At styre ekspansion af somatiske stamceller er en vigtig faktor hæmmer deres undersøgelse og anvendelse i terapi. Her beskrives et system til tidsmæssigt styre neurale stamceller ekspansion under udvikling og voksenliv, som kan anvendes til at øge antallet af neuroner, der genereres i musehjernen.
Somatiske stamceller kan dele at generere yderligere stamceller (ekspansion) eller mere differentierede celletyper (differentiering), hvilket er af afgørende betydning for vævsdannelse under fosterudviklingen og væv homøostase i voksenalderen 1. I øjeblikket er en stor indsats investeret i retning styre skift af somatiske stamceller fra ekspansion til differentiering, fordi det menes at være grundlæggende for at udvikle nye strategier for regenerativ medicin 1,2. En stor udfordring i undersøgelsen og anvendelse af somatiske stamceller er, at deres ekspansion er blevet vist sig meget vanskeligt at kontrollere.
Her beskriver vi et system, der tillader regulering af neurale stam-/ progenitorceller (helt benævnt NSC) ekspansion i muse embryonale cortex eller den voksne hippocampus ved at manipulere ekspressionen af cdk4/cyclinD1 komplekset, en vigtig regulator af G1-fasen af cellecyklussen og somatiske stamceller differentiation 3,4. Specifikt er to forskellige fremgangsmåder beskrevet af hvilken cdk4/cyclinD1 komplekset er overudtrykt i NSC in vivo. Ved den første fremgangsmåde, er overekspression af cellecyklussen regulatorer opnået ved injektion af plasmider, der koder for cdk4/cyclinD1 i lumen af muse telencephalon efterfulgt af in utero elektroporering til at levere dem til NSC den laterale cortex, således udløser episomal ekspression af transgener 5-8. Ved den anden fremgangsmåde er meget koncentrerede HIV-afledte vira stereotaksisk injiceret i den tandede gyrus i den voksne mus hippocampus således udløser konstitutiv ekspression af cellecyklussen regulatorer efter integration af det virale konstruktion i genomet af inficerede celler 9. Begge tilgange, hvis grundlæggende principper blev allerede beskrevet af andre video-protokoller 10-14, blev her optimeret til i) at reducere vævsskade, ii) målrettede brede dele af meget specifikke hjerne regions, iii) opnåelse af et højt antal manipulerede celler inden for hver region, og iv) udløser høje ekspressionsniveauer af transgenerne i hver celle. Transient overekspression af transgenerne ved hjælp af de to metoder opnås ved forskellige midler dvs naturlige fortynding af elektroporerede plasmider på grund af celledeling eller tamoxifen administration i Cre-udtrykkende NSC inficeret med virus der bærer cdk4/cyclinD1 flankeret af loxP-sites, henholdsvis 9,15 .
Disse metoder giver en meget kraftfuld platform til akut og vævs-specifikt manipulere ekspressionen af et gen i musehjernen. Især, ved at manipulere ekspressionen af cdk4/cyclinD1 komplekset vores system tillader den tidsmæssige styring af NSC ekspansion og deres skift til differentiering, dermed i sidste ende at øge antallet af neuroner, der genereres i pattedyrhjernen. Vores tilgang kan være af afgørende betydning for grundforskning og brug af somatiske stamceller til behandlingaf det mammale centralnervesystem samtidig give en bedre forståelse af i) stamceller bidrag til vævsdannelse under udvikling, ii) væv homøostase i voksenalderen, iii) den rolle, som voksne neurogenese i kognitive funktioner, og måske, iv) bedre anvendelse af somatiske stamceller celler i modeller for neurodegenerative sygdomme.
