Denna video demonstrerar förfaranden för karakterisering av humana pankreasöar med hematoxylin och eosin (H & E) och immunohistokemi (IHC). Pankreatiska sektioner från huvud, kropp och regioner svans färgas av både H & E och IHC för att bestämma ö endokrin sammansättning (insulin, glukagon och pankreaspolypeptid), cellreplikation (Ki67) och inflammatoriska infiltrat (H & E, CD3). Den uncinate regionen är lokaliserad användning IHC för pankreatisk polypeptid.
Uppskattningar av ö-område och antalet och endokrina celler komposition i vuxen human pankreas variera från flera hundra tusen till flera miljoner och beta massa ligger i intervallet från 500 till 1500 mg 1-3. Med denna kända heterogenitet, var en vanlig behandling och färgningsproceduren utvecklas så att bukspottkörteln regioner var tydligt definierade och holmar kännetecknas med rigorös histopatologi och undersökningar immunolokalisering.
Standardiserade förfaranden för bearbetning av mänskliga bukspottkörteln återhämtat sig från organdonatorer beskrivs i del 1 av denna serie. Bukspottkörteln är bearbetas i 3 huvudsakliga områden (huvud, kropp, svans) följt av tvärgående sektioner. Tvärgående snitt från bukspottkörteln huvudet är vidare uppdelade, som anges baserat på storlek, och numrerade alfabetiskt att beteckna underavdelningar. Denna standardisering möjliggör en fullständig tvärsektion analys av huvudet regionen inklusive uncinate region som innehåller sammansatta cellöarprimärt av pankreatisk polypeptid celler till svansregionen.
Den här rapporten utgör en del 2 i denna serie och beskriver de förfaranden som används för seriell sektionering och histopatologiska karakterisering av avsnitten pankreas paraffin med en betoning på ö endokrina celler, replikering och T-cellinfiltrat. Patologi pankreas sektioner är avsedd att karakterisera både exokrin, duktulära, och komponenter endokrina. Den exokrina facket utvärderas med avseende på närvaro av pankreatit (aktiv eller kronisk), atrofi, fibros, och fett, liksom kanalsystemet, i synnerhet i relation till närvaron av pankreatisk intraduktal neoplasi 4. Cellöarna utvärderades med avseende på morfologi, storlek och densitet, celler endokrina, inflammation, fibros, amyloid, och närvaron av replikerande eller apoptotiska celler med användning av H & E och IHC fläckar.
Den sista komponenten beskrivs i del 2 är tillhandahållandet av färgade bildens som digitaliserade hela glaset bilder. De digitaliserade bilderna är organiserade från fall till fall och bukspottkörtel region i en online-databas patologi skapa en virtuell biobank. Tillgång till detta online kollektion tillhandahålls för närvarande till över 200 kliniker och forskare som deltar i typ 1-diabetes forskning. Online databasen ger ett medel för snabb och fullständig datadelning och utredarna att välja block för paraffin eller frysta seriella sektioner.
Standardisering av IHC förfaranden är kritisk för bildanalys, speciellt vid användning av dator-baserade algoritmer i stora mängder glider över tiden. IHC färgning som beskrivs i denna rapport kan parti analys av en viss givares prover med en Autostainer inom en 8-timmars arbetsdag och ändras från en tidigare rapport 5. Digitaliserade hela glaset bilder av varje färgade bild görs tillgänglig för nPOD-anslutna utredare genom det webbaserade online-patologi system. Utredarna kan granska givare demo…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar givarna familjer och orgeln organisationer för tillvaratagande inblandade i denna forskning och Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal och Roshan Agarwal för deras experthjälp. Detta arbete har finansierats av Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) till stöd för nätverket för givare bukspottkörtel Organ med diabetes.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | FisherScientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector | AK-5000 | AP conjugate |
Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
Avidin blocker | Vector | SP-2001 | Block endogenous biotin |
Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector | BA-7000 | Secondary antibody |
Bluing Reagent | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | Leica autostainer |
Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
DAB | Vector | SK-4100 | HRP chromogen |
DEEB | DAKO | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
Eosin Y Alcoholic | FisherScientific | 71204 | Leica autostainer |
Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica autostainer |
IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
Liquid Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP chromogen |
Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
Methanol | FisherScientific | Various | H2O2 diluent |
Normal goat serum | Vector | S-1000 | IHC blocking reagent |
Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC buffer |
Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
Xylene | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents.
Primary Antibody | Host species | Vendor | Cat. # | Comments and Antigen Retrieval |
Paraffin | ||||
Amylase | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrate |
Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrate |
Carbonic anhydrase 19.9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
Caspase-3, cleaved | Rabbit | Cell Signaling | 9961 | Citrate or Trilogy |
CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrate or Trilogy |
CD3 | Rabbit | DAKO | A0452 | Citrate |
CD34 | Mouse | Cell Signaling | 3569 | Citrate |
CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrate |
CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrate |
CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrate |
CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrate |
Chromogranin A | Rabbit | DAKO | A0430 | Citrate |
CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrate |
CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrate |
CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrate |
C-peptide | Rabbit | Cell Signaling | 4593 | Citrate |
Foxp3 | Rat | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrate |
Ghrelin | Goat | Santa Cruz | SC-10386 | |
Ghrelin | Rabbit | Abcam | ab85104 | |
Glucagon | Rabbit | DAKO | A0565 | |
Glucagon | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrate |
Glucagon | Guinea Pig | Bachem | T-5037 | Citrate |
Glut-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogy |
Glut-2 | Rabbit | Santa Cruz | SC-9117 | Not expressed in human islets |
Insulin | Guinea Pig | DAKO | A0564 | |
Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrate |
Mafa | Rabbit | Novus Biological | NB400-137A | Trilogy |
Pancreatic polypeptide | Rabbit | Invitrogen | 18-0043 | Citrate |
Pdx-1 | Guinea Pig | Abcam | ab47308 | Citrate or Trilogy |
Proinsulin | Mouse | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
Proinsulin | Mouse | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Citrate |
Secretagogin | Rabbit | Sigma | HPA 006641 | Citrate |
Smooth muscle actin | Rabbit | Abcam | ab5694 | |
Somatostatin | Rabbit | DAKO | A0566 | |
Synaptophysin | Mouse | DAKO | M0776 | Citrate |
Fresh Frozen | Host species | Vendor | Cat. # | Comments |
CD11b | Rat | Abcam | ab6332 | Fix with 4% PF |
CD11c | Rabbit | Serotec | AHP1226 | |
CD25 | Mouse | Novus Biological | NB 600-564 | Use overnight incubation for paraffin sections |
CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fix with acetone |
GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130569 | Fix with 4% PF |
HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fix with acetone or 4% PF |
Table 2. Primary antibodies.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Aperio Scanscope CS | Aperio | Digital slide scanner | |
DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC stains | |
Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
Leica XL Autostainer | Leica | H&E stains | |
Premium Coverglass | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner software | |
Superfrost Plus slides | FisherScientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment.