체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.
체세포 줄기 세포는 성인 한 동안 배아 개발 및 조직 항상성 동안 조직 형성을위한 중요한 요소입니다 추가 줄기 세포 (확장) 또는 더 차별화 된 세포 유형 (차별화)을 생성하기 위해 나눌 수 있습니다. 현재 큰 노력이이 재생 의학 1,2에 대한 소설 전략을 개발하기위한 기본이라고 생각하기 때문에 차별화로 확장에서 체세포의 줄기 세포의 스위치를 제어 향해 투자하고 있습니다. 그러나, 체세포의 줄기 세포의 연구와 사용의 주요 과제는 자신의 확장을 제어하기가 매우 어렵 입증 된 것입니다.
여기 cdk4/cyclinD1 단지의 표현, G1 단계의 주요 조절기를 조작하여 마우스 배아 피질 또는 성인 해마의 신경 줄기 / 전구 세포의 컨트롤 (모두 NSC로 칭함) 확장 할 수있는 시스템을 설명 세포주기와 체세포 줄기 세포 비교의erentiation 3,4. 특히, 두 개의 다른 접근 방식은 cdk4/cyclinD1 단지는 생체에 NSC에 overexpressed하는에 의해 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법으로, 세포주기의 규제 당국의 overexpression은 마우스 telencephalon의 내강에 cdk4/cyclinD1 인코딩을 plasmids은의 episomal 표현을 트리거링, 따라서, 측 방향 피질의 NSC에게 제공하기 위해 자궁의 electroporation의 다음 주입함으로써 얻을 수 있습니다 transgenes 5-8. 두 번째 접근 방법으로, 매우 집중 HIV-파생 바이러스는 stereotaxically 9 감염된 세포의 게놈에있는 바이러스 구조의 통합 후 세포주기의 규제의 제정 표현을 트리거링, 따라서 성인 마우스 해마의 이가있는 이랑에 주입되어 있습니다. 그의 기본적인 원칙 이미 다른 비디오 프로토콜 10-14에서 설명 된 두 가지 방법은, 내가에 최적화 된), II를 조직의 손상을 줄일 수) 매우 구체적인 뇌 regio의 대상 폭 넓은 부분이NS, III)는 각 지역 내에서 조작 세포의 높은 숫자를 얻을, 그리고 IV)는 각 셀 내에서 transgenes 높은 표현 수준을 게재됩니다. 두 접근법을 사용하여 transgenes의 과도 overexpression 인해 Cre-표현 각각 NSC는 loxP 사이트으로 둘러싸인 cdk4/cyclinD1을 가진 바이러스에 감염 9,15의 세포 분열 또는 tamoxifen 관리에 electroporated plasmids 자연 희석하여 즉 다른 방법으로 얻어진다 .
이 방법 심하게 및 조직 – 특히 마우스의 뇌에서 유전자의 표현을 조작 할 수있는 매우 강력한 플랫폼을 제공합니다. 특히, cdk4/cyclinD1 단지의 표현을 조작하여 우리의 시스템은 궁극적으로 포유류의 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가, 따라서, 시간적 NSC 확장의 관리 및 차별화에 대한 그들의 스위치를 할 수 있습니다. 우리 접근 방식은 기초 연구에 매우 중요하고 치료를 위해 체세포의 줄기 세포를 사용 할 수 있습니다포유류의 중추 신경계의 난에 대한 이해)을 제공하는 동시에이 체세포 줄기를 사용하여) 성인, III 동안) 개발, II 동안 더 나은인지 기능에 성인 neurogenesis의 역할, 그리고 아마도 IV)를 조직 항상성을 조직 형성에 셀 공헌을 막기 neurodegenerative 질병 모델 세포.
