Summary
שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.
Abstract
תאי גזע הסומטיים יכולים לחלק להפקת תאי גזע נוספים (רחבה) או סוגי תאים מובחנים יותר (בידול), שהוא יסוד להיווצרות רקמות במהלך התפתחות עוברית והומאוסטזיס רקמות במהלך 1 בגרות. נכון לעכשיו, מאמצים רבים מושקעים לקראת שליטה על המתג של תאי גזע סומטיים מהתרחבות לבידול, כי זה נחשב למהותי לפיתוח אסטרטגיות חדשות ל1,2 הרפואה רגנרטיבית. עם זאת, אתגר גדול במחקר והשימוש בתאי גזע סומטיים הוא שההתרחבות שלהם הוכחה מאוד קשה לשליטה.
כאן אנו מתארים מערכת המאפשרת שליטה בתאי גזע עצביים / מולידו (המכונה לגמרי כלמל"ל) התרחבות בעכבר העוברי הקליפה או היפוקמפוס המבוגר על ידי המניפולציה של הביטוי של cdk4/cyclinD1 המורכב, וסת עיקרי של שלב G1 של מחזור תא סומטי ותאי גזע ההבדלerentiation 3,4. באופן ספציפי, שתי גישות שונות שתוארו על ידי המורכב cdk4/cyclinD1 הוא overexpressed בהמל"ל בגוף חי. לפי הגישה הראשונה, ביטוי יתר של רגולטורי מחזור התא מתקבל על ידי הזרקת פלסמידים קידוד לcdk4/cyclinD1 בחלל telencephalon העכבר ואחריו ברחם electroporation כדי לספק אותם למועצה לביטחון לאומי של הקליפה לרוחב, ובכך, מפעילים ביטוי של episomal transgenes 5-8. לפי הגישה השנייה, וירוסי HIV-derived מרוכזים מאוד מוזרקים stereotaxically ברכס המשונן של ההיפוקמפוס העכבר הבוגר, ובכך, מפעילים ביטוי מכונן של רגולטורי מחזור התא לאחר שילוב של המבנה הנגיפי בגנום של תאים נגועים 9. שני גישות, שהעקרונות בסיסיים כבר תוארו על ידי פרוטוקולי וידאו אחרים 10-14, היו כאן אופטימיזציה לט) להפחית ניזק לרקמות, ב) חלקים רחבים היעד של המוח Regio מאוד ספציפיns, ג) להשיג מספרים גבוהים של תאי מניפולציות בכל אזור, וiv) לעורר רמות ביטוי גבוהה של הגנים המושתלים בתוך כל תא. ביטוי יתר זמני בtransgenes באמצעות שתי הגישות מתקבל על ידי אמצעים שונים כלומר בדילול טבעי של פלסמידים electroporated בשל חלוקת תא או טמוקסיפן ממשל בCre-לבטא המל"ל נגוע בוירוסים שנשאו cdk4/cyclinD1 מוקפים אתרי loxP, בהתאמה 9,15 .
שיטות אלו מספקות פלטפורמה חזקה מאוד בחריפות ורקמות במיוחד כדי לתפעל את הביטוי של כל גן במוח העכבר. בפרט, על ידי המניפולציה של הביטוי של cdk4/cyclinD1 המורכב, המערכת שלנו מאפשרת שליטה הזמנית של התרחבות המל"ל ומתגם לבידול, ובכך, סופו של דבר להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח של היונקים. הגישה שלנו עשויה להיות חשיבות מכרעת למחקר בסיסי ושימוש בתאי גזע הסומטיים לטיפולשל מערכת העצבים המרכזית של היונקים, תוך מתן הבנה טובה יותר שלי) נובע תרומת תא ליצירת רקמה במהלך הפיתוח, ii) הומאוסטזיס רקמות במהלך הבגרות, ג) תפקיד של neurogenesis מבוגר בתפקודים קוגניטיביים, ואולי, ד) הטוב יותר באמצעות סומטי גזע תאים במודלים של מחלות ניווניות.
Protocol
צליל מקדים
ניתוח חייב להתבצע על ידי חוקרים באופן מלא מאומנים עם אישור מהרשויות המקומיות לרווחת בעלי חיים. כל אמצעי הזהירות יש לנקוט כדי למזער את הכאב ולחץ שנגרם לבעל חיים הכולל הרדמה עמוקה, ממשל של שיכוך כאבים לאחר ניתוח, ועל פעולות שנמשכות יותר מ 10 דקות, יישום של חומר סיכת עין כדי למנוע התייבשות ועיוורון של קרנית. עכברים מורדמים חייבים להישמר כל זמן חם על 37 מעלות צלזיוס עד להחלמה מלאה וכל כלי ניתוח ופתרון צריכה להיות סטרילי. למרות שהשימוש במכסת מנוע ביולוגית הוא לא הכרחי, המפעיל חייב לנקוט את כל האמצעים הסבירים כדי למזער את האפשרות של הדבקת בעלי החיים במהלך המבצע על ידי לבוש בחלוק מעבדה, מסכה, וכפפות. בדומה לכך, כל צעד הנוגע לדור ושימוש בוירוסים חייב להיות מורשה וחייב להתבצע באזורי S2 על פי ההתקנות של הרשויות המקומיות.לבסוף, טיהור יסודית של כל הכלים והמשטחים שהיו יכול להיות במגע עם וירוסים חייבת להתבצע על פי נהלי חיטוי מתקן מאושר (ל-HIV על ידי ניגוב עם 70% ET-OH ו / או מעוקרים).
חלק 1: הרחבה העוברית המל"ל
1. ברחם electroporation
- לאחר שיבוט הגנים המושתלים (כלומר cdk4/cyclinD1) בpCMS-EGFP (Clontech) או וקטורי pDSV-mRFPnls 16, לטהר את פלסמידים באמצעות EndoFree הערכה וresuspend ב PBS סטרילי לריכוז של 3-5 מיקרוגרם / μl. בקרוב לפני הניתוח, לערבב את פלסמידים עם 0.05% FastGreen ב PBS ביחס סופי של CA. 04:04:01 וחובצה את התערובת במשך 2 דקות ב16000 XG כדי להסיר את כל משקעים.
- טען את תערובת דנ"א לכוס ורוסיליקט משכה בעבר נימים. פרמטרים מושכים באמצעות P-97 פיפטה חולץ הם: משיכה: 200; vel: 140; זמן: 140. חום ניתן על ידי בדיקת רמפה ותלוי במפרטהרבה ific של נימי דם בשימוש. הר הנימים בנחיר של PicoPump כי הוא קרוב לפלטפורמת electroporation רחם (איור 1 א), ותחת stereomicroscope, לכופף קצו וכינויו בנקודת הפיתול.
- לעקר את כל כלי הניתוח במעקר חרוז זכוכית יבשה ועמוק להרדים עכבר בהריון ביום 12-15 להריון באמצעות מכשיר אידוי isoflurane. הנח את החיה במצב שכיבה על פלטפורמת חימום נקבע על 37 מעלות צלזיוס ולשמור תחת ממשל isoflurane קבוע באמצעות חרטום.
- לגלח את העור של הבטן, לחטא עם מספר רבות של פעמי Betaisodona, סופו של דבר בניגוב בין עם אתנול 70%, ולהזריק עצירות (בדילול ב PBS) תת עורי ברמה של 0.1 מ"ג / קילו ריכוז כמשכך כאבים מקדימים. בעזרת מספריים עדינים, לעשות חתך 2 סנטימטר אורך של העור, ולאחר מכן, של הדופן השרירי הבסיסי לגשת לחלל הצפק. לוותר בca חלל הצפק. 2מ"ל של IUE פתרון (D-PBS המכיל 100 U / מ"ל של עט / סטרפטוקוקוס) prewarmed על 37 המעלות צלזיוס ולשמור על הפתרון בבלוק חימום.
- לכסות את העכבר עם drap סטרילי המכיל סדק שממנו יוסרו הרחמים. לחזור בו החתך באמצעות מפשק טונגסטן, לזהות את הרחם ולשלוף אותו מחזיק אותו עם מלקחיים בין עוברים סמוכים (האיור 1B; שמאל) ולבסוף מניח אותו על drap סטרילי. במהלך כל המבצע, יש לשטוף את הרחם עם פתרון IUE ללחות חלל איבר ואת הגוף ולמנוע התייבשות של בעל החיים.
