Este vídeo demonstra os procedimentos para caracterização de ilhotas pancreáticas humanas com hematoxilina e eosina (H & E) e imuno-histoquímica (IHQ). Seções pancreáticas de cabeça, corpo e regiões da cauda estão manchadas por tanto H & E e IHC para determinar a composição endócrino ilhéu (insulina, glucagon e polipeptídeo pancreático), a replicação celular (Ki67), e infiltrado inflamatório (H & E, CD3). A região uncinado está localizado usando IHC para polipeptídeo pancreático.
As estimativas de área de ilhotas e os números e composição endócrino célula no pâncreas humano adulto variar de várias centenas de milhar a gamas de massa vários milhões e beta de 500 a 1500 mg 1-3. Com essa heterogeneidade conhecido, um tratamento padrão e procedimento de coloração foi desenvolvido para que as regiões pancreáticas foram claramente definidos e ilhotas caracterizados por histopatologia rigorosa e exames imunolocalização.
Procedimentos padronizados para o processamento de pâncreas humano recuperado de doadores de órgãos são descritos na parte 1 desta série. O pâncreas é processado em 3 regiões principais (cabeça, corpo, cauda), seguido de cortes transversais. Secções transversais da cabeça do pâncreas são ainda divididas, tal como indicado com base no tamanho, e numerados em ordem alfabética para denotar subsecções. Esta normalização permite uma análise completa transversal em corte da região da cabeça, incluindo a região que contém uncinado ilhotas compostosprincipalmente de células pancreáticas polipéptido para a região da cauda.
O presente relatório compreende parte 2 desta série e descreve os procedimentos utilizados para cortes seriados e caracterização histopatológica das seções pancreáticas de parafina com ênfase em células endócrinas das ilhotas, replicação e de células T infiltrados. Patologia de secções pancreáticas destina-se a caracterizar tanto exócrino, ductular, e componentes endócrinos. O compartimento exócrino é avaliada quanto à presença de pancreatite (activo ou crónica), atrofia, fibrose, e gordura, bem como o sistema de condutas, particularmente em relação à presença de neoplasia pancreática intraductal 4. Ilhotas são avaliadas para a morfologia, tamanho e densidade, células endócrinas, inflamação, fibrose, amilóide, bem como a presença de células replicantes ou apoptótico utilizando H e E e as manchas de IHC.
O componente final descrito na parte 2 é o fornecimento da lâmina coradas como digitalizados imagens de diapositivos inteiras. Os slides digitalizados são organizados por caso e região do pâncreas em um banco de dados on-line patologia criar um biobanco virtual. O acesso a esta coleção on-line está actualmente previsto para mais de 200 médicos e cientistas envolvidos na pesquisa do diabetes tipo 1. O banco de dados on-line fornece um meio para a rápida e completa partilha de dados e para os investigadores para selecionar blocos de parafina ou congelados cortes seriados.
Padronização da IHC procedimentos é crítica para a análise de imagem, especialmente quando se utiliza algoritmos baseados em computador através de um grande número de lâminas ao longo do tempo. O processo de coloração IHQ descritos neste relatório permitirá a análise do lote de amostras de um doador dado, utilizando um Autostainer dentro de um dia de trabalho de 8 horas e são modificadas a partir de um relatório anterior 5. Digitalizadas imagens de slides inteiros de cada slide manchado disponi…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem as famílias dos doadores e as Organizações de Procura de Órgãos envolvidos na pesquisa e Montgomery Emily, Pietras Robert, Fu Ann, Agarwal Mitali, e Agarwal Roshan para a sua assistência especializada. Este trabalho foi financiado pela Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) em apoio da Rede de Doadores de Órgãos do pâncreas com Diabetes.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | FisherScientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector | AK-5000 | AP conjugate |
Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
Avidin blocker | Vector | SP-2001 | Block endogenous biotin |
Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector | BA-7000 | Secondary antibody |
Bluing Reagent | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | Leica autostainer |
Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
DAB | Vector | SK-4100 | HRP chromogen |
DEEB | DAKO | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
Eosin Y Alcoholic | FisherScientific | 71204 | Leica autostainer |
Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica autostainer |
IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
Liquid Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP chromogen |
Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
Methanol | FisherScientific | Various | H2O2 diluent |
Normal goat serum | Vector | S-1000 | IHC blocking reagent |
Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC buffer |
Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
Xylene | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents.
Primary Antibody | Host species | Vendor | Cat. # | Comments and Antigen Retrieval |
Paraffin | ||||
Amylase | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrate |
Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrate |
Carbonic anhydrase 19.9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
Caspase-3, cleaved | Rabbit | Cell Signaling | 9961 | Citrate or Trilogy |
CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrate or Trilogy |
CD3 | Rabbit | DAKO | A0452 | Citrate |
CD34 | Mouse | Cell Signaling | 3569 | Citrate |
CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrate |
CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrate |
CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrate |
CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrate |
Chromogranin A | Rabbit | DAKO | A0430 | Citrate |
CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrate |
CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrate |
CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrate |
C-peptide | Rabbit | Cell Signaling | 4593 | Citrate |
Foxp3 | Rat | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrate |
Ghrelin | Goat | Santa Cruz | SC-10386 | |
Ghrelin | Rabbit | Abcam | ab85104 | |
Glucagon | Rabbit | DAKO | A0565 | |
Glucagon | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrate |
Glucagon | Guinea Pig | Bachem | T-5037 | Citrate |
Glut-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogy |
Glut-2 | Rabbit | Santa Cruz | SC-9117 | Not expressed in human islets |
Insulin | Guinea Pig | DAKO | A0564 | |
Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrate |
Mafa | Rabbit | Novus Biological | NB400-137A | Trilogy |
Pancreatic polypeptide | Rabbit | Invitrogen | 18-0043 | Citrate |
Pdx-1 | Guinea Pig | Abcam | ab47308 | Citrate or Trilogy |
Proinsulin | Mouse | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
Proinsulin | Mouse | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Citrate |
Secretagogin | Rabbit | Sigma | HPA 006641 | Citrate |
Smooth muscle actin | Rabbit | Abcam | ab5694 | |
Somatostatin | Rabbit | DAKO | A0566 | |
Synaptophysin | Mouse | DAKO | M0776 | Citrate |
Fresh Frozen | Host species | Vendor | Cat. # | Comments |
CD11b | Rat | Abcam | ab6332 | Fix with 4% PF |
CD11c | Rabbit | Serotec | AHP1226 | |
CD25 | Mouse | Novus Biological | NB 600-564 | Use overnight incubation for paraffin sections |
CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fix with acetone |
GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130569 | Fix with 4% PF |
HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fix with acetone or 4% PF |
Table 2. Primary antibodies.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Aperio Scanscope CS | Aperio | Digital slide scanner | |
DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC stains | |
Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
Leica XL Autostainer | Leica | H&E stains | |
Premium Coverglass | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner software | |
Superfrost Plus slides | FisherScientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment.