שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.
תאי גזע הסומטיים יכולים לחלק להפקת תאי גזע נוספים (רחבה) או סוגי תאים מובחנים יותר (בידול), שהוא יסוד להיווצרות רקמות במהלך התפתחות עוברית והומאוסטזיס רקמות במהלך 1 בגרות. נכון לעכשיו, מאמצים רבים מושקעים לקראת שליטה על המתג של תאי גזע סומטיים מהתרחבות לבידול, כי זה נחשב למהותי לפיתוח אסטרטגיות חדשות ל1,2 הרפואה רגנרטיבית. עם זאת, אתגר גדול במחקר והשימוש בתאי גזע סומטיים הוא שההתרחבות שלהם הוכחה מאוד קשה לשליטה.
כאן אנו מתארים מערכת המאפשרת שליטה בתאי גזע עצביים / מולידו (המכונה לגמרי כלמל"ל) התרחבות בעכבר העוברי הקליפה או היפוקמפוס המבוגר על ידי המניפולציה של הביטוי של cdk4/cyclinD1 המורכב, וסת עיקרי של שלב G1 של מחזור תא סומטי ותאי גזע ההבדלerentiation 3,4. באופן ספציפי, שתי גישות שונות שתוארו על ידי המורכב cdk4/cyclinD1 הוא overexpressed בהמל"ל בגוף חי. לפי הגישה הראשונה, ביטוי יתר של רגולטורי מחזור התא מתקבל על ידי הזרקת פלסמידים קידוד לcdk4/cyclinD1 בחלל telencephalon העכבר ואחריו ברחם electroporation כדי לספק אותם למועצה לביטחון לאומי של הקליפה לרוחב, ובכך, מפעילים ביטוי של episomal transgenes 5-8. לפי הגישה השנייה, וירוסי HIV-derived מרוכזים מאוד מוזרקים stereotaxically ברכס המשונן של ההיפוקמפוס העכבר הבוגר, ובכך, מפעילים ביטוי מכונן של רגולטורי מחזור התא לאחר שילוב של המבנה הנגיפי בגנום של תאים נגועים 9. שני גישות, שהעקרונות בסיסיים כבר תוארו על ידי פרוטוקולי וידאו אחרים 10-14, היו כאן אופטימיזציה לט) להפחית ניזק לרקמות, ב) חלקים רחבים היעד של המוח Regio מאוד ספציפיns, ג) להשיג מספרים גבוהים של תאי מניפולציות בכל אזור, וiv) לעורר רמות ביטוי גבוהה של הגנים המושתלים בתוך כל תא. ביטוי יתר זמני בtransgenes באמצעות שתי הגישות מתקבל על ידי אמצעים שונים כלומר בדילול טבעי של פלסמידים electroporated בשל חלוקת תא או טמוקסיפן ממשל בCre-לבטא המל"ל נגוע בוירוסים שנשאו cdk4/cyclinD1 מוקפים אתרי loxP, בהתאמה 9,15 .
שיטות אלו מספקות פלטפורמה חזקה מאוד בחריפות ורקמות במיוחד כדי לתפעל את הביטוי של כל גן במוח העכבר. בפרט, על ידי המניפולציה של הביטוי של cdk4/cyclinD1 המורכב, המערכת שלנו מאפשרת שליטה הזמנית של התרחבות המל"ל ומתגם לבידול, ובכך, סופו של דבר להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח של היונקים. הגישה שלנו עשויה להיות חשיבות מכרעת למחקר בסיסי ושימוש בתאי גזע הסומטיים לטיפולשל מערכת העצבים המרכזית של היונקים, תוך מתן הבנה טובה יותר שלי) נובע תרומת תא ליצירת רקמה במהלך הפיתוח, ii) הומאוסטזיס רקמות במהלך הבגרות, ג) תפקיד של neurogenesis מבוגר בתפקודים קוגניטיביים, ואולי, ד) הטוב יותר באמצעות סומטי גזע תאים במודלים של מחלות ניווניות.
