Summary
Nós demonstramos um protocolo em que a administração do agente genotóxico azoximetano (AOM), seguido por três ciclos da pró-inflamatória de sódio sulfato de agente de dextrano (DSS) de forma rápida e consistentemente gera tumores do cólon em ratos com semelhanças morfológicas e moleculares para as observadas em humanos colite Associadas cancro.
Abstract
Os indivíduos com a doença inflamatória do intestino (IBD), como a doença de Crohn (DC) ou a colite ulcerosa (UC) estão em risco aumentado de desenvolver cancro colo-rectal (CRC) nos indivíduos saudáveis. Este risco é proporcional à duração e à extensão da doença, com incidência cumulativa tão alta quanto 30% em indivíduos com UC de longa data com envolvimento do cólon generalizada. Uma displasia colônica em IBD e colite associada a câncer (CAC) Acredita-se que desenvolver como resultado de ciclos repetidos de lesão e reparação de células epiteliais, enquanto estas células são banhadas em meio de citocina inflamatória crónica. 2 Enquanto cancros espontâneos e colite associada a partilhar a qualidade de adenocarcinomas sendo, a sequência de eventos moleculares subjacentes acredita-se ser diferente. 3 Este distinção argumenta a necessidade de modelos animais específicos do CAC.
Modelos de ratos Existem actualmente vários para o estudo da CAC. Sulfato de dextrano sodihm (DSS), um agente com efeitos tóxicos directos sobre o epitélio do cólon, podem ser administrados na água de beber para ratos em vários ciclos para criar um estado inflamatório crónico. Com duração suficiente, alguns destes ratos desenvolvem tumores. 4 O desenvolvimento do tumor é acelerada, neste modelo, se administrado em um ambiente pró-carcinogénicos. Estes incluem os ratos com mutações genéticas em tumorigénese vias (APC, p53, Msh2), bem como ratinhos pré-tratados com agentes genotóxicos (azoximetano [OMA], 1,2-dimetil-hidrazina [DMH]) 5.
A combinação de DSS com OMA como um modelo para a colite câncer associado ganhou popularidade por sua reprodutibilidade, potência, preço baixo e facilidade de uso. Embora eles têm um mecanismo comum, AOM foi encontrada para ser mais potentes e estáveis em solução do que DMH. Embora o desenvolvimento de tumores em outros modelos requer geralmente de vários meses, camundongos injetados com AOM e subsequentemente tratados com DSS desenvolver tumores adequadas numas pouco como 7-10 semanas. 6, 7 Finalmente, AOM e DSS podem ser administrados a ratos de todo o fundo genético (knock out, transgénicos, etc), sem cruzamento de uma linhagem tumorigénico específico. Aqui, demonstramos um protocolo para a inflamação orientada tumorigénese do cólon em ratos, utilizando uma única injecção de AOM seguido por três ciclos de sete dias de DSS durante um período de 10 semanas. Este modelo induz tumores com alterações histológicas e moleculares muito semelhantes às que ocorrem em CAC humana e proporciona um modelo altamente valiosa para o estudo da quimioprevenção oncogénese e na doença. 8
Protocol
1. Colite associada a indução de cancro
- Separe gaiolas de sexo e de mesma faixa etária 6-8 ratos semanas de idade para ser usado para grupos experimental e controle. Ratos podem ser individualmente rotulado com marcações da cauda ou clipes de ouvido.
- No dia 0, os pesos de base de registo e injectar por via intraperitoneal a cada rato (IP) com 10 mg / kg de AOM solução de trabalho (1 mg / ml em solução salina isotónica, diluída a partir de 10 mg / ml de solução concentrada em dH2O mantida a -20 ° C) . Com base na experiência, esta dose pode ser ajustado entre 7-14 mg / kg e / ou repetida no início da experiência.
Atenção: OMA é um agente volátil genotóxico e devem ser manuseados com cuidado de acordo com a MSDS acompanha. As diluições devem ser preparadas de um capuz químico, mantidos em gelo, e descartada seguindo protocolos específicos instituição.
- Fazer a 2,5% (2,5 g/100 ml) solução DSS em água destilada e passa através de um 0,22 mM de acetato de celulose filter por vácuo. Esta dose pode ser ajustada entre 1-3,5%, dependendo da estirpe de ratinho e de ambiente. Uma vez preparada uma solução, DSS pode ser mantido refrigerado durante até 1 semana.
- No dia 7, solução de abastecimento DSS para ratos como sua água potável. Cerca de 250 ml / gaiola será necessária cada vez DSS novo é fornecido para um máximo de 5 murganhos / gaiola, no entanto, estes são apenas estimativas e irá variar dependendo do tipo de garrafas de água usadas na sua instalação para animais.
- Para garantir um suprimento contínuo de DSS por sete dias, a solução DSS deve ser substituído em garrafas limpas três vezes (a cada 2-3 dias) durante esse período. Alguns investigadores medir a quantidade de DSS consumidos antes da substituição com a solução de novo como uma medida da exposição.
- No dia 14, comutar gaiolas de volta à água potável normal durante duas semanas.
- Repita os passos (1.4) - (1.6), nos dias 28 e 49 para proporcionar um segundo e terceiro ciclos de DSS. Um "ciclo" DSS consiste de uma semana de DSS na água potávelseguido de 2 semanas de água (autoclavado) regular.
2. Colite Avaliação clínica e progressão do tumor
- Ratos deve ser pesado / observados 2-3 vezes por semana. Perda por cento em peso em relação à linha de base é utilizado como uma medida substituta da severidade da colite. Avaliações regulares de sangramento retal, diarréia, ou prolapso podem ser feitas dependendo objetivos experimentais e relatados de acordo com vários sistemas de pontuação. 9, 10
- Uma perda de peso de até 10%, juntamente com 2-3 dias de diarreia e sangramento rectal pode ser esperado na semana após um ciclo completo de DSS (observação diária pode ser útil durante este período de pós-DSS imediata).
É possível que alguns ratos não podem recuperar; ratinhos perdem mais de 20% do seu peso é menos provável que sobrevivem e podem exigir a eutanásia precoce. Uma injeção de IP único de 0,5-1,0 ml de solução salina em camundongos tais pode ser uma medida útil de apoio para corrigir flui o volume d perdido devido à diarreia.
3. Murino Endoscopia (Opcional)
- Endoscopy seguindo o ciclo de segunda ou terceira de DSS podem ser realizados para confirmar o crescimento do tumor in vivo antes do sacrifício. Como o AOM / modelo DSS é bastante confiável na produção de tumores, este passo não é geralmente necessário. Apenas alguns ratos deve avaliadas utilizando este método, uma vez que tem o potencial para destruir tumores de ratos 11.
- Anestesiar o rato com sedação inalatória ou injetável.
- Depois de mouse é anestesiado, garantir o mouse para uma tábua plana com fita na cauda e no peito.
- Avançar o endoscópio murino no reto do rato delicadamente com soro fisiológico para inflar e irrigar a melhorar a visão intraluminal e remover conteúdo fecal. (Note-se que a endoscopia também pode ser realizada usando insuflação de ar, como uma alternativa à solução salina e esta técnica pode oferecer visualização melhorada do tumor 12.)
- No dia 70, cada rato OMA / DSS tratada deve abrigar vários tumores de cólon e estar pronto para a avaliação. Esta data pode ser adiada semanas a meses se tumores maiores são desejados. (De notar que os ratos com grave prolapso rectal podem ter de ser sacrificados antes para evitar desconforto excessivo para animais de acordo com as comissões institucionais de cuidados com animais.)
- Antes de necropsia, individualmente eutanásia ratos com luxação isoflurano e cervical (ou método institucionalmente aprovado outro). Peso final e outras medições podem ser feitas neste momento.
- Coloque o mouse com o lado ventral exposto em uma placa de corte. Cobrir o abdómen com etanol a 70% para evitar a contaminação de cabelos de os conteúdos abdominais durante a extracção do cólon.
- Use uma pinça para agarrar a linha média do abdome e fazer uma pequena incisão para expor o peritônio.
- Estender esta incisão em cada lado do abdómen ao longo da margi costaln.
- Utilize uma tesoura para cortar através da pélvis de modo a que o cólon pode ser colhido para baixo para a junção anorretal. Isto é importante porque DSS lesão colite é maior no recto distal e, correspondentemente, esta é a região de maior desenvolvimento do tumor.
- Outros tecidos, tais como os nódulos linfáticos mesentéricos também podem ser colhidas no momento.
5. Preparando o Colon para análise macroscópica
- Utilizando uma agulha de gavagem 18G ligada a uma seringa de 5 ml, lavar o cólon com gelado salina tamponada com fosfato (PBS), de tal modo que as saídas de fluido na direcção fisiológico. Se o tecido de cólon será usado para RNA ou proteína baseada em análise, pode ser mantido frio, empregando tabuleiros pré-resfriada trabalho.
- Abra o cólon corado longitudinalmente ao longo de seu mesentério e pintura na bandeja frio. Os tumores são mais facilmente visualizados quando o cólon é colocado sobre uma superfície escura. Alternativamente, a 1% de corante azul Alcian pode ser aplicado para realçar tumors. Avaliar o número e tamanho do tumor com uma régua ou paquímetro digital.
- Pequenas secções de tumor e tecido normal adjacente pode ser excisado, neste ponto para análise posterior por RNA, proteína, ou imunohistoquímicos (IHC) métodos, permitindo que uma parte do cólon remanescente para a avaliação histológica.
A fotografia digital das amostras brutas de cólon imediatamente após a etapa 5.2 pode ser útil para a análise precisa da carga de tumor, especialmente se porções significativas dos cólons são excisadas por outras formas de análise, tal como descrito acima. Carga tumoral (%) pode ser calculado como área de tumor / área total de cólon usando software livre, como o ImageJ.
6. Preparando o Colon para avaliação histológica
- Aplicar formalina a 10% para o cólon remanescente na bandeja frio por meio de seringa ou do dedo. Permitindo que o tecido para fixar, pelo menos, 30 s deste modo facilita a transferência para a bacia de fixação. Certifique-se de formalina residual é wiped fora antes da pintura um cólon novo, inaugurado na mesma bandeja.
- Transferir pontos para uma bacia cheia de formalina a 10% e fechar nas bordas.
- Depois de 3 horas de fixação, para transferir dois pontos de etanol a 70%. Cólons pode ser preservada em etanol a 70%, por tempo indeterminado.
- Três secções longitudinais de dois pontos (proximal, médio, distal / reto) pode ser estabilizado em ágar 2% e submetidos para inclusão em parafina. Assegurar que o cólon proximal e distal do cólon / recto são orientados de uma maneira uniforme para cada rato.
- Displasia, dano da cripta, e inflamação podem ser descritos e avaliados por uma pessoa experiente de acordo com protocolos anteriormente publicados. 10, 13-15 ratos podem ser sacrificados antes do dia 70, se o experimentador está interessado na detecção de eventos precoces displásicas.
7. Resultados representativos
O modelo OMA / DSS aqui descrito permite ao pesquisador confiável gerar tumores de cólon em camundongos.O crescimento do tumor neste modelo é directamente influenciada pelo processo inflamatório associado. Gravidade da colite devem ser monitorizados clinicamente por perda de peso e depois a presença de diarreia / hematoquezia (Figura 2). Estes sinais de actividade da doença tende a começar no dia 5 do ciclo de DSS e por quatro ou mais dias após o DSS é removido. Raramente, os ratos com uma carga significativa do tumor retal pode desenvolver prolapso retal. Após o ciclo de diarreia segundo ou terceiro DSS pode tornar-se persistente. Tipicamente os tumores estão presentes e identificáveis por colonoscopia murino antes do terceiro ciclo de DSS (figura 3). Tempo adicional e um terceiro prato de resultados DSS em tumores maiores no momento da colheita (Figura 4). Uso de aplicação tópica Alcian blue mancha pode ser usada para destacar tumores (Figura 5). Fotografias de tumores de cólon vai ajudar a gerar medições de tumor que podem ser utilizados para comparar quantitativamente produção tumor e tamanhoentre os grupos experimentais (Figura 6). Fixos e parafina espécimes embebidos cólon pode então ser avaliada por histologia ou com a utilização de coloração imuno-histoquímica (Figura 7 e 8).