자궁의 electroporation에 대한 중요한 단계는 전기 분야의 배달시의 방향 마이그레이션 충전에 따라 달라집니다 이후 DNA의 품질과 순도입니다. 같은 endotoxins 같은 추가 요금이 부과 분자의 제거를 포함하지 않는 DNA 정화를위한 프로토콜이 좋지 배달로 이어지는 자연의 DNA 부정적인 요금의 마스킹 될 수 있습니다. 분명 가장 가까운 가능한 타겟이 될 수있는 영역에 전극과 자궁 벽을 터치하면 electroporation 효율을 향상시킬 수 있습니다. 또 다른 중요한이 최적의 전기 분야의 전송 기본이기 때문에 사용되는 전극의 품질입니다. 눈 및 / 또는 등등 혈청의 흔적, 지질, 등 유기 잔류 물에 의해도 보이지 않는 미세 흠집이 불가피하게 자신의 속성을 잃지 전극에 이르는 시간이 지남에 축적됩니다. 옛 및 / 또는 더러운 electropes는 electroporation 효율에 갑자기 드롭의 가장 큰 원인이며, 따라서, R이어야합니다가능한 한 빨리이가 발견되기 때문에 eplaced. 비교적 간단하지만, 자궁의 electroporation에 일반적으로 만족하고 재현 결과를 달성하기 위해 훈련의 몇 주이 필요합니다. 가 개발 배아의 기관 및 조직에, 사실상, 적용 할 수 있기 때문에이 기술은 매우 다양한입니다. 물론, 이러한 뇌 등의 캐비티를 포함한 기관은 대상과 DNA의 비교적 큰 볼륨을 주입의 용이성으로 인해 transfected 세포의 높은 비율을 할 수 있도록 특히 용이합니다.
stereotaxic 바이러스 주사를 설정에서 발생하는 일반적인 문제는 몇 감염된 세포 및 /하거나 원하지 않는 영역을 타겟팅하는 것입니다. 첫 번째 문제는 주로 낮은 titer 바이러스의 주입과 상관 있습니다. 문화의 통로 낮은 번호를 가진 293T 세포가 빠르게 성장하고 높은 바이러스 titers로 연결됩니다. CA보다 오래된 세포를 사용합니다. 20 구절을 권장 미만 80 % 효율 transfection의 의미없는 것은 좋은을 보장하지 않습니다바이러스 생산. 바이러스 펠렛의 Resuspension도 중요합니다, 바이러스 정지는 모세가 피해야 할 필요가 윗니와 아랫니가 맞 물리다 수 동질 및 바이러스 clumps를 표시 할 수 있습니다. 바이러스는 온도 드랍스 및 장기 저장에 매우 민감합니다. 이 이유로, aliquots이 영구적으로 -80 ° C에서 저장하고 refrozen 할 수 없습니다 필요합니다. 심지어 이런 상황에서, 감염의 감소는 스토리지의 6-12 개월 후에 관찰 할 수있다. 학습 단계에서, 우리는 각각의 바이러스 준비 바이러스 titer를 테스트하고 장기 보관 한 후 다시 수행하는 것이 좋습니다. 뇌의 원치 않는 영역에 감염된 세포의 존재는 연습이 필요합니다 stereotaxic 프레임에 마우스 머리 차선 위치에 따라 달라집니다 수 있습니다. 또한, 그렇지 않으면이 부정확 주입의 결과로, pial 표면에 정확하게 공을 재설정 할 수 없습니다 때문에 두개골에 구멍을 여는 동안 뇌의 표면을 손상하지 중요합니다. 좌표우리가이 프로토콜에서 제공하는 C57/BL6 6-10주 옛 여자라고합니다 그리고 서로 다른 변형 / 연령 / 성별을 위해 최적화하는 것이 좋습니다. 이 기술의 취득은 바이러스를 준비하고 샘플을 분석하는 데 필요한 단계 이상으로 인해 자궁의 electroporation보다 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 우리는 강력하게 마우스 수술과 stereotaxic 분사가 안정적이고 재현 될 한 후 바이러스 만 사용하는 것이 좋습니다. 이를 달성하기위한 첫 번째 단계는 euthanized 마우스에서 해당 Hoechst 33342와 같은 세포 permeant DNA의 염료를, 삽입 즉시 뇌를 분석하는 것입니다.
