Contrôle de l'expansion des cellules souches somatiques est un facteur majeur qui pèse sur leurs études et leur utilisation en thérapie. Ici, nous décrivons un système à contrôler temporellement les cellules souches neurales l'expansion au cours du développement et de l'âge adulte, ce qui peut être utilisé pour augmenter le nombre de neurones générés dans le cerveau de souris.
Cellules souches somatiques peuvent se divisent pour produire des cellules souches supplémentaires (extension) ou des types cellulaires plus différenciés (différenciation), ce qui est fondamental pour la formation des tissus au cours du développement embryonnaire et l'homéostasie tissulaire au cours de l'âge adulte 1. Actuellement, de grands efforts sont investis pour la commande du commutateur de cellules souches somatiques de l'expansion à la différenciation, car cela est considéré comme fondamental pour le développement de nouvelles stratégies de 1,2 médecine régénérative. Cependant, un défi majeur pour l'étude et l'utilisation des cellules souches somatiques, c'est que leur expansion a été très difficile à contrôler.
Ici, nous décrivons un système qui permet le contrôle de souches neurales / cellules progénitrices (mentionné comme NSC) l'expansion dans le cortex embryonnaire de la souris ou l'hippocampe adulte en manipulant l'expression du complexe cdk4/cyclinD1, un régulateur majeur de la phase G1 du cycle cellulaire des cellules souches somatiques et différenciation 3,4. Plus précisément, deux approches différentes sont décrites par laquelle le complexe cdk4/cyclinD1 est surexprimé dans NSC in vivo. En première approche, la surexpression des régulateurs du cycle cellulaire est obtenue en injectant des plasmides codant pour cdk4/cyclinD1 dans la lumière du télencéphale de la souris suivie par électroporation in utero pour les livrer à NSC de la corticale latérale, par conséquent, le déclenchement de l'expression épisomique transgènes 5-8. Par la seconde approche, fortement concentrés VIH virus dérivés sont stéréotaxique injecté dans le gyrus denté de l'hippocampe de souris adultes, ainsi, déclenchant une expression constitutive des régulateurs du cycle cellulaire après intégration de la construction viral dans le génome des cellules infectées 9. Les deux approches, dont les principes de base ont déjà été décrites par des protocoles vidéo 10-14, d'autres ont été ici optimisés pour i) réduire les dommages aux tissus, ii) des portions larges cibles du cerveau très spécifique regions, iii) obtenir un nombre élevé de cellules manipulées à l'intérieur de chaque région, et iv) déclencher des niveaux élevés d'expression de transgènes dans chaque cellule. Surexpression transitoire de transgènes à l'aide des deux méthodes est obtenue par des moyens différents, à savoir en dilution naturelle des plasmides électroporées en raison de la division cellulaire ou le tamoxifène administration en exprimant Cre-NSC infectées par le virus portant cdk4/cyclinD1 flanqué par des sites loxP, respectivement 9,15 .
Ces méthodes fournissent une plate-forme très puissante de façon aiguë et tissu-spécifique de manipuler l'expression de n'importe quel gène dans le cerveau de souris. En particulier, par la manipulation de l'expression du complexe cdk4/cyclinD1, notre système permet le contrôle de l'expansion temporelle NSC et leur passage à la différenciation, donc, en fin de compte l'augmentation du nombre de neurones générés dans le cerveau des mammifères. Notre approche peut être d'une importance capitale pour la recherche fondamentale et l'utilisation de cellules souches somatiques pour la thérapiedu système nerveux central des mammifères, tout en offrant une meilleure compréhension de i) enrayer la contribution à la formation du tissu cellulaire au cours du développement, ii) l'homéostasie tissulaire au cours de l'âge adulte, iii) le rôle de la neurogenèse adulte dans les fonctions cognitives, et peut-être, iv) une meilleure utilisation somatique tige cellules dans des modèles de maladies neurodégénératives.