Et afgørende skridt for in utero elektroporation er kvalitet og renhed af DNA siden retningsbestemt vandring under afgivelse af de elektriske felter afhænger af dens ladning. Protokoller for DNA-oprensning, der ikke inkluderer fjernelse af yderligere ladede molekyler, såsom endotoksiner, kan føre til maskering af de naturlige DNA negative ladninger, der fører til dårlig levering. Det er klart, at røre de uterine vægge med elektroderne så tæt som muligt på det område, der rammes forbedre elektroporation effektivitet. Lige så vigtig er kvaliteten af de elektroder anvendt, da det er af afgørende betydning for opnåelsen af et optimalt elektriske felter. Micro-ridser ikke engang synlige med det blotte øje og / eller organiske rester, såsom spor af serum, lipider, og så videre, vil uundgåeligt akkumuleres over tid fører til elektroder mister deres egenskaber. Gamle og / eller snavset electropes er den mest sandsynlige årsag til et pludseligt fald i elektroporation effektivitet og dermed bør være replaced, så snart dette er bemærket. Mens relativt enkel, i livmoderen elektroporation typisk kræver et par ugers træning for at opnå tilfredsstillende og reproducerbare resultater. Denne teknik er meget alsidigt, da det kan anvendes, næsten på enhver organer og væv i det udviklende embryo. Bestemt, organer indeholdende et hulrum, såsom hjernen, er særligt lette at målrette og muliggøre en høj andel af transficerede celler på grund af den lette indsprøjtning af en relativt stor mængde DNA.
Et almindeligt problem i forbindelse med etablering stereotaksisk viral injektion er at have nogle inficerede celler og / eller til at målrette uønskede områder. Det første problem er hovedsageligt korreleret med injektion af lav titer virus. 293T celler med lavere antal passager i kultur vokse hurtigere og føre til højere virale titre. Anvendelse af celler ældre end ca. 20 passager anbefales ikke og midler til transfektion med mindre end 80% effektivitet vil ikke sikre en godvirusproduktion. Opblanding af det virale pellet er også kritisk, den virale suspension skal vises homogene og virale klumper, der kan tilstoppe kapillarrøret skal undgås. Vira er meget følsomme overfor temperaturen falder og langtidsopbevaring. Af disse grunde skal alikvoter til permanent lagret ved -80 ° C og kan ikke genfryses. Selv under disse betingelser, kan et fald i infektivitet observeres efter 6-12 måneders opbevaring. I de læring faser, foreslår vi at teste den virale titer af hver viral forberedelse og at gøre det igen efter lang tids opbevaring. Tilstedeværelsen af inficerede celler i uønskede områder af hjernen kan afhænge af en suboptimal positionering af muse hoved på stereotaktisk ramme, der kræver lidt øvelse. Desuden er det kritisk for ikke at beskadige overfladen af hjernen ved åbning af hullet på skallen, ellers vil det ikke være muligt at nulstille 0 korrekt på pial overflade, hvilket resulterer i unøjagtig injektion. Koordinaterneat vi i denne protokol henvises til C57/BL6 6-10 uger gamle hunner, og vi foreslår at optimere dem for anden stamme / alder / køn. Erhvervelse af denne teknik kan kræve mere tid end i utero elektroporation på grund af de længere faser, der er nødvendige for at forberede de vira og analysere prøverne. Vi anbefaler kraftigt, at virus kun anvendes efter mus kirurgi og stereotaktisk injektion er blevet pålidelig og reproducerbar. Det første trin til at opnå dette er at injicere celle-gennemtrængelige DNA-farvestoffer, såsom Hoechst 33342, i aflivet mus og analysere hjernerne straks.
