שיטת המפלצת הירוקה מאפשרת הרכבה המהירה של מחיקות מרובות מסומנות בחלבון כתב גן קידוד ירוק זרחני. שיטה זו מבוססת על נהיגת זני שמרים במחזורים חוזרים ונשנים של מגוון מיני של מחיקות והעשרה פלואורסצנטי המבוסס של תאים שנשאו יותר מחיקות.
פנוטיפים למחיקת גן לעתים קרובות מתגלים רק כאשר המוטציה נבדקת ברקע גנטי מסוים או 1,2 תנאי הסביבה. ישנן דוגמאות שבו גנים רבים זקוקות למחיקה לחשוף פונקציות גנים נסתרות 3,4. למרות הפוטנציאל לתגליות חשובות, אינטראקציות הקשורים בשלושה או יותר גנים נחקרו במידה רבה. חיפושים הממצים של אינטראקציות מרובות מוטציה יהיו מעשיים בשל המספר העצום של צירופים אפשריים של מחיקות. עם זאת, מחקרים של קבוצות נבחרות של גנים, כגון ערכות של paralogs עם יותר סיכוי מראש של שיתוף פעולה משותפת, יהיו אינפורמטיבי.
בcerevisiae Saccharomyces השמרים, נוקאאוט הגן מושג על ידי החלפת גנים עם סמן בחירה באמצעות רקומבינציה הומולוגית. מכיוון שמספר הסמנים הוא מוגבל, פותחו שיטות להסרה ושימוש חוזר בסם סמן הדואר 5,6,7,8,9,10. עם זאת, ברצף מוטציות רבות הנדסיות באמצעות שיטות אלה הן זמן רב משום שהזמן דרוש ליניארית קשקשים עם מספר המחיקות להיות שנוצר.
כאן אנו מתארים שיטת המפלצת הירוקה להנדסת מחיקות מרובות באופן שגרתי בשמרי 11. בשיטה זו, כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שולב מחיקות משמש לכמותית זני תווית בהתאם למספר של מחיקות כלולות בכל מאמץ (איור 1). סיבובים חוזרים ונשנים של מבחר של GFP-מסומנים מחיקות באמצעות הזדווגות שמרים ומיוזה יחד עם העשרת הזרימה cytometric של זנים נושאים יותר של המחיקות הללו מובילות להצטברות של מחיקות בזנים (איור 2). ביצוע מספר רבים של תהליכים במקבילים, כאשר כל תהליך שילוב מחיקות אחד או יותר בכל סבב, מפחית את הזמן הנדרש לבניית מתח.
תוכן "> הצעד הראשון הוא יכין מוטציות בודדות ההפלואידים כינו 'ProMonsters," כל אחד מהם נושא את כתב ה-GFP במוקד נמחק ואחד' ארגז הכלים 'הלוקוסים-או GMToolkit-המפלצת הירוקה או GMToolkit-α ב . Can1Δ לוקוס (איור 3) שימוש בזנים מאוסף מחיקת שמרי 12, מחיקות GFP-מסומנות יכול להיות שנוצר בנוחות על ידי החלפת KanMX4 הקלטת המשותפת קיימת בזנים אלה עם GFP אוניברסלי – URA3 בר כל GMToolkit מכיל:. או – או α-הזדווגות סוג ספציפי סמן הפלואידים בחירה 1 ובדיוק אחד משני הסמנים ש, כאשר שני GMToolkits נמצא, באופן קולקטיבי מאפשרים בחירה של diploids.הצעד השני הוא לבצע רכיבה המינית שדרכו ניתן לשלב לוקוסי מחיקה בתוך תא בודד על ידי מבחר האקראי ו / או recomb meioticination המלווה כל מחזור של הזדווגות ונביגה.
כפי שפתחנו את גישת המפלצת הירוקה, שהעסקנו אותנו לאפשרות של רקומבינציה בין קלטות החלפת GFP שונות, שהוביל לארגון מחדש הגנום. מקלים נגד האפשרות הזאת הוא הבחירה שלנו לתאים שעברו סבבים רבים של הזדווגות ומיוזה בהצלחה. תאים הנושאים הגנום סודר מחדש צפויים להיות בכושר ירוד לאח…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי חוזה ההגנה האמריקנית המחקר המתקדם פרויקטי סוכנות N66001-12-C-4039 לי"ש, מענק של פ אלפרד סלואן הקרן לRSL, והמוסד אמריקאי הלאומי לבריאות מענקי R01 HG003224 וR21 CA130266 לFPRFPR היה גם נתמך על ידי מלגה מהמכון הקנדי למחקר מתקדם ועל ידי תכנית מחקר כיסאות אקסלנס קנדה.
Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C. |
ClonNAT (nourseothricin) | WERNER BioAgents | 5001000 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C. |
Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C. |
Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
Difco yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291940 | |
Revolver (rotator for tubes) | Labnet | H5600 | |
Enduro Gel XL electrophoresis unit | Labnet | E0160 | |
Sonifier 450 | Branson | 101-063-198 | |
Microtip for Sonifier 450 | Branson | 101-148-062 | |
FACSAria cell sorter | BD | ||
MoFlo cell sorter | Beckman-Coulter | ||
Biomek FX or equivalent robot | Beckman Coulter | Optional. For setting up genotyping PCRs. |