åpning med mikrobobler og Ultra Sound (BOMUS)
- Gi en intraperitoneal injeksjon av mangan i en dose på 0,5 mmol / kg IP. Cap intraperitoneal kateter slik at mangan ikke flyter ut, og vente i 10 minutter for å tillate det å distribuere (figur 1).
- For å åpne BBB, administrere 30 mL av perflutren lipid mikrosfærer (aktivert DEFINITY) gjennom halen blodåre kateteret, og samtidig starte ultralyd puls sekvens. Continue insonification i 3 minutter.
5. Neuronal Stimulering
- La ca 40 minutter for hjernen nivåer av Mn 2 + å stabilisere før du begynner neuronal stimulering. På denne måten den dramatiske grunnlinjen forbedringen skyldes Mn 2 + diffusjon over BBB kan skilles fra den subtile differensial forbedring på grunn av stimulering. Deretter begynner stimulering med ditt paradigme valg (figur 1).
- For vibrissae stimulering, slå av isofluran og fjern nesen kjeglen. Flytte en myk kunstnerens pensel manuelt i en sirkelbevegelse (1-5 Hz) gjennom vibrissae matrisen med en avstand på ca 2-5 mm fra huden. Fortsett stimulering for 90 min. Den mangan har en beroligende effekt som gir uhemmet stimulering av dyret. Hvis dyret blir rastløse, administrere 5% isofluran via nese membran i omtrent 15 sekunder.
6. Magnetic Resonance Imaging
- Etter stimulering, gjenoppta anestesi via nesen kjegle. Fortsett å opprettholde kroppstemperaturen og titrere isofluran nivå til en respirasjonsfrekvens på 85-125 åndedrag per minutt.
- Plasser musen i en MR coil og overføre til MR-systemet. Acquire høyoppløselig 3D T 1-vektede MR-bilder. For eksempel bruke en 3D bortskjemt gradient tilbakekalt ekko (SPGR) sekvensen med følgende parametere: repetisjon tid på 25 ms, ekko på 2 ms, flip vinkel på 30 grader, båndbredde på 15,63 kHz, synsfelt på 20 × 20 × 12 mm; matrise av 128 × 128 × 60.
7. Bildeanalyse
- Bildeanalyse er spesifikt for stimulering paradigmet brukes. For vibrissae stimulering forsøket (figur 2), importere bildene fra flere dyr inn i et egnet analyse miljø. Dersom noen dyr ble stimulert på høyre, mens andre ble stimulert til venstre, flip litt slik at alle bildene blir effektivt "venstre-stimulert." Så, for å sammenligne stimulert siden av hver hjernen til sin kontralateral unstimulated side, lage en duplisert og avspeilet venstre-unstimulated image sett skapes. Registrer alle bildene til en felles plass og deretter jevne dem med en 3 × 3 × 3 piksel Gaussian kernel.
- Eksportere dataene til en matematisk analyse miljø, for eksempel MATLAB. Alternativt maskere irrelevant anatomi i datasett. Intensitet-normalisere bildene av iterativ metode for Venot et al. 17,18.
- Bruk en sammenkoblet, single-tailed t-test for å sammenligne hver voxel av de stimulerte sider av hver hjernen til tilsvarende kontralaterale voxel på unstimulated sidene av hver hjernen.
- Vise resulterende p-verdi kartet for å identifisere områder av differensial aktivitet (figur 3).
8. Representative Resultater
Metoden som presenteres her har to fond amental trinn: (1) BBB Åpning med mikrobobler og ultralyd (BOMUS) og (2) Activation-Induced manganfosfatbelegg forbedret MR (AIM MRI). Fordi sistnevnte trinnet avhenger av tidligere, er det viktig å verifisere vellykkede gjennomføring BOMUS.
Forstyrrelse av blod-hjerne barrieren etter administrering av en T 1-forkorting kontrastmiddel (som mangan eller gadolinium-baserte agent) resulterer i et signal økning i hjernen parenchyma på T 1-vektede bildebehandling i forhold til hjernen hvor BOMUS ble ikke utført (figur 4). Fordelingen av dette mangan ekstrautstyret er ikke helt ensartet, selv om det er ganske konsekvent mellom dyr. Fordelingen gjenspeiler ikke bare inhomogeneity i BBB åpningen, men også er den indre ikke-uniform fordeling av Mn i hjernen 19. De romlige og tidsmessige dynamikken i BBB åpningen har blitt ytterligere beskrevet tidligere 12.
ent "> Når BOMUS har blitt implementert, er neste trinn å utføre AIM MR mange eksperimentelle paradigmer er mulig;.. men må fordi det er mange potensielle forundrer, de kontroller og analyser nøye utformet Medvirkende effekter inkluderer inhomogen BBB åpning, inhomogen akkumulering av Mn i hjernen, timelige dynamikk Mn diffusjon, og uspesifikke neuronal aktivitet. I denne demonstrasjonen ble nerveaktivitet ved ensidig stimulering av vibrissae kartlagt. å redegjøre for inhomogeniteter og Mn flux, den unstimulated siden av hver hjernen ble brukt som en intern kontroll. å veie opp for uspesifikke neuronal aktivitet som kan variere mellom dyr, brukt analysen statistisk testing for å identifisere områder som var konsekvent forskjellig blant dyrene (figur 2). Resultatene var en tre-dimensjonal forskjell kart og en tredimensjonale p-verdi kart (figur 3), til høyre, som indikerte regionerav høyere signal kontralateral til stimulert vibrissae. Den venstre side av kartet indikerte hvilke regioner hadde signifikant høyere signal ipsilaterale til stimulert vibrissae. P-verdien kart identifisert et bredt område av forhøyet signal kontralateral til stimulert vibrissae som tilsvarte fat feltet i primær sensorisk cortex, som respons på vibrissae stimulering har blitt grundig dokumentert av elektrofysiologi 20,21 og 2-deoxyglucose studier. En mer fullstendig gjennomgang av disse resultatene har blitt publisert tidligere 13.
Figur 1. Protokoll tidsplan for funksjonell Bildediagnostiske med BOMUS og AIM MRI (Tilpasset fra Howles et al. 13).
Figur 2. Analyse ordning for å identifisere regioner of forskjellig intensitet mellom stimulert og unstimulated sider av hver hjernen. Å sammenligne den stimulerte siden av hver hjernen til sin kontralateral unstimulated side, en duplisert og avspeilet venstre-unstimulated image sett skapes. Disse bildene er registrert, filtrert, og normalisert. Til slutt, ved test sammenligner venstre stimulert og venstre unstimulated bilder. Den t-test er "sammenkoblet" slik at den stimulerte siden av hver hjernen er bare i forhold til unstimulated side av samme hjerne. Den t-test er "single-tailed" slik at den ene siden av p-verdien kart indikerer signifikant høyere signal på stimulerte side av hjernen, mens den andre siden av p-verdien kart indikerer signifikant høyere signal på unstimulated side av hjerne (Tilpasset fra Howles et al. 13).
Figur 3. Resultater av samlet analyse av 7 dyr ved to forskjellige aksiale posisjoner. T han første kolonnen viser gjennomsnittet av alle registrerte bilder justert, slik at effektivt alle mus hadde sin venstre vibrissae stimulert. Disse bildene er kledde med en farge kart som viser den gjennomsnittlige prosent økning i signal ved hver voxel forhold til kontralaterale hemisfære, som indikert av fargen bar. Fargede områder på høyre side av bildet viser hvor halvkule kontralaterale til stimuleringen hadde høyere signal. Fargede områder på venstre side av bildet viser hvor halvkule ipsilaterale til stimuleringen hadde høyere signal. Den andre kolonnen viser de samme bildene overtrukket med p-verdien kart som viser den statistiske signifikans av økningen i signalet. Den tredje kolonnen viser den samme p-verdi kartet kledde på de tilsvarende tallene fra Paxinos stereotaxic atlas 16 med fat felt av sensorisk cortex skyggen (Tilpasset fra Howles et al. 13).
/ 4055/4055fig4.jpg "/>
Figur 4. Romlig fordeling av Mn 2 + i hjernen. Bilder ble anskaffet 170 minutter etter 0,5 mmol / kg IP MnCl 2 fra BOMUS-behandlet (n = 5) og kontroll (n = 4) mus. Etter normalisering, gjennomsnitt og standardavvik kartene ble beregnet (venstre panel). Ekstrautstyr var større i BOMUS-behandlede mus. Selv om dette ekstrautstyret ikke var ensartet på tvers av hjernen, var det ganske konsekvent, med unntak nær kantene på hjernen og ventriklene. Bruke regioner av interesse (Rois) trukket rundt ulike strukturer, ble den midlere SNR (+ 1 SD) beregnet over hver gruppe (høyre panel). BOMUS-behandlede dyrene viste større SNR men også større avvik mellom strukturer og mellom dyr (Tilpasset fra Howles et al. 13).
Figur 5. Å undersøke vev effekter av BOMUS ble hjerner fra BOMUS-behandlede mus fast, sectioned ved 500 - mikrometer intervaller, og farget med hematoxylin og eosin. Gjennomsnittlig antall røde blodlegemer extravasations sett i hver del av hjernen er vist for akustiske press på 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4), og 5,0 MPa (n = 1). Feilfelt viser standard feil. Den andre panelet viser et eksempel på alvorlig røde blodlegemer bloduttredelse fra hjernen utsettes til 5,0 MPa (Tilpasset fra Howles et al. 12).
Figur 6. Kvantitativ atferdsmessige testing ble brukt til å vurdere aktivitet, opphisselse, og reaksjonsevne før anestesi, og 3 og 24 timer etter utvinning fra anestesi. Scoring systemet, som er beskrevet tidligere 12, var basert på veletablerte kvantitativ mus atferdsmessige vurdering utvikleed av Irwin i 1968 22. Den gjennomsnittlige atferd (± SEM) score for kontroll (n = 3) og BOMUS (0,36 MPa) behandlet (n = 8) dyr vises. I forhold til pre-bedøvelse baseline, alle dyr viser en nedgang i oppførsel poengsummen 3 timer etter anestesi, men de i stor grad komme innen neste dag. På hvert tidspunkt, ble det ingen forskjell sett mellom de to gruppene, noe som indikerer at BOMUS ikke målbart påvirke dyrs atferd (Tilpasset fra Howles et al. 12).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her ble en metode presentert for invasivt åpne BBB hele musen hjernen med ultralyd og mikrobobler (BOMUS). Med BBB åpen, Mn 2 + ble administrert og aktivisering-indusert mangan-enhanced MR (AIM MR) ble brukt til bilde nerveaktivitet ved kort varighet stimulering i lett sederte mus.
Tilstrekkelig BBB åpningen ble oppnådd med en topp-negativ lydtrykk på 0,36 MPa. Obs, er dette trykket ved hodebunnen overflate i midten av ultralyd strålen. Målinger av enkelt-element svinger strålen profil indikerer at den akustiske trykket på strålen kanten er bare ca 0,12 MPa. Deretter reduserer demping gjennom skallen trykket nå hjernen med anslagsvis 25% (derating basert på Choi et al. 23. og justert for frekvens). Dette indikerer at BBB avbrudd skjedde på topp-negative akustiske presset av 0,09 MPa (i midten av bjelken vår) Til 0,03 MPa (på kanten). Dette presset er lavere enn nivåene (typisk 0,4 til 0,5 MPa) rapportert andre steder 24. Dette reduserte trykket terskel kan skyldes høyere dose av lipid mikrobobler som brukes i dette arbeidet (ca 1,2 ml / kg) sammenlignet med andre. Mens dose av mikrobobler brukt var høyere enn anbefalt diagnostisk human dose (10 mL / kg), ble negative effekter ikke observert.
Som angitt her, er det BOMUS teknikk noninvasive og reversible, men har det potensial til å forårsake skade. I tidligere arbeid 12, ble musene behandlet med BOMUS evaluert for histologisk skader (figur 5) og atferdsendringer (figur 6). Peak-negative akustiske press på 0,36 MPa var assosiert med ingen observerte negative effekter (figur 6). Imidlertid ble 0,52-MPa BOMUS forbundet med en liten rekke intracerebral røde blodlegemer extravasations i en undergruppe av dyrene ( Akkurat som BOMUS teknikken er potensielt skadelig, har mangan også godt kjent toksisitet 25. Mn 2 + er kjent for å ha giftige effekter på nevromuskulære veikryss 26 og nervesystemet 27. Denne toksisitet er trolig ansvarlig for søvnighet av musene etter inntak, men mekanismen for denne effekten er ukjent. For omtrent de første 60 minuttene av stimulering, forblir musen noe somnolent men fortsatt svarer til smertefulle stimuli som en tå klype. Dette gjør at musen til å tolerere den stimulering uten behov for fysisk tvang. Etter vår erfaring er dette søvnighet tilstrekkelig for ca 60 minutter etter der dyret kan bli rastløs. Ytterligere kjemisk fengsling kan være enchieved etter behov med ca 15 sekunder på 5% isofluran via nosecone. I denne demonstrasjonen, lettet søvnighet stimulering av vibrissae, men det kan også ha redusert nerveaktivitet i tønne cortex. I tillegg til å bare administrere Mn 2 +, kan BOMUS teknikken brukes til globalt administrere andre diagnostiske eller terapeutiske agenter. I tidligere arbeid, har BOMUS blitt brukt til å administrere Gd-DTPA, en MR kontrastmiddel, til hjernen. Tolv likevel mange spørsmål gjenstår om natur BBB permeabilitet oppnådd med BOMUS. For det første er det ikke klart hva størrelse agenter er i stand til å krysse BBB etter BOMUS. Både Mn 2 + og Gd-DTPA (500 Da) er ganske små molekyler. For det andre er det ikke klart hvor mye permeabiliteten av BBB varierer over hjernen. For det tredje er det ikke klart om BBB åpningen er en relativt binær effekt, eller dersom visse åpningstider parametere kan påvirke størrelsen eller frekvensen av materialegjennomtrengning. Selv Gd-DTPA distribueres ganske jevnt gjennom hjernen i ovennevnte studien, kan det ha vært for liten og for diffusible å avdekke eventuelle forskjeller i permeabilitet. Til tross for disse usikkerhetene vedrørende BOMUS, er metoden effektiv for raskt å administrere Mn 2 + for å AIM-MR. AIM-MR har vært brukt i mus for å kartlegge nerveaktivitet ved langsiktig (1-2 dager) stimulering i mus 28-30, men med denne nye tilnærmingen, kortsiktige stimulering eksperimenter er nå mulig. Tidligere rask administrasjon av Mn 2 + var bare mulig med osmotisk BBB avbrudd med en intracarotid infusjon av hyperton mannitol. Denne tilnærmingen var bare praktisk i rotter og større dyremodeller, men selv i rotter, ble disse studiene begrenses av invasivitet og unilaterality av teknikken. Fordi BOMUS kan utføres invasivt, bør våken stimulering og longitudinelle studier nå være mulig. Videre becaBruk Mn 2 + kan gis til både hjernens hemisfærer, et bredere spekter av stimulering paradigmer er mulig. I ovenfor demonstrasjonen, den bilaterale administrasjonen Mn 2 + tillot unstimulated halvkule til å fungere som en intern kontroll, slik at nerveaktivitet til ikke-spesifikk bakgrunn stimulering kunne skilles fra responsen til den ensidige vibrissae stimulering. I tillegg til å kontrollere for ikke-spesifikk bakgrunn stimulering, det unstimulated halvkule også ble brukt til å kontrollere for homogenitet og konsistensen av mangan administrasjonen. Som sett i andre mangan-forsterket MR eksperimenter 19, fordeling dataene (figur 4) indikerer at BOMUS teknikken ikke gir en homogen forbedring av hjernen. Dermed, uten tilstrekkelige kontroller (kontroll dyr eller en unstimulated halvkule), regioner med høyere baseline forbedring er vanskelig å skille fra regioner som elefremvinnes signal skyldes neuronal aktivitet. Selv grunnlinjen Mn 2 + ekstrautstyr er ikke homogen, er mønsteret ganske konsekvent blant enkeltpersoner. Likevel kunne mindre variasjoner i denne referansebanen forbedringen tilsløre AIM-MR signal. I denne demonstrasjonen, adressert vi dette potensielle problemet ved gjennomsnitt på AIM-MR-signalet over flere dyr. Alternativt kan forskjeller i baseline ekstrautstyr redegjøres for ved å kjøpe pre-stimulering bilder. Metoden som presenteres her krever betydelig statistisk bildeanalyse, som i sin tur krever hi-fi-image registrering. Selvfølgelig er en slik registrering bare mening dersom kilden dataene er ervervet med en oppløsning (i alle tre dimensjoner) som er tilstrekkelig finere enn de strukturer av interesse. I denne demonstrasjonen, ble 3D-bilder ervervet med nesten isotrope voxels ca 160 mikrometer i hver dimensjon, noe som tillot for utmerketanatomiske registrering. Likevel kan image registrering begrense romlig oppløsning av denne metoden, en liten feilregistrering effektivt å gjennomsnitt-out svært små områder av ekstrautstyr. Lillehjernen og olfactory pærer kan være spesielt vanskelig å registrere, fordi de har et fint lagdelt forbedring og er ofte ute av tråd med cerebrum. Her har vi presentert en metode for kartlegging nerveaktivitet ved kortvarige stimuli i våken mus. Selv ikke enkelt, er metoden relativt praktisk og tilgjengelig. Denne nærmere omtale av de begrensninger og spissfindigheter skal forhåpentligvis gi leseren til å bruke teknikken til sine egne eksperimentelle spørsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Alt arbeid ble utført ved Duke Center for In Vivo Mikroskopi, en NIH / NIBIB nasjonal Biomedical Technology Resource Center (P41 EB015897) og NCI Small Animal Imaging Resource Program (U24 CA092656). Ytterligere støtte ble gitt fra NSF Graduate Research Fellowship (2003014921).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrophone | Sonora Medical Systems, Longmont, CA | SN S4-251 | |
| Translation stage | Newport Corporation, Irvine, CA | ||
| Ultrasound transducer | Olympus NDT, Inc., Waltham MA | A306S-SU | Review the manufacturer's test sheet that accompanies the transducer to find the exact center frequency of that particular transducer, which may differ from the nominal frequency listed in the catalog. (e.g., the nominal frequency of our transducer was 2.25 MHz, but the actual center frequency was 2.15 MHz.) |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, Inc. Toronto, Canada | ||
| 50 dB power amplifier | E&I, Rochester, NY | model 240L | |
| Signal generator | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | model 33220A | |
| MnCl2-(H2O)4 | Sigma | Molecular weight varies by batch, call manufacturer for exact measurement | |
| Perflutren lipid microspheres | Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA | DEFINITY | |
| Microsphere agitator | Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA | VIALMIX | |
| MR imaging coil | m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH | 35 mm diameter quadrature transmit/receive volume coil | |
| MRI system | GE Healthcare, Milwaukee, WI | GE EXCITE console operating a 7-T horizontal bore magnet | |
| Image analysis environment | Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA | Amira MATLAB |
References
- Aoki, I. Detection of the anoxic depolarization of focal ischemia using manganese-enhanced MRI. Magnet. Reson. Med. 50, 7-12 (2003).
- Aoki, I. Dynamic activity-induced manganese-dependent contrast magnetic resonance imaging. DAIM MRI). Magnet. Reson. Med. 48, 927-933 (2002).
- Duong, T. Q., Silva, A. C., Lee, S. P., Kim, S. G. Functional MRI of calcium-dependent synaptic activity: Cross correlation with CBF and BOLD measurements. Magnet. Reson. Med. 43, 383-392 (2000).