- טפל ברחם מחזיק אותו בזהירות בין אגודל ואצבע מורה ולהפוך עובר אחד עד שהראש שלו גלוי ומכוון למפעיל. זהה את ההמיספרות telencephalic ולהזריק אחד מהם מהצד dorso הצדדי. שחרר 1-2 μl של פתרון ה-DNA באמצעות footswitch של PicoPump עד החלל מתואר על ידי FastGreen (התרשים 1B; ימין).
- כאשר כל העוברים מוזרקים וelectroporated, הנח את הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן ולסגור את הקירות השריריים עם מחרוזת תפר תפירה כל מ"מ 3-4. את הקשרים צריכים להיות הדוקים לשריר אבל לא חזק מדי כדי לאפשר לנפיחות קטנות של הרקמה. לבסוף, לסגור את העור שמעליה באמצעות קטעי מתכת. לחטא את העור עם Betaisodona, הסר את העכבר ממסיכת isoflurane ולהעביר אותו בכלוב דיור כאשר ער לחלוטין. לפקח על ההתאוששות של העכבר, עד שההתנהגות של תנועה היא נורמלית.
2. עיבוד של סםple
- אחד או יותר ימים לאחר electroporation, להקריב את העכבר, לאסוף את העוברים ולזהות את אלה electroporated כראוי באמצעות stereomicroscope ניאון (1D איור). לנתח את מוחם על PBS קר כקרח, ולתקן אותם בלילה ב4% PFA (paraformaldehyde בחומציות חיץ פוספט 7.4). סופו של דבר, BrdU יכול להינתן לפני ההקרבה פי פרדיגמות שונות כדי לחקור קינטיקה מחזור התא וחלוקה של תאי 3.
- המוחין אז מעובדים לתבתרו וimmunostaining לכמה סמנים של גליה רדיאלי, את האבות ונוירונים (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 וכו ') basal כדי להעריך את השפעתם של הגנים המושתלים התפקודיים במל"ל הממוקדת וצאצאיהם שהם זוהה על ידי הביטוי של גן כתב השיתוף electroporated.
איור 1.בelectroporation הרחם. () ייצוג סכמטי של בפלטפורמת electroporation רחם. (ב) רישומים המראים את המיקום של העכבר להריון במהלך הניתוח (מימין) והזרקה של DNA / FastGreen התערובת (כחול) בחצי כדור telencephalic של עובר עכבר (משמאל). (ג) תכנית המראה את המיקום של אלקטרודות במגע עם קירות הרחם עם האנודה (+) סמוך לאתר של הזרקה (כחול). חיצים מעידים על ההגירה של ה-DNA לאנודה. (ד) תמונה של 24 שעות לאחר electroporation עבר עכבר עם פלסמידים GFP ביום עוברי 13. קו מקווקו תוחם את אונת telencephalic. תכנית בשונה מCalegari et al., 2004 17.
חלק 2: הרחבת המבוגרים המל"ל
1. ייצור של HIV נגזרת חלקיקים נגיפיים
- יום 1: צלחת 5 X 10 6 תאים 293T על 10 סנטימטריםצלחת עם 8 מ"ל של D-MEM המכיל 10% של סרום עוברי מומת חום שור ו100 U / מ"ל של עט / סטרפטוקוקוס (תרבות בינונית). השתמש 15 מנות להכנה ותרבות הלילה נגיפית 1 על 37 המעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- יום 2: לכל מנה, לדלל ב1 מ"ל של 5 מיקרוגרם הרגיל D-MEM של כל אחד מ3 פלסמידים קידוד עבור i) חלבון VSVG (סוג הווירוס stomatitis שלפוחי G) מעטפה, ii) איסור פרסום / pol (אנטיגן / פולימראז ספציפי קבוצה) , וג) polycistronic לבנות להביע את transgenes הפונקציונלי וכתב (כלומר cdk4/cyclinD1/GFP) המשובט בעבר בוקטור העברת איידס מבוסס (p6NST90) 9. מערבב את הפתרון הזה עם 1 מ"ל של D-MEM המכיל 45 μl של polyethylenimine כי כבר פזר מראש ב PBS ב1 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות, ודגירה במשך 15-30 דקות בטמפרטורת חדר. בינתיים, להסיר את המדיה מהתאים ולהוסיף 4 מ"ל למנה של טרי D-MEM המכילה 15% בסרום שור עובר מומת חום ו100 U / מ"ל של עט / סטרפטוקוקוס. הוסף 2 מ 'מערבל תערובת transfection ולילה התרבות.
- יום 3: להוסיף 120 μl של 500 מ"מ Na-וטיראט לצלחת כדי לשפר את הביטוי של הגנים המושתלים, מערבב בעדינות והתרבות במשך 6-8 שעות לאחר שיחליף את מדיום transfection עם 5 מ"ל של מדיום התרבות.
- יום 4: לאסוף את supernatants (70 מ"ל סה"כ בקירוב), לעבור דרך מסנן 0.22 מיקרומטר והעברה ב2 צינורות צנטריפוגות polyallomer (35 x 89 מ"מ). Ultracentrifuge ב110.000 XG עבור 90 דקות ב 4 ° C באמצעות הרוטור נדנדה. בטל supernatant, להוסיף 6 מ"ל של PBS לכל צינור ולדגור על קרח למשך שעה 1. Resuspend הגלולה ולהעביר אותו בצינור צנטריפוגה polyallomer 1 (14 מ"מ x 95). Ultracentrifuge ב110.000 XG עבור 90 דקות ב 4 ° C באמצעות הרוטור נדנדה. בטל supernatant, resuspend גלול ב 50 μl של PBS, להפוך 5 aliquots וחנויות μl ב -80 ° C. כייל נגיפי יהיה בטווח של 10 8 -10 9 CFU / מ"ל. (הערה: וירוסים רגישים מאוד לטמפרטורה והאחסון, AVOid מחדש הקפאה, לשמור על קרח יבש במהלך ההובלה ולהפשיר מהר לפני השימוש.)
2. הזרקת Stereotaxic
- הרדם עכבר 6-10 שבועות ישן עם isoflurane ולמקם את החיה בתנוחת שכיבה על מסגרת stereotaxic (איור 2 א) שימוש בברי האוזניים ותמיכת החיך לתקן את הראש כמו שצריך. החיה נשמרה חם על כרית חימום נקבע על 37 מעלות צלזיוס ותחת ממשל isoflurane קבוע.
- להזריק 100 μl של פתרון עובד עצירות כמשכך כאבים מנע תת עורי, להתגלח פס של עור על ראשו של העכבר, וכפי שמתואר בdesinfect 1.4. באמצעות אזמל, להפוך את CA. 1.5 סנטימטרי חתך אורכים ארוכים על עור הראש וחושף את הגולגולת ברמה של תפר sagittal. לחזור בו את העור בעדינות ולנקות את משטח העצם עם מקלון צמר גפן סטרילי.
- חצי למלא כוס נימים (מפרט ב1.2) עם שמן פרפין ולעלות אותו על משאבת הזרקת החדרההנימים עד הטבעת השנייה (איור 2 ב '). הזז את הבעל בנימי X, Y ו Z הציר עד קצה הנימים ממוקם על גבחת, נקודת חיבור בין תפרי sagittal והרוחביים (האיור 2C) (שייקבע בסיוע stereomicroscope), ו להגדיר מחדש את x, y, z וערכים ל 0.
- הזז את הנימים ידי ± 1.6 מ"מ בציר Medio-הרוחב (x) ו-1.9 מ"מ בציר קדמי, האחורי (Y) ולסמן את העצם באמצעות עט סימון כירורגית. לעשות חור של CA. 0.5 קוטר מ"מ בגולגולת באמצעות קודח חשמלי לשים לב שלא לפגוע במוח.
- שים טיפת 5 μl של השעיה נגיפית (aliquot 1) על פיסת parafilm הונחה על סורגי האוזן ותשקיע את הקצה של הנימים בטיפה. תמצוץ CA. 3.5 μl של השעית ויראלי באמצעות מזרק nanoliter להגדיר ב 55 nl / sec. ביצוע שלב זה במהירות כמו האגל יתאדה.