Figura 1. Esquema de OMA e administração DSS. AOM (10 mg / kg) é injectado no dia 0. No início da segunda semana (7 dias), com solução 2,5% de DSS é administrada a ratos na sua água de beber. Sete dias de DSS é seguida por duas semanas de água autoclavada. Um adicional de dois ciclos de DSS são administrados antes do sacrifício.
Figura de peso do rato 2. Relação à linha de base durante OMA e administração DSS. Note-se que na semana seguinte a cada ciclo de DSS, ratos los e 5-10% do seu peso corporal. A perda de peso neste experimento é um marcador para a gravidade da colite.
Figura 3. Ver de tumores no cólon distal por meio de endoscopia murino do dia 50 de OMA / DSS tratamento. Observe as múltiplas massas polipóides obstruindo o lúmen do cólon distai (b, c) em relação ao cólon normal (a).
Figura 4. Aberto longitudinalmente cólon do rato ilustrando aparência bruta de tumores. Note-se a mais elevada carga tumoral no cólon distai / recto (imagem superior esquerda), e a textura característica rugated do cólon proximal (imagem superior direita) com o crescimento do tumor pouco. Um fim acima da vista do cólon distal mostra inúmeros tumores de tamanhos variados (abaixo).
Figura 5. Tumores destacados pela aplicação de Alcian mancha azul. Note-se como o corante enfatiza a textura normal do cólon, bem como as fronteiras de cada tumor individual. Essa coloração pode ser útil na medição precisa de áreas de tumor por régua ou medida digital.
Figura 6. Representante distribuição do número médio de tumores por rato tratados com AOM / DSS. Note-se a maioria dos tumores são localizados no cólon distai e são <2 mm de tamanho.
Figura 7. Secções embebidas em parafina longitudinais do cólon em cassete (acima), umd no slide seguinte H & E mancha (abaixo). Note-se que Alcian azul residual mancha não interfere com H & E de coloração. Um grande tumor está circulado na imagem do slide (círculo). As designações "distal", "média" e "resultado" proximal de seccionamento todo o cólon em terços, entre o ceco eo ânus.
Figura 8. Histologia representativas de um tumor resultante do AOM / DSS administração no cólon distai. H & E, BrdU, e β-catenina lâminas coradas em 50X (painel superior) e 400X (painel inferior), respectivamente, demonstram alterações displásicas semelhantes a adenocarcinomas humanos do cólon.
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Discussion
O tratamento de ratos com AOM e DSS rapidamente e eficazmente modelos colite associada a cancro humano. Hipóteses sobre hereditárias factores que contribuem para a colite cancros associados pode ser facilmente estudado em ratos geneticamente modificados. 13, 16 Alternativamente, o efeito de alvos farmacológicos de colite associada a cancro pode ser estudada utilizando ratinhos de tipo selvagem.
Embora este modelo é altamente valorizado por aqueles interessados no estudo do desenvolvimento do tumor de cólon no cenário da inflamação, as limitações existem. A extensão da doença observada em ratinhos neste modelo pode variar consideravelmente dependendo da estirpe de murganhos e as condições de alojamento (gaiolas, alimentação microbiota, etc.) Suzuki et. al relataram que murganhos Balb / c foram os mais sensíveis a OMA / DSS, seguindo-se (por ordem decrescente de incidência do tumor e multiplicidade) C57BL/6N, C3H/HeN e ratinhos DBA/2N 17. Experiências envolvendo DSS e AOM sozinho no 129 / ratos Sv poderia prever um modotaxa de resposta ao tratamento combinado, semelhante a C57/BL6J ratos 18, 19. Assim, as experiências piloto pode ser necessário determinar os protocolos de dosagem mais eficazes, dependendo das instalações e recursos disponíveis. Enquanto OMA / DSS tumores no cólon se assemelham humanos câncer colorretal histologicamente, eles raramente apresentam metástase. A um nível molecular, as alterações β-catenina, a COX-2, e iNOS, mas não p53 têm sido relatados. Kanneganti et 20. ai. fornece uma visão geral completa de modelos alternativos para a indução da CAC para os interessados. 5
Para aumentar a reprodutibilidade dos resultados, recomendamos que os ratos de diferentes origens genéticas (como WT e batida gene específico fora camundongos) ser co-enjaulados em um patógeno específico instalação livre (SPF) 3-4 semanas antes do início do experimento, o que é especialmente importante se os ratos são recém entregues a partir de um criadouro comercial. Embora qualquer sexo e da mesma idade ratinhos podem ser utilizados, we observaram os resultados mais consistentes com todos os ratos do sexo feminino. As soluções estoque de OMA não deve ser utilizado se tiver mais de um ano, e que é importante a fim de evitar vários ciclos de congelação-descongelação de tais soluções. Severidade colite pode ser afetada pelo tipo de alimentação do rato usado também como fonte de DSS, esses fatores devem ser mantidos consistentes entre experimentos. Temos observado turbidez em garrafas DSS deixados em gaiolas de rato por períodos de tempo longos (> 4 dias) sugestivos de contaminação, portanto, de refrigeração e de preparação DSS frescos, no início de cada administração irá evitar esta complicação. Se alguns tumores desenvolver ou ratos morrerem prematuramente, Neufert et. ai. no seu resumo do protocolo OMA / DSS apresentar um quadro excelente de conselhos de resolução de problemas. 6
Uma vez que o AOM / DSS técnica para o desenvolvimento de colite associada a cancro é dominado, várias diferentes investigações adicionais destes ratos pode ser realizada. 21 A expressão do candidatogenes pode ser estudada em secções de tumor versus livre de tumor de cólon por meio de amplificação de PCR quantitativa de ARN extraído. Porque DSS em si pode interferir com este processo, recomendamos poli-A purificação antes da amplificação. 22 Porções de cólon pode ser flash congelado a ser estudada para a expressão da proteína por western blot. Investigadores da colite associada ao câncer pode estar interessado em marcadores visuais de proliferação celular. Para este fim, OMA / DSS ratos tratados podem ser injectados com bromodeoxiuridina (BrdU), 90 min antes do sacrifício; imunohistoquímica para esses documentos de núcleos marcados assim as regiões do cólon com o maior proliferação epitelial, tanto dentro de secções de tumor e livre de tumor. 23
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por DK089016 e L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS), e P30-DK52574 (para a Universidade Central Washington Research Digestivo Doenças). AIT era uma Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow Formação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma Aldrich | A5486-100MG | Stock solution: dilute to 10 mg/ml in distilled water to be kept at -20 °C as 0.5 - 1 ml aliquots. Working solution: dilute stock to 1 mg/ml in isotonic (0.9%) saline |
| Dextran Sulfate Sodium (DSS) | TdB Consultancy | DB001 | MW 40 kDa (36-50 kDa preparations from other sources are acceptable; The same lot should be used for a single experiment)6 |
| Coloview miniendoscopic system | Karl Storz | Multiple | See Becker et al. for detailed explanation of equipment and setup.11 |
| TPP Rapid FILTERMAX 500 ml Bottle-Filter, 0.22 μm PES | Midwest Scientific | TP99500 | Any standard tissue culture filter is acceptable |
| Ethyl Alcohol 200 Proof ASC/USP | Pharmaco-AAPER (or other) | 11ACS200 | Dilute to 70% in distilled water |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 4029405 | Place mouse in glass jar with gauze or a small cloth soaked in anesthetic |
| 18G Straight Gavage Needle | Braintree Scientific | N-008 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | Dilute to 1X (0.01 M) in distilled water |
| Cold Tray (Tissue Tek II Cold Plate) | Fisher Scientific | NC9491941 | Store at -20 °C |
| ImageJ Software | NIH (free download) | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Scientific | F79-500 | Dilute to 10% in PBS |
| BD Bacto Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Use hotplate to create 2% solution in distilled water |
| Miltex Eye Dressing Forceps | MedPlus Inc. | 18-780 | |
| Miltex Eye Scissors | MedPlus Inc. | 18-1430 | Curved points prevent damage to colon during opening. |
| Alcian Blue 8GX (powder) | Sigma Aldrich | A5268 | Add 1 g powder to 100 ml 3% acetic acid (3 ml glacial acetic acid + 97 ml distilled water) |
| 1 mL Tuberculin syringe with attached 26 G x 3/8 in intradermal bevel needle | BD | 305946 | For injection of AOM |
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