Une étape cruciale pour électroporation in utero est la qualité et la pureté de l'ADN depuis sa migration directionnelle lors de la livraison des champs électriques dépend de sa charge. Les protocoles de purification de l'ADN qui ne comprennent pas l'élimination des autres molécules chargées, tels que les endotoxines, peuvent conduire à l'masquage des charges d'ADN naturels négatifs conduisant à une mauvaise prestation. De toute évidence, toucher les parois utérines avec les électrodes aussi près que possible de la zone à cibler permettra d'améliorer l'efficacité d'électroporation. Tout aussi important est la qualité des électrodes utilisées depuis ce qui est fondamental pour la livraison de champs électriques optimales. Les micro-rayures même pas visibles à l'œil nu et / ou des résidus organiques, tels que des traces de sérum, de lipides, et ainsi de suite, inévitablement s'accumulent avec le temps conduisant à des électrodes perdent leurs propriétés. Electropes anciens et / ou sales sont la cause la plus probable d'une baisse soudaine de l'efficacité d'électroporation et, par conséquent, devrait être replaced dès que cela est remarqué. Bien que relativement simple, électroporation in utero nécessite généralement quelques semaines de formation afin d'atteindre de manière satisfaisante et des résultats reproductibles. Cette technique est très polyvalent car il peut être appliqué, pratiquement, à n'importe quel organe et de tissus de l'embryon en développement. Certes, les organes contenant une cavité, par exemple le cerveau, sont particulièrement faciles à cibler et permettre à une proportion élevée de cellules transfectées en raison de la facilité d'injection d'un volume relativement important de l'ADN.
Un problème fréquemment rencontré dans la mise en place stéréotaxique injection virale est d'avoir quelques cellules infectées et / ou de cibler des zones indésirables. Le premier problème est essentiellement corrélée à l'injection de faible titre de virus. Des cellules 293T avec diminution du nombre de passages en culture se développent plus rapidement et entraîner une hausse des titres viraux. En utilisant des cellules de plus de ca. 20 passages n'est pas recommandée et les moyens de transfection avec moins de 80% d'efficacité ne garantissent pas une bonneproduction virale. Remise en suspension du culot viral est également critique, la suspension virale doit comparaître massifs homogènes et virales qui pourraient obstruer les capillaires doivent être évités. Les virus sont très sensibles aux baisses de température et de stockage à long terme. Pour ces raisons, des aliquotes doivent être stockés de façon permanente à -80 ° C et ne peut pas être recongelé. Même dans ces conditions, une diminution de l'infectiosité a pu être observée après 6-12 mois de stockage. Dans les phases d'apprentissage, nous vous conseillons de tester le titre viral de chaque préparation virale et de le faire à nouveau après un stockage à long terme. La présence de cellules infectées dans les zones indésirables du cerveau peut dépendre d'un positionnement sous-optimale de la tête de la souris sur le cadre stéréotaxique, ce qui nécessite un peu de pratique. En outre, il est essentiel de ne pas endommager la surface du cerveau, tout en ouvrant le trou sur le crâne parce que sinon il ne sera pas possible de réinitialiser le 0 correctement sur la surface de la pie-mère, résultant de l'injection imprécis. Les coordonnéesque nous avons fourni dans ce protocole sont appelés C57/BL6 6-10 femelles semaines et nous vous suggérons de les optimiser pour la souche différente / âge / sexe. L'acquisition de cette technique peut exiger plus de temps que électroporation in utero due aux phases plus nécessaires pour préparer les virus et analyser les échantillons. Nous recommandons fortement que les virus ne sont utilisés après la chirurgie de la souris et injection stéréotaxique sont devenus fiable et reproductible. La première étape pour atteindre cet objectif est d'injecter les colorants ADN de cellules infiltrant, comme Hoechst 33342, chez les souris euthanasiées et d'analyser les cerveaux immédiatement.