צעד קריטי לרחם electroporation הוא האיכות והטוהר של ה-DNA מאז ההגירה כיוונית במהלך הלידה של השדות החשמליים תלויה במטען שלה. פרוטוקולים לטיהור DNA שאינו כוללים הסרה של מולקולות טעונות נוספות, כגון endotoxins, עלולים להוביל למיסוך של המטענים השליליים DNA הטבעיים המובילים לאספקה לקויה. ברור, לגעת בקירות הרחם עם האלקטרודות הקרובה ככל האפשר לאזור על מנת להיות ממוקד ישפר את יעילות electroporation. לא פחות חשוב היא האיכות של אלקטרודות המשמשות מאז הזה הוא יסוד לאספקה של שדות חשמליים אופטימליים. מייקרו סריטות אפילו לא נראים לעין בעין ו / או שאריות אורגניות, כגון עקבות של סרום, שומנים, וכן הלאה, באופן בלתי נמנעות מצטברות לאורך זמן מובילה לאלקטרודות לאבד את הנכסים שלהם. electropes הישן ו / או מלוכלך היא הסיבה הסבירה ביותר של ירידה פתאומית ביעילות electroporation, ולכן, צריך להיות replaced בהקדם זה הוא שם לב. אמנם פשוט יחסית, ברחם electroporation מחייב בדרך כלל כמה שבועות של אימונים על מנת להשיג תוצאות משביעות רצון ולשעתק. טכניקה זו היא מאוד תכליתית שכן הוא יכול להיות מיושם, כמעט, לכל איבר ורקמה של העובר המתפתח. אין ספק, איברים המכילים חלל, כגון מוח, במיוחד קלים למקד ולאפשר לשיעור גבוה של תאי transfected בשל ההקלות של הזרקת נפח גדול יחסית של ה-DNA.
בעיה נפוצה נתקלה בהקמת הזרקה נגיפית stereotaxic היא שיש כמה תאים נגועים ו / או להתמקד באזורים לא רצויים. הבעיה הראשונה קשורה בעיקר עם ההזרקה של נגיפי כייל נמוך. תאי 293T עם מספר נמוך יותר של מעברים בתרבות לצמוח מהר יותר ולהוביל לtiters הנגיפי הגבוה יותר. שימוש בתאים מבוגרים יותר CA. 20 קטעים אינם מומלצים ואמצעי transfection עם יעילות% פחות מ 80 לא יבטיח טובייצור נגיפי. Resuspension של גלולת ויראלי הוא גם קריטי, ההשעיה הנגיפית יש להופיע גושים הומוגניים ויראלית שיכול לחסום את הנימים צריכות להימנע. וירוסים רגישים מאוד לטמפרטורה יורדת ואחסון לטווח ארוך. מסיבה זו, aliquots צריך להיות מאוחסן באופן קבוע ב-80 מעלות צלזיוס, ולא יכול להיות refrozen. גם בתנאים אלה, ירידה בinfectivity יכולה להיבחן לאחר 6-12 חודשים של אחסון. בשלבי הלמידה, אנו ממליצים לבדוק את כייל הנגיף של כל הכנה נגיפית ולעשות אותו שוב לאחר אחסון ארוך טווח. הנוכחות של תאים נגועים באזורים לא רצויים של המוח יכולה להיות תלויה במיקום אופטימלי של ראש העכבר על מסגרת stereotaxic, שדורשת קצת תרגול. בנוסף, חשוב שלא לפגוע בשטח של המוח בעת פתיחת החור בגולגולת כי אחר זה לא יהיה אפשרי לאפס 0 כראוי על פני שטח pial, וכתוצאה מההזרקה לא מדויקת. הקואורדינטותשנקבענו בפרוטוקול זה נקרא C57/BL6 6-10 שבועות נקבות זקנות ומומלץ לבצע אופטימיזציה שלהם למתח / גיל / מין שונה. רכישה של טכניקה זו עשויה לדרוש זמן רב יותר מאשר ברחם electroporation בשל השלבים הארוכים יותר הדרושים כדי להכין את הווירוסים ולנתח את הדגימות. אנו ממליצים בחום שוירוסים נמצאים בשימוש רק לאחר ניתוח עכבר והזרקת stereotaxic הפכו אמין לשחזור. הצעד הראשון להשגת מטרה זו הוא להזריק צבעי התא permeant DNA, כגון Hoechst 33342, בעכברים מורדמים ולנתח את מוחם באופן מיידי.