- הזז את הנימים לאתר oהזרקת F ולהזיז אותו כלפי מטה עד הקצה נוגע במשטח pial. אפס את ערך ציר dorso-הגחון (z) 0. בשלב זה, לחדור לרקמות עם הנימים ל-1.9 מ"מ ולשחרר 1.5 μl של השעיה נגיפית בשיעור של 4 nl / sec. חכה 2-3 דקות כדי למזער את הזרימה החוזרת של שוקת השעיה נגיפית מסלול הנימים וחוזרים בו נימים. זריקה שנייה ניתנת לביצוע בחץ כדור controlateral.
- לתפור את העור, לחטא, ולאפשר החיה להתאושש מהרדמה כפי שתואר בעבר עבור ברחם electroporation (1.8).
איור 2. הזרקה נגיפית Stereotaxic. (A ו-B) ייצוג סכמטי של המרכיבים הדרושים לביצוע הזרקת stereotaxic () ובעל נימים מפורקות מראה את הכניסה של capillary עד הטבעת השנייה (B). (ג) תמונה של ראש העכבר המשותק על ידי ברי האוזן ותמיכת חיך עם העור נחתכה כדי לחשוף את הגולגולת (משמאל). הגדלה של התיבה המקווקות (מימין) מציגה את התפרים הרוחביים וsagittal, גבחת, והאתר של הזרקה (המעגל).
3. עיבוד של המדגם
- אחת לשלושה שבועות לאחר ההדבקה, תנקב את העכבר עם CA. 100 מ"ל של 4% PFA, לנתח את המוח ולפרסם-לתקן את זה בלילה ב4% PFA. סופו של דבר, BrdU ו / או טמוקסיפן יכול להינתן לפני ההקרבה פי פרדיגמות שונות כדי לחקור קינטיקה מחזור התא ולהפסיק את הביטוי של הגנים המושתלים הנגיפיים המוקפים אתרי loxP, בהתאמה 9.
- המוח אז יכול להיות מעובד לimmunostaining באמצעות מספר סמנים של גזע ותאים ונוירונים (למשל Sox2, GFAP, Nestin, Tbr2, doublecortin, וכו ') את האבות.
Representative Results
- בסך הכל, ברחם electroporation מניב 60-80% מעוברי electroporated מציגים ביטוי חזק של גן הכתב באזור רחב של הקליפה לרוחב (איור 3 א). חלבוני ניאון ניתן לאתר בקלות בעוברי הר שלמים בהקדם 3-6 שעות לאחר ניתוח עם האות שנמשך יותר משבוע אחד. בתוך אזור המיקוד, על 30-50% מתאים בדרך כלל להביע transgene (הים) בשיעור של תאים מבטאים שיתוף ושתיים (או יותר) transgenes השיתוף electroporated להיות בדרך כלל מעל 90% (איור 3B, משמאל) 6,8 , בן 15. בעוד רמה מינימאלית של אפופטוזיס (2.0-2.5% בקירוב) יכולה להיות שנצפתה לאחר כ 2 שעות מelectroporation, ערך זה יהיה לחזור לרמות פיסיולוגיות (0.5-1.0% בקירוב) אחרי בערך 6 שעות (FC, נתונים שלא פורסמו). שיעור עוברים או עכברים הרה למות עקב הניתוח הוא בדרך כלל זניח (<5%). שיתוף עם electroporation cdk4/cyclinD1 בתנאים אלה ואחרי 48 שעות של פיתוח גורמת לעלייה בהתרחבות של אב עצבי על ידי 30% (איור 3B, מימין, ו-C) 15.
איור 3. הרחבת אבות עצביים על ידי cdk4/cyclinD1 ביטוי יתר. () תמונת קרינה של סעיף דרך הקליפה הרוחבית של עובר עכבר 24 שעות לאחר electroporation עם פלסמידים GFP וRFP ביום עוברי 13. (ב) תמונות פלורסנט כמו ב48 שעות לאחר electroporation שיתוף עם פלסמידים וimmunolabeling cdk4/GFP וcyclinD1/RFP עבור סמן מוליד הבזליים Tbr2. כתבי ניאון עם DAPI counterstainig (משמאל) וTbr2 (מימין) מוצגים. קווים מציינים משטח הפסגה של אזור חדרית (VZ; קו לבן) ואת גבולות אזור subventricular (SVZ; קווים מקווקווים צהובים). שים לב המוגבר thickness של SVZ בחלק electroporated של קליפת המוח (ראשי חץ לבנים) בשל דור ורחבה של אבות הבזליים לאחר ביטוי יתר של cdk4/cyclinD1 גדל. (ג) כימות ההשפעה שמוצגות בארים ב = SD, p <0.05, n = 3. גרף עמודות ב-C נלקח מנגה et al., 2009 15.
- לאחר ההזרקה נגיפית stereotaxic, CA. 80% מעכברים שפעלו להציג ביטוי חזק של transgenes לאורך הרכס המשונן כולו. ביטוי מכונן של GFP ניתן לאתר בקלות על 40 סעיפי מיקרומטר ההקדם 4 ימים לאחר ניתוח. לאורך הציר מקורי לזנב של gyrus המשוננת, על 10-30% מתאים (שווה ערך לסך של CA. 10,000-30,000 תאים) בדרך כלל להביע transgene (הים) (איור 4 א) 9. חלקם של עכברים מתים עקב הניתוח הוא זניח (<5%). ביטוי יתר של שלושה שבועות cdk4/cyclinD1 בתנאים אלה מעורר עלייה במל"ל על ידי מעל שתיקפלים (איור 4B) תוך הפחתת neurogenesis ידי 70% (האיור 4C) 9.
איור 4. השפעות של זיהום ויראלי. () שיקום 3D של 7 תמונות שנלקחו מקרינת 40 מיקרומטר קטעי עטרה סידוריים עבים (איסוף 1 כל 6) לאורך הציר מקורי לזנב של ההיפוקמפוס. ה-GFP + תאים נגועים (ירוק) וצביעת DAPI גרעינית (כחול) של gyrus המשוננת מוצגים (למעלה). תמונות שדה בהירות של החטיבות המקבילות לאלו המוצגים ב( באמצע) וייצוג 3D (תחתון) של אונת המוח השלמה עם ההיפוקמפוס מודגש בירוק pseudocolor (שונים ממוח אלן האטלס; עטרת www.brain-map.org) . חצים לבנים להצביע במקום הזרקה. רוחב (L), מקורי (R), ודורצירי סאל (ד) (x, y, z וstereotaxic קואורדינטות) המסומן (מימין). פרופורציה (B ו-C) של nestin + המל"ל (B) וDCX + נוירונים יילוד (C) בתוך האוכלוסייה של ה-GFP + תאים נגועים 3 שבועות לאחר הזרקת stereotaxic של ה-GFP (לבן) או cdk4/cyclinD1/GFP וירוסים (שחור). ברים = SD, p <0.005, n = 3. גרפים בB ו-C שנלקחו מArtegiani et al., 2011.
Discussion
צעד קריטי לרחם electroporation הוא האיכות והטוהר של ה-DNA מאז ההגירה כיוונית במהלך הלידה של השדות החשמליים תלויה במטען שלה. פרוטוקולים לטיהור DNA שאינו כוללים הסרה של מולקולות טעונות נוספות, כגון endotoxins, עלולים להוביל למיסוך של המטענים השליליים DNA הטבעיים המובילים לאספקה לקויה. ברור, לגעת בקירות הרחם עם האלקטרודות הקרובה ככל האפשר לאזור על מנת להיות ממוקד ישפר את יעילות electroporation. לא פחות חשוב היא האיכות של אלקטרודות המשמשות מאז הזה הוא יסוד לאספקה של שדות חשמליים אופטימליים. מייקרו סריטות אפילו לא נראים לעין בעין ו / או שאריות אורגניות, כגון עקבות של סרום, שומנים, וכן הלאה, באופן בלתי נמנעות מצטברות לאורך זמן מובילה לאלקטרודות לאבד את הנכסים שלהם. electropes הישן ו / או מלוכלך היא הסיבה הסבירה ביותר של ירידה פתאומית ביעילות electroporation, ולכן, צריך להיות replaced בהקדם זה הוא שם לב. אמנם פשוט יחסית, ברחם electroporation מחייב בדרך כלל כמה שבועות של אימונים על מנת להשיג תוצאות משביעות רצון ולשעתק. טכניקה זו היא מאוד תכליתית שכן הוא יכול להיות מיושם, כמעט, לכל איבר ורקמה של העובר המתפתח. אין ספק, איברים המכילים חלל, כגון מוח, במיוחד קלים למקד ולאפשר לשיעור גבוה של תאי transfected בשל ההקלות של הזרקת נפח גדול יחסית של ה-DNA.
בעיה נפוצה נתקלה בהקמת הזרקה נגיפית stereotaxic היא שיש כמה תאים נגועים ו / או להתמקד באזורים לא רצויים. הבעיה הראשונה קשורה בעיקר עם ההזרקה של נגיפי כייל נמוך. תאי 293T עם מספר נמוך יותר של מעברים בתרבות לצמוח מהר יותר ולהוביל לtiters הנגיפי הגבוה יותר. שימוש בתאים מבוגרים יותר CA. 20 קטעים אינם מומלצים ואמצעי transfection עם יעילות% פחות מ 80 לא יבטיח טובייצור נגיפי. Resuspension של גלולת ויראלי הוא גם קריטי, ההשעיה הנגיפית יש להופיע גושים הומוגניים ויראלית שיכול לחסום את הנימים צריכות להימנע. וירוסים רגישים מאוד לטמפרטורה יורדת ואחסון לטווח ארוך. מסיבה זו, aliquots צריך להיות מאוחסן באופן קבוע ב-80 מעלות צלזיוס, ולא יכול להיות refrozen. גם בתנאים אלה, ירידה בinfectivity יכולה להיבחן לאחר 6-12 חודשים של אחסון. בשלבי הלמידה, אנו ממליצים לבדוק את כייל הנגיף של כל הכנה נגיפית ולעשות אותו שוב לאחר אחסון ארוך טווח. הנוכחות של תאים נגועים באזורים לא רצויים של המוח יכולה להיות תלויה במיקום אופטימלי של ראש העכבר על מסגרת stereotaxic, שדורשת קצת תרגול. בנוסף, חשוב שלא לפגוע בשטח של המוח בעת פתיחת החור בגולגולת כי אחר זה לא יהיה אפשרי לאפס 0 כראוי על פני שטח pial, וכתוצאה מההזרקה לא מדויקת. הקואורדינטותשנקבענו בפרוטוקול זה נקרא C57/BL6 6-10 שבועות נקבות זקנות ומומלץ לבצע אופטימיזציה שלהם למתח / גיל / מין שונה. רכישה של טכניקה זו עשויה לדרוש זמן רב יותר מאשר ברחם electroporation בשל השלבים הארוכים יותר הדרושים כדי להכין את הווירוסים ולנתח את הדגימות. אנו ממליצים בחום שוירוסים נמצאים בשימוש רק לאחר ניתוח עכבר והזרקת stereotaxic הפכו אמין לשחזור. הצעד הראשון להשגת מטרה זו הוא להזריק צבעי התא permeant DNA, כגון Hoechst 33342, בעכברים מורדמים ולנתח את מוחם באופן מיידי.
בelectroporation הרחם והזרקה נגיפית stereotaxic שתי מערכות חשובות לחריפות ורקמות ספציפיות לתפעל ביטוי גנים בתוך מערכת העצבים המרכזיים בפיתוח ובבגרות של יונקים. למרות מגבלתם במיקוד רק תת אוכלוסיות של תאים, מערכות אלו מספקות מהירות חסרות תקדים וקל בהשוואה לשיטות קונבנציונליות יותר, אניn בפרט דור הרב המפרך וזמן של עכברים הטרנסגניים. עם זאת, למרות דמיון זה, כמה הבדלים קיימים בין שתי טכניקות שראויות לאזכור. ראשית, בכל קשורים למיקוד של תאים מסוגים שונים, ברחם electroporation תחילה מוביל לtransfection של תאי גזע תקינים (הנקרא גם תאי גלייה רדיאלי), כי אלה הם התאים היחידים התוחמים את החדר שבו את ה-DNA מוזרק. כתוצאה של חלוקות, פלסמידים יהיו לאחר מכן לעבור בתורשה מאם, תאי גזע ממוקד למולידם ו / או תאי בת עצביות שהובילו לחלוקה מחדש של תאי transfected לאורך הקליפה כפונקציה של זמן. בניגוד לכך, השימוש בlentiviruses HIV במוח הבוגר מוביל לזיהום סימולטני של כל סוג תא כוללים תאי גזע, את אבות, הנוירונים כמו גם תאי גלייה בוגרים. מן ראוי לציין כי בכל קשור לשימוש בlentiviruses HIV בניגוד לרטרווירוסים נפוצים ביותר היא העובדהכי שילוב lentiviral יתרחש באופן עצמאי מהמדינה המיטוטי של תאים, ובכך מאפשר גם המיקוד של בוגרי תאים רדומים גזע.
שנית, עוד הבדל חשוב בין electroporation ודלקת הנגיפית הוא שביטוי חולף, episomal מושג על ידי לשעבר בניגוד לשילוב בלתי ההפיך של ה-DNA בגנום של תאים נגועים הושגו על ידו. כתוצאה מחטיבות רצופות סלולריים, דילול של פלסמידים electroporated, והשפלה של cyclinD1 החלבון מחוץ לרחם, הייתי להתחולל בכל מחזור תא. לפיכך, הרחבת המל"ל במהלך התפתחות עוברית הוצגה רק לאחרונה במשך כשני ימים אחרונים 15 ואילו במוח הבוגר השפעה זו נמצאה נמשכת כמה חודשים (תוצאות לא פורסמו).
שלישית, מאז ש) cdk4/cyclinD1 יש השפעה חזקה על תאים עם G1 ועוד ii) אבות עצביים שבוצעו במהלך פיתוח יש עוד מחזור תאמתאי גזע ואילו ההפך נכון בבגרות, שתי המניפולציות נמצאו כדי לעורר את ההתפשטות, בעיקר, מאבות עצביים במהלך פיתוח תאי גזע ותקופת הבגרות. בכל מקרה עלייה בנוירונים הושגה על ידי שתי השיטות.
הזריקה רביעית, נגיפית קלות ניתן לבצע באופן אמין וreproducibly, באזורים שונים של המוח הבוגר, פשוט על ידי שינוי קואורדינטות stereotaxic. לעומת זאת, מיקוד מדויק של אזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית, כגון גזע מוח, היווצרות היפוקמפוס, או בחוט שדרה, על ידי בelectroporation הרחם עלול להיות קשה יותר להשגת reproducibly. יתר על כן, בעוד שניתן לבצע הזרקת stereotaxic בעכברים בכל גיל, ביצועים אופטימליים של electroporation ברחם הנו מוגבלים מעל E11 לE16. שלבים שקדם לE11 יחייבו גם השימוש במיקרוסקופ backscatter אולטרסאונד 18,19 או פולחן עובר שלםמערכת יור 17,20.
לאחרונה, עניין גובר בביולוגיה של תא בסיסית של תאי גזע סומטיים כבר קדם כי המחקר והמניפולציה שלהם נחשבים למהותיים לקראת פיתוח טיפולי התחדשות מבוססי תאים חדשים. במיוחד לביטוי יתר של cdk4/cyclinD1, הפרוטוקול שלנו מספק את האמצעים להגברת transitorily הרחבת המל"ל בvivo (האיור 3B ו-C ו4B ו-C) על מנת להגדיל את מספר תאי עצב שנוצרים במוח הבוגר. אנו מאמינים כי מניפולציה אלה עשויות להיות חשובה בכמה הקשרים שונים כדי להבין טוב יותר את תפקידו של המל"ל במוח התפתחות, אבולוציה והומאוסטזיס כמו גם תרומתם לפונקציה או התאוששות מניוון או פגיעה עצבי הקוגניטיבית.
Disclosures
התואר ראשון וFC הגישו בקשה לרישום פטנט המתאר את ההתרחבות מותנה של תאי גזע הסומטיים במבוגרי cdk4/cyclinD1 וירוסים (EP 10160288.6).
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז לטיפולי משובים, פקולטה לרפואה של TU דרזדן, וDFG השיתופי מרכז המחקר SFB655 (A20 subproject). התואר ראשון נתמך על ידי מלגה של תכנית חפירות-BB, דרזדן. אנו מודים לבני זוג. נוריקו Osumi, טאדאשי נומורה, שקר Chichung דיטר, וראבי Jagasia עצה יקרה בהקמה ברחם electroporation והזרקה נגיפית stereotaxic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
- Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain--using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. , Suppl 19 Supp. 120-125 (2009).
- Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
- Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
- Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
- Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
- De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
- Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
- Osumi, N., Inoue, T. G. ene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