- Lin, Y. J., Koretsky, A. P. Manganese ion enhances T-1-weighted MRI during brain activation: An approach to direct imaging of brain function. Magnet. Reson. Med. 38, 378-388 (1997).
- Lu, H. B. Cocaine-induced brain activation detected by dynamic manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2489-2494 (2007).
- Drapeau, P., Nachshen, D. A. Manganese fluxes and manganese-dependent neurotransmitter release in presynaptic nerve-endings isolated from rat-brain. J. Physiol-London. 348, 493-510 (1984).
- Narita, K., Kawasaki, F., Kita, H. Mn and Mg influxes through Ca channels of motor-nerve Terminals are prevented by verapamil in Frogs. Brain Res. 510, 289-295 (1990).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-644 (2001).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: Histological findings in rabbits. Ultrasound Med. Biol. 31, 1527-1537 (2005).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Phys. Med. Biol. 51, 793-807 (2006).
- Howles, G. P. Contrast-enhanced in vivo magnetic resonance microscopy of the mouse brain enabled by noninvasive opening of the blood-brain barrier with ultrasound. Magnet. Reson. Med. 64, 995-1004 (2010).
- Howles, G. P., Qi, Y., Johnson, G. A. Ultrasonic disruption of the blood-brain barrier enables in vivo functional mapping of the mouse barrel field cortex with manganese-enhanced MRI. Neuroimage. 50, 1464-1471 (2010).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of sml face cortex with special reference to occurrence of barrels in layer-4. J. Comp. Neurol. 164, 79-94 (1975).
- Howles, G. P., Nouls, J. C., Qi, Y., Johnson, G. A. Rapid production of specialized animal handling devices using computer-aided design and solid freeform fabrication. J. Magnet. Reson. Imag. 30, 466-471 (2009).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. (2001).
- Cross, D. J. Statistical mapping of functional olfactory connections of the rat brain in vivo. Neuroimage. 23, 1326-1335 (2004).
- Venot, A., Lebruchec, J. F., Golmard, J. L., Roucayrol, J. C. An automated-method for the normalization of scintigraphic images. J. Nucl. Med. 24, 529-531 (1983).
- Aoki, I., Naruse, S., Tanaka, C. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI) of brain activity and applications to early detection of brain ischemia. Nmr. Biomed. 17, 569-580 (2004).
- Welker, E., Vanderloos, H. Quantitative correlation between barrel-field size and the sensory innervation of the whiskerpad - a comparative-study in 6 strains of mice bred for different patterns of mystacial vibrissae. J. Neurosci. 6, 3355-3373 (1986).
- McCasland, J. S., Woolsey, T. A. High-resolution 2-deoxyglucose mapping of functional cortical columns in mouse barrel cortex. J. Comp. Neurol. 278, 555-569 (1988).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment : A systematic quantitative procedure for assessing behavioral and physiologic state of mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound Med. Biol. 33, 95-104 (2007).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Use of ultrasound pulses combined with definity for targeted blood-brain barrier disruption: A feasibility study. Ultrasound Med. Biol. 33, 584-590 (2007).
- Silva, A. C., Lee, J. H., Aoki, L., Koretsky, A. R. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI): methodological and practical considerations. Nmr. Biomed. 17, 532-543 (2004).
- Meiri, U., Rahamimoff, R. Neuromuscular transmission - inhibition by manganese ions. Science. 176, 308 (1972).
- Aschner, M., Guilarte, T. R., Schneider, J. S., Zheng, W. Manganese: Recent advances in understanding its transport and neurotoxicity. Toxicol. Appl. Pharm. 221, 131-147 (2007).
- Watanabe, T., Frahm, J., Michaelis, T. Manganese-enhanced MRI of the mouse auditory pathway. Magnet. Reson. Med. 60, 210-212 (2008).
- Yu, X., Wadghiri, Y. Z., Sanes, D. H., Turnbull, D. H. In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI. Nat. Neurosci. 8, 961-968 (2005).
- Yu, X. Statistical mapping of sound-evoked activity in the mouse auditory midbrain using Mn-enhanced MRI. Neuroimage. 39, 223-230 (2008).