בelectroporation הרחם והזרקה נגיפית stereotaxic שתי מערכות חשובות לחריפות ורקמות ספציפיות לתפעל ביטוי גנים בתוך מערכת העצבים המרכזיים בפיתוח ובבגרות של יונקים. למרות מגבלתם במיקוד רק תת אוכלוסיות של תאים, מערכות אלו מספקות מהירות חסרות תקדים וקל בהשוואה לשיטות קונבנציונליות יותר, אניn בפרט דור הרב המפרך וזמן של עכברים הטרנסגניים. עם זאת, למרות דמיון זה, כמה הבדלים קיימים בין שתי טכניקות שראויות לאזכור. ראשית, בכל קשורים למיקוד של תאים מסוגים שונים, ברחם electroporation תחילה מוביל לtransfection של תאי גזע תקינים (הנקרא גם תאי גלייה רדיאלי), כי אלה הם התאים היחידים התוחמים את החדר שבו את ה-DNA מוזרק. כתוצאה של חלוקות, פלסמידים יהיו לאחר מכן לעבור בתורשה מאם, תאי גזע ממוקד למולידם ו / או תאי בת עצביות שהובילו לחלוקה מחדש של תאי transfected לאורך הקליפה כפונקציה של זמן. בניגוד לכך, השימוש בlentiviruses HIV במוח הבוגר מוביל לזיהום סימולטני של כל סוג תא כוללים תאי גזע, את אבות, הנוירונים כמו גם תאי גלייה בוגרים. מן ראוי לציין כי בכל קשור לשימוש בlentiviruses HIV בניגוד לרטרווירוסים נפוצים ביותר היא העובדהכי שילוב lentiviral יתרחש באופן עצמאי מהמדינה המיטוטי של תאים, ובכך מאפשר גם המיקוד של בוגרי תאים רדומים גזע.
שנית, עוד הבדל חשוב בין electroporation ודלקת הנגיפית הוא שביטוי חולף, episomal מושג על ידי לשעבר בניגוד לשילוב בלתי ההפיך של ה-DNA בגנום של תאים נגועים הושגו על ידו. כתוצאה מחטיבות רצופות סלולריים, דילול של פלסמידים electroporated, והשפלה של cyclinD1 החלבון מחוץ לרחם, הייתי להתחולל בכל מחזור תא. לפיכך, הרחבת המל"ל במהלך התפתחות עוברית הוצגה רק לאחרונה במשך כשני ימים אחרונים 15 ואילו במוח הבוגר השפעה זו נמצאה נמשכת כמה חודשים (תוצאות לא פורסמו).
שלישית, מאז ש) cdk4/cyclinD1 יש השפעה חזקה על תאים עם G1 ועוד ii) אבות עצביים שבוצעו במהלך פיתוח יש עוד מחזור תאמתאי גזע ואילו ההפך נכון בבגרות, שתי המניפולציות נמצאו כדי לעורר את ההתפשטות, בעיקר, מאבות עצביים במהלך פיתוח תאי גזע ותקופת הבגרות. בכל מקרה עלייה בנוירונים הושגה על ידי שתי השיטות.
הזריקה רביעית, נגיפית קלות ניתן לבצע באופן אמין וreproducibly, באזורים שונים של המוח הבוגר, פשוט על ידי שינוי קואורדינטות stereotaxic. לעומת זאת, מיקוד מדויק של אזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית, כגון גזע מוח, היווצרות היפוקמפוס, או בחוט שדרה, על ידי בelectroporation הרחם עלול להיות קשה יותר להשגת reproducibly. יתר על כן, בעוד שניתן לבצע הזרקת stereotaxic בעכברים בכל גיל, ביצועים אופטימליים של electroporation ברחם הנו מוגבלים מעל E11 לE16. שלבים שקדם לE11 יחייבו גם השימוש במיקרוסקופ backscatter אולטרסאונד 18,19 או פולחן עובר שלםמערכת יור 17,20.
לאחרונה, עניין גובר בביולוגיה של תא בסיסית של תאי גזע סומטיים כבר קדם כי המחקר והמניפולציה שלהם נחשבים למהותיים לקראת פיתוח טיפולי התחדשות מבוססי תאים חדשים. במיוחד לביטוי יתר של cdk4/cyclinD1, הפרוטוקול שלנו מספק את האמצעים להגברת transitorily הרחבת המל"ל בvivo (האיור 3B ו-C ו4B ו-C) על מנת להגדיל את מספר תאי עצב שנוצרים במוח הבוגר. אנו מאמינים כי מניפולציה אלה עשויות להיות חשובה בכמה הקשרים שונים כדי להבין טוב יותר את תפקידו של המל"ל במוח התפתחות, אבולוציה והומאוסטזיס כמו גם תרומתם לפונקציה או התאוששות מניוון או פגיעה עצבי הקוגניטיבית.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז לטיפולי משובים, פקולטה לרפואה של TU דרזדן, וDFG השיתופי מרכז המחקר SFB655 (A20 subproject). התואר ראשון נתמך על ידי מלגה של תכנית חפירות-BB, דרזדן. אנו מודים לבני זוג. נוריקו Osumi, טאדאשי נומורה, שקר Chichung דיטר, וראבי Jagasia עצה יקרה בהקמה ברחם electroporation והזרקה נגיפית stereotaxic.
Material/equipment | Supplier | Catalog # | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|