자궁의 electroporation 및 stereotaxic 바이러스 주사를 두 개의 강력한 심하게으로 시스템과 조직 – 특히 포유류의 개발 및 성인기 동안 CNS 내에서 유전자 발현을 조작입니다. 세포 만 subpopulation을 타겟팅의 제한에도 불구하고, 이러한 시스템은 전례없는 속도를 제공하고 더 많은 기존의 방법에 비해 쉽게, 전유전자 변형 마우스의 N 특히 힘든 시간이 소요 세대. 그러나,이 유사성에도 불구하고, 몇 가지 차이가 가치가 멘션있는 두 가지 기술 사이에 존재합니다. 이러한 DNA가 주입되어 심실을 delimiting 유일한 세포이기 때문에 첫째, 자궁의 electroporation에, 다른 세포 유형의 타겟팅과 관련하여 초기에 적절한 줄기 세포 (또한 반경 방향 glial 세포라고도 함)의 transfection로 연결됩니다. 세포 분열의 결과로, plasmids은 이후의 전구 및 / 또는 시간의 함수로 피질에 걸쳐 transfected 세포의 재배포에 이르는 neuronal 딸 세포를 타겟으로, 어머니의 줄기 세포에서 상속됩니다. 대조적으로, 성인 뇌의 HIV의 lentiviruses의 사용은 줄기 세포, progenitors, 뉴런뿐만 아니라 성숙 glial 세포를 포함한 모든 세포 타입의 동시 감염 발생합니다. 참고 더 일반적으로 사용되는 레트로 바이러스가 잠복 반대로 HIV의 lentiviruses를 사용에 관한 사실입니다그 lentiviral 통합 따라서 성인, 동작 줄기 세포의도 타겟 수 있도록 독립적으로 세포의 mitotic 상태에서 발생합니다.
둘째, electroporation 및 바이러스 감염 사이의 또 다른 중요한 차이점은 후자에 의해 달성 감염된 세포의 게놈에있는 DNA의 돌이킬 수없는 통합에 반대하는 등의 일시적인, episomal 표현이 전에 의해 달성되는 것입니다. 연속 셀 부문, electroporated plasmids의 희석하고, 이소성 cyclinD1 단백질의 저하의 결과로, 각 세포주기에 있었 것입니다. 이 효과는 몇 개월 (게시되지 않은 결과) 지속하기 위해 발견 된 성인 뇌에있는 동안 따라서, 태아의 개발 기간 동안 NSC의 확장은 지난 약 이일 15에 게재되었습니다.
전) cdk4/cyclinD1 개발 중) 최선을 다하고 신경 progenitors을 더 G1 및 II와 세포에 강력한 영향을 이후 셋째, 더 이상 세포주기를반대 성인 중에 마찬가지 동안 줄기 세포보다 두 조작은 성인 동안 개발과 줄기 세포 중 신경 progenitors의 확장을 주로 실행하는 발견되었습니다. 각각의 경우에 뉴런의 증가는 두 가지 방법에 의해 달성되었습니다.
넷째, 바이러스 주입은 쉽게 간단하게 stereotaxic 좌표를 변경하여 성인 뇌의 여러 지역에서 안정적으로 reproducibly, 수행 할 수 있습니다. 반면에, 자궁의 electroporation에 의한 이러한 뇌 줄기, hippocampal 형성, 또는 척추 등 중추 신경계의 특정 지역의 정확한 타겟팅 reproducibly 달성하기 힘들 것입니다. stereotaxic 분사가 어떤 시대의 쥐를 수행 할 수 있으며 또한, 자궁의 electroporation에 최적의 성능을 E16에 E11에 대한에서 제한되어 있습니다. 이전 E11에 대한 단계는 초음파 후방 산란 현미경 18,19의 사용 또는 전체 배아 컬트 중 하나를 요구우레 시스템 17,20.
자신의 연구와 조작이 소설 셀 기반의 재생 치료의 개발에 대한 기본적인 것으로 생각되기 때문에, 최근 체세포 줄기 세포의 기본 세포 생물학의 증가 관심이 추진되었습니다. cdk4/cyclinD1의 overexpression에 대한 특히, 우리의 프로토콜은 transitorily 성인 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가시키기 위해 생체 내 NSC의 확장 (그림 3B와 C와 4B와 C)을 높일 수있는 방법을 제공합니다. 우리는이 조작이 더 뇌 개발, 진화와 항상성뿐만 아니라인지 기능이나 신경 변성이나 부상에서 회복에 대한 그들의 공헌에 NSC의 역할을 이해하기 위해 다양한 상황의 숫자에 중요 할 수 있다고 생각합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 재생 요법, TU 드레스덴 (Dresden)의 의료 학부 및 DFG 공동 연구 센터 SFB655 (하위 프로젝트 A20)를위한 센터에 의해 지원되었다. BA는 셋방-BB 프로그램, 드레스덴 (Dresden)의 화목에 의해 지원되었다. 우리는 Drs 감사드립니다. Noriko 스미, 타다 노무라, 디터 Chichung의 거짓말, 그리고 자궁의 electroporation 및 stereotaxic 바이러스 주입에의 설정까지 동안 귀중한 조언 라비 Jagasia.
Material/equipment | Supplier | Catalog # | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|