Électroporation in utero et stéréotaxique injection virale sont deux systèmes puissants et aux aiguë du tissu-spécifique de manipuler l'expression des gènes dans le SNC au cours du développement chez les mammifères et l'âge adulte. En dépit de leur limitation dans le ciblage seulement une sous-population de cellules, ces systèmes fournissent une vitesse sans précédent et la facilité par rapport à des méthodes plus conventionnelles, in particulier la génération laborieuse et prend du temps de souris transgéniques. Pourtant, malgré cette similitude, il existe plusieurs différences entre les deux techniques qui méritent d'être mentionnées. Tout d'abord, en ce qui concerne le ciblage des différents types de cellules, électroporation in utero conduit d'abord à la transfection de cellules souches appropriées (également appelés cellules gliales radiales) car ce sont les seules cellules délimitant le ventricule où l'ADN est injecté. À la suite de la division cellulaire, les plasmides seront ensuite hérité de cibles, les cellules souches-mères à leur progéniteur et / ou des cellules filles neuronales conduisant à la redistribution des cellules transfectées dans le cortex en fonction du temps. En revanche, l'utilisation de lentivirus VIH dans le cerveau adulte conduit à l'infection simultanée de n'importe quel type de cellules dont les cellules souches, les progéniteurs des neurones, ainsi que les cellules gliales matures. Il convient de noter, en ce qui concerne l'utilisation des lentivirus VIH par opposition aux rétrovirus les plus couramment utilisés sont le faitque l'intégration se produirait lentiviral indépendamment de l'état mitotique de cellules, permettant ainsi le ciblage aussi des adultes, des cellules souches quiescentes.
D'autre part, une autre différence importante entre l'électroporation et l'infection virale est celle d'un transitoire, l'expression épisomique est atteint par le premier par rapport à l'intégration irréversible de l'ADN dans le génome des cellules infectées obtenus par celui-ci. À la suite de divisions cellulaires consécutives, la dilution des plasmides électroporation, et la dégradation des protéines extra-utérine cyclinD1, il s'ensuivrait à chaque cycle cellulaire. Ainsi, l'expansion du NSC au cours du développement embryonnaire a été démontré que pendant environ deux jours 15 tandis que dans le cerveau adulte cet effet a été constaté que dure plusieurs mois (résultats non publiés).
Troisièmement, étant donné i) cdk4/cyclinD1 a un effet sur les cellules ayant une plus longue G1 et ii) commis progéniteurs neuronaux au cours du développement ont un cycle cellulaire plusque les cellules souches alors que l'inverse est vrai à l'âge adulte, nos deux manipulations ont été trouvés pour déclencher l'expansion, principalement, des progéniteurs neuronaux au cours du développement des cellules souches et à l'âge adulte. Dans les deux cas une augmentation de neurones ont été réalisés par les deux méthodes.
Quatrièmement, l'injection virale peut facilement être réalisé, de manière fiable et reproductible, dans de nombreuses régions du cerveau adulte en changeant simplement les coordonnées stéréotaxiques. En revanche, le ciblage précis de certaines régions du système nerveux central, comme le tronc cérébral, la formation hippocampique, ou la moelle épinière, par électroporation in utero peut-être plus difficile à réaliser de façon reproductible. En outre, tandis que l'injection stéréotaxique peut être réalisée sur des souris de tout âge, des performances optimales de électroporation in utero est limitée d'environ E11 à E16. Étapes préalables à E11, il faudrait soit l'utilisation d'un microscope à rétrodiffusion ultrasonore 18,19 ou un culte embryons entierssystème ure 17,20.
Récemment, un intérêt croissant pour la biologie cellulaire fondamentale des cellules souches somatiques a été promu parce que leur étude et la manipulation sont considérées comme fondamentale pour le développement de nouveaux traitements cellulaires régénératives. En particulier pour la surexpression de cdk4/cyclinD1, notre protocole fournit les moyens pour augmenter transitoirement la dilatation de NSC in vivo (figure 3B et 4B et C et C) afin d'augmenter le nombre de neurones générés dans le cerveau adulte. Nous croyons que ces manipulations peuvent être importantes dans un certain nombre de contextes différents afin de mieux comprendre le rôle du CCS dans le développement du cerveau, l'évolution et l'homéostasie, ainsi que leur contribution à la fonction cognitive ou la récupération de la dégénérescence neuronale ou des blessures.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le Centre pour les thérapies régénératrices, de la Faculté de médecine de l'université technique de Dresde, et la DFG Collaborative Research Center SFB655 (A20 sous-projet). BA a été soutenue par une bourse du programme DIGS-BB, Dresde. Nous remercions les Drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie, et Ravi Jagasia pour obtenir des conseils précieux lors de la mise en place d'électroporation in utero et stéréotaxique injection virale.
Material/equipment | Supplier | Catalog # | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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