I utero elektroporation og stereotaksisk viral injektion er to kraftfulde systemer til akut og væv-specifikt manipulere genekspression i CNS under pattedyr udvikling og voksenlivet. På trods af deres begrænsning i målretning kun en subpopulation af celler, giver disse systemer en hidtil uset hastighed og lethed i forhold til mere konventionelle metoder, jegn særlig arbejdskrævende og tidskrævende generering af transgene mus. Men på trods af denne lighed, eksisterer flere forskelle mellem de to teknikker, der er værd at nævne. Dels med hensyn til målretning af forskellige celletyper, in utero elektroporering oprindeligt fører til transfektion af stamceller egentlige (også kaldet radiale glialceller), fordi disse er de eneste celler, som afgrænser ventriklen hvor DNA'et injiceres. Som et resultat af celledelinger, vil plasmider efterfølgende arvet fra målrettede, mor stamceller til deres stamceller og / eller neuronale datterceller, der fører til en omfordeling af transficerede celler gennem hele cortex som funktion af tiden. I modsætning hertil fører anvendelsen af HIV lentivira i den voksne hjerne at samtidig infektion af hvilken som helst celletype, herunder stamceller, stamceller, neuroner og modne glialceller. Det skal bemærkes, er med hensyn til anvendelse af HIV lentivira i modsætning til mere almindeligt anvendte retrovirus det faktumat lentiviral integration vil forekomme uafhængigt af den mitotiske tilstand af celler, således at den målsøgende også for voksne, hvilende stamceller.
For det andet, en anden vigtig forskel mellem elektroporation og viral infektion er, at en forbigående, episomal ekspression opnås ved den tidligere i modsætning til den irreversible integration af DNA i genomet af inficerede celler opnået ved sidstnævnte. Som følge af på hinanden følgende celledelinger, fortynding af det elektroporerede plasmider, og nedbrydning af den ektopiske cyclinD1 proteinet, opstå ville i hver celle-cyklus. Således blev ekspansion af NSC under embryonisk udvikling vist at kun vare i omkring to dage 15, mens i den voksne hjerne denne effekt viste sig at varer i adskillige måneder (upublicerede resultater).
For det tredje, da i) cdk4/cyclinD1 har en stærkere virkning på celler med en længere G1 og ii) begået neurale stamceller under udvikling har en længere cellecyklusend stamceller, mens det modsatte gælder i voksenalderen, var vores to manipulationer fundet at udløse udvidelsen først og fremmest af neurale stamceller i løbet af udviklings-og stamceller i voksenalderen. I begge tilfælde en forøgelse af neuroner er blevet opnået med begge metoder.
Det fjerde, viral injektion kan let udføres, pålideligt og reproducerbart i mange forskellige regioner af den voksne hjerne ved blot at ændre stereotaxiske koordinater. I modsætning hertil kan præcis målretning af visse områder af centralnervesystemet, såsom hjernestammen, hippocampale dannelse, eller rygmarven, ved in utero elektroporering være vanskeligere at opnå reproducerbart. Selv stereotaktisk injektion kan udføres på mus i alle aldre, er optimal ydelse for in utero elektroporation begrænset fra ca E11 til E16. Trin før E11 ville kræve enten anvendelse af en ultralyd tilbagekastning mikroskop 18,19 eller et helt embryo kultUre-system 17,20.
For nylig er en stigende interesse for basal cellebiologi af somatiske stamceller blevet forfremmet, fordi deres undersøgelse og manipulation menes at være fundamental mod at udvikle nye cellebaserede regenerative behandlinger. Navnlig for overekspression af cdk4/cyclinD1 tilvejebringer vores protokol midlerne til forbigående forøger ekspansion af NSC in vivo (figur 3B og C og 4B og C) for at øge antallet af neuroner, der genereres i den voksne hjerne. Vi mener, at disse manipulation kan være vigtige i en række forskellige sammenhænge for bedre at forstå den rolle, som NSC i hjernens udvikling, evolution og homeostase samt deres bidrag til den kognitive funktion eller nyttiggørelse fra neural degeneration eller skade.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Center for regenerative behandlinger, det medicinske fakultet af TU Dresden, og DFG Collaborative Research Center SFB655 (underprojekt A20). BA blev støttet af et fællesskab af udgravningerne-BB-program, Dresden. Vi takker Drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie, og Ravi Jagasia for værdifulde råd under etableringen af in utero elektroporation og stereotaktisk viral injektion.
Material/equipment | Supplier | Catalog # | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|