Summary
우리는 빠르게 친 염증성 에이전트 dextran 황산 나트륨 (DSS)의 세주기에 의해 다음과 일관되게 인간의 대장염에서 본 것과 morphologic와 분자 유사성과 마우스에 결장 종양을 생성 genotoxic 에이전트 azoxymethane (AOM)의 어느 관리의 프로토콜을 보여줍니다 암을 관련.
Abstract
이러한 Crohn의 질병 (CD) 또는 궤양 성 대장염 (UC)와 같은 염증성 장 질환이있는 개인 (IBD)는 건강한 개인을 통해 대장 암 (CRC)을 개발의 증가 위험이 있습니다. 이 위험은 널리 colonic 참여와 오랜 UC와 개인 30 %로 높이 누적 발병률과 질병의 기간 및 범위에 비례한다. IBD와 대장염 관련 암 (CAC)에서 1 Colonic 형성 이상은 결과로 개발 믿어 아르 이러한 세포는 만성 염증성 시토 킨 환경에 목욕을하는 동안 2. 자연과 대장염 - 관련 암이되는 adenocarcinomas의 질을 공유하는 동안 상피 세포 손상 및 수리의 반복주기를, 하부 분자 이벤트의 순서는 서로 다른 것으로되어 있습니다. 3이 차이는 CAC의 특정 동물 모델의 필요성을 주장하고있다.
여러 마우스 모델은 현재 CAC의 연구를 위해 존재합니다. Dextran 황산 sodi음 ... (DSS), colonic 상피에 직접 독성 효과 요원이 만성 염증 상태를 만드는 여러 사이클의 생쥐에 물을 마시는으로 시행 할 수 있습니다. 충분한 기간으로,이 마우스 중 일부는 종양을 개발합니다. 프로 발암 설정으로 시행하는 경우 4 종양 개발이이 모델에 크게된다. 이러한 tumorigenesis 경로에서 유전자 변이가있는 마우스 (APC, p53의, Msh2)뿐만 아니라, 마우스 genotoxic 대리인 (azoxymethane [AOM], 1,2 - dimethylhydrazine [DMH]) 5.이 사전 처리를 포함
대장염 관련 암에 대한 모델로 AOM과 DSS의 결합은 재현성, 효력, 낮은 가격, 사용의 용이성에 대한 인기를 얻었습니다. 사람들이 공유 메커니즘을 가지고 있지만, AOM은 DMH보다 솔루션에 더 강력한 안정적으로 발견되었습니다. 다른 모델에서 종양이 개발은 일반적으로 필요로하는 동안 몇 개월은 AOM과 함께 주입하고 이후 DSS로 치료 쥐에 충분한 종양을 개발S 7~10주로 조금. 6, 7 마지막으로, AOM과 DSS는 특정 tumorigenic 변형에 크로스 번식없이 유전 배경 마우스 (유전자 변형 등을 끊는)로 관리 할 수 있습니다. 여기, 우리는 10 주 동안 DSS 세 7 일 사이클 뒤에 AOM의 단일 주사를 이용하여 마우스에 염증 기반 colonic tumorigenesis에 대한 프로토콜을 보여줍니다. 이 모델은 밀접하게 인간의 CAC에서 발생하는 사람들을 닮은 조직 학적 및 분자 변화에 종양을 유도하고이 병에 oncogenesis과 화학 예방의 연구에 매우 중요한 모델을 제공합니다. 8
Protocol
1. 대장염 - 관련 암 유도
- 섹스 케이지와 실험 및 제어 그룹에 사용되는 나이와 일치하는 6~8주 오래된 쥐를 따로 설정합니다. 마우스는 개별적으로 꼬리 표시 또는 귀 클립으로 표시 할 수 있습니다.
- 일 0, 기록 기준 가중치를 켜고 10 AOM 작업 솔루션의 MG / kg (dH2O의 10 MG / ML 주식 솔루션에서 희석 등장 생리 1 MG / ML은 -20 ℃ 일 C에서 보관)와 각 마우스 intraperitoneally (IP)을 주입 . 경험을 바탕으로,이 용량은 7-14 밀리그램 / kg 및 / 사이에 조정 또는 초기 실험에서 반복 할 수 있습니다.
주의 : AOM은 불안정 genotoxic 요원과 함께 MSDS에 따라 신중하게 처리해야합니다. Dilutions는 화학 후드에서 준비 얼음에 유지하고, 기관 특정 프로토콜에 따라 폐기해야합니다.
- 0.22 μm의 셀룰로스 아세테이트 F 조를 통해 (2.5 g/100 ML) 증류수와 패스의 DSS 솔루션을 2.5 %을진공의 ilter. 이 용량은 마우스 변형 및 환경에 따라 1-3.5 % 사이에서 조정할 수 있습니다. 최대 1 주일에 한 번 준비 DSS 솔루션은 냉장 보관 할 수 있습니다.
- 에서 하루에 7, 자신의 식수로 마우스로 공급 DSS 솔루션입니다. 약 250 ML / 케이지는 새로운 DSS는 5 마우스 / 케이지의 최대 제공 될 때마다이 필요합니다하지만, 이러한은 견적하고 동물 시설에서 사용 물 병의 유형에 따라 달라집니다.
- 7 일 동안 DSS의 연속적인 공급을 제공하기 위해 DSS 솔루션은이 기간 동안 깨끗한 병 세 번 (매주 2-3일)에서 교체해야합니다. 일부 수사관들이 노출의 척도와 같은 새로운 솔루션으로 교체하기 전에 소비 DSS의 양을 측정합니다.
- 일 14 일 두 주 동안 다시 표준 마시는 물 새장을 전환 할 수 있습니다.
- 단계를 반복 (1.4) - (1.6) 일 28 49에은 DSS의 두 번째 및 세 번째 사이클을 제공합니다. DSS "사이클"은 마실 물에 DSS의 1 주일 구성일반 (autoclaved) 물 2 주 뒤에.
2. 임상 평가 대장염 및 종양 진행
- 마우스는 무게 / 2 ~ 3 배 주당를 관찰해야합니다. 기준에 상대적인 비율 체중 감소는 대장염의 심각성의 대리 측정으로 사용됩니다. 직장 출혈, 설사, 또는 탈출의 정기 평가는 다양한 점수 시스템에 따라 실험 목표에 따라 만들어보고 할 수 있습니다. 9, 10
- 설사 직장 출혈로부터 2-3 일 이상의 함께 10 %까지의 체중 감소는 DSS (매일 관찰이 바로 후 DSS 기간 동안 유용 할 수 있음)의 전체주기에 따라 주 예상 할 수 있습니다.
그것은 어떤 쥐가 복구하지 않을 수 있습니다, 자신의 체중의 20 % 이상을 잃을 마우스는 생존 할 가능성이 줄어들 및 조기 안락사를 필요로 할 수 있습니다. 0.5의 단일 IP 분사 - 같은 쥐 1.0 ML의 생리는 flui를 수정으로 유용한 지원 조치 할 수 있습니다 D 볼륨 설사로 인해 잃었습니다.
3. 손쥐 내시경 (선택 사항)
- DSS의 제 2 또는 제 3주기에 따라 내시경 전에 희생 할 생체 내 종양 성장을 확인하기 위해 수행 할 수 있습니다. AOM / DSS 모델은 종양을 생산에 매우 신뢰성으로,이 단계는 일반적으로 필요하지 않습니다. 이 마우스 종양을 방해 할 수있는 가능성이로 몇 마우스는이 방법을 사용하여 평가해야합니다. 11
- 흡입 또는 injectable 진정 작용과 함께 마우스를 마취.
- 마우스 anesthetized되면 꼬리와 가슴에 테이프로 평면 보드에 마우스를 고정하십시오.
- 마우스 항문은 부드럽게 intraluminal보기를 개선하고 지저분한 내용을 제거 할 수 급증하고 관개하는 생리 사용에 손쥐 내시경을 부활 시켰습니다. (내시경도 생리에 대한 대안이 기술로 공기 insufflation를 사용하여 수행 할 수 참고 종양의 개선 시각화를 제공 할 수 있습니다. 12)
- 일 70에서 각 AOM / DSS 처리 마우스는 여러 결장 종양 항구와 평가를위한 준비가되어 있어야합니다. 큰 종양이 원하는 경우이 기간은 개월 주 정도 지연 될 수 있습니다. (주의, prolapsed 심각한 직장이있는 마우스는 기관 동물 보호위원회에 따라 동물에 과도한 불편 함을 피하기 위해 조기 euthanized해야 할 수도 있습니다.)
- 검시하기 전에, 개별적으로 isoflurane과 자궁 전위 (또는 다른 제도가 승인 한 방법)으로 쥐를 안락사시켜야. 최종 무게 및 기타 측정이 시간에 만들 수 있습니다.
- 도마에 노출의 복부 측면으로 마우스를 놓는다. 대장 추출하는 동안 복부 내용을 오염 머리카락을 방지하기 위해 70 %의 에탄올과 복부를 커버.
- 복부의 중간 선을 파악하고 복막을 노출 할 수있는 작은 절개를 만들기 위해 집게를 사용하십시오.
- 늑골 margi 함께 복부의 각면에이 절개를 확장N.
- 콜론은 anorectal 교차점으로 수확 할 수 있도록 골반을 끊으 가위를 사용합니다. DSS의 대장염 부상은 말초 직장에서 가장 큰이며, 따라서,이 가장 큰 종양이 개발 지역이기 때문에이 중요합니다.
- 이러한 창 자간 막 림프절 등의 추가 조직도이 시간에 수확 할 수 있습니다.
5. 매크로 분석을 위해 대장 준비
- 5 ML의 주사기에 부착 18G gavage 바늘 사용, 얼음처럼 차가운 physiologic 방향으로 유체 이탈이 생리 (PBS) 등 인산 버퍼로 콜론를 플러시. 콜론 조직은 RNA 또는 단백질 기반의 분석을 위해 사용됩니다 경우에는 사전에 차가운 작업 트레이를 채용하여 감기에 보관 할 수 있습니다.
- 추위 트레이로의 장간막과 페인트를 따라 길이 방향으로 플러시 콜론을 엽니 다. 종양이 대장이 어두운 표면에 배치 될 때 더 쉽게 시각화 수 있습니다. 또한, 1 % Alcian 파란 염료는 t을 강조하기 위해 적용 할 수있는umors. 자 또는 디지털 캘리퍼스와 종양 번호와 크기를 평가합니다.
- 종양과 인접한 정상적인 조직의 작은 부분은 조직 학적 평가를위한 나머지 대장의 일부를 남겨두고 RNA, 단백질, 또는 immunohistochemical (IHC) 방법으로 향후 분석을 위해이 시점에서 excised 수 있습니다.
즉시 단계 5.2에 따라 총 결장 표본의 디지털 사진 위에 설명 된대로 콜론의 상당 부분은 분석의 다른 형태의 excised 특히 경우, 종양 부담의 정확한 분석을 위해 도움이 될 수 있습니다. 종양 부담 (%)는 등 ImageJ로 무료 소프트웨어를 사용 종양 지역 / 총 콜론 지역으로 계산 될 수있다.
6. 조직 학적 평가의 대장 준비
- 주사기 또는 손가락을 통해 추위를 트레이에 남아있는 콜론에 포르말린 10 %를 적용합니다. 조직이 방식으로 최소 30 초에 해결 할 수 있도록하는 것은 고정 분지로 전송을 용이하게한다. 포르말린 확인 잔류 wip입니다에드에서 이전에 같은 트레이에 새로운 오픈 콜론을 색칠합니다.
- 10% 포르말린로 가득 분지에 콜론을 전송하고 가장자리가 아래로 핀.
- 고정의 3 시간 후, 70 % 에탄올에 콜론을 전송할 수 있습니다. 콜론은 무기한으로 70 % 에탄올에 보존 할 수 있습니다.
- 콜론 (직장 / 말초, 미드, 근위)의 세 세로 섹션은 2 %의 한천에 안정화와 파라핀 퍼가기 위해 제출 할 수 있습니다. 근위 콜론과 콜론 / 직장 말초 각 마우스에 대한 균일 한 방식으로 방향 있으니 안심하십시오.
- 형성 이상, 토굴 손상과 염증은 이전에 다음 ID로 출판 프로토콜에 따라 경험이 풍부한 개인에 의해 설명하고 평가 할 수 있습니다. 실험은 초기 dysplastic 이벤트를 감지에 관심이 경우 10, 13-15 마우스는 일 70 이전에 희생 할 수 있습니다.
7. 대표 결과
여기에 설명 된 AOM / DSS 모델은 연구자가 안정적으로 마우스에 결장 종양을 생성 할 수 있습니다.이 모델에서 종양 성장은 직접적으로 연관된 염증 과정에 의해 영향을받습니다. 대장염의 심각도는 설사 / hematochezia의 체중 감소 및 현재 (그림 2)에 따라 임상 적으로 모니터링해야합니다. 질병 활동이 신호는 DSS가 제거 된 후에 DSS 사이클의 날 (5)에 의해와 4 개 이상의 일을 시작하는 경향이 있습니다. 드물게 상당한 직장 종양 부담이있는 마우스는 직장 탈출증을 개발 할 수 없습니다. 제 2 또는 제 3 DSS주기 설사는 영구적 될 수 있습니다 후. 일반적으로 종양 전에 DSS의 세 번째 사이클 (그림 3)에 손쥐 검사법으로 현재와도 확인할 수있다. 추가 시간과 수확의 시간 (그림 4)에서 더 큰 종양의 DSS 결과의 세 번째 코스입니다. 얼룩 붙이기도 적용 Alcian 파란의 사용은 종양 (그림 5) 강조하기 위해 사용할 수 있습니다. colonic 종양의 사진은 양적 종양 생산과 크기를 비교하는 데 사용할 수있는 종양 측정을 생성에 도움이 될 것입니다실험 그룹 사이 (그림 6). 고정과 파라핀 임베디드 결장 표본 그런 다음 조직학 또는 immunohistochemical 얼룩의 사용 (그림 7, 8)을 평가 할 수 있습니다.
그림 1. AOM과 DSS 관리의 도식. AOM은 (10 MG / kg) 일 0에 주입된다. 두 번째 주 (7 일)의 시작 부분에서 2.5 % DSS 솔루션들은 식수의 생쥐에 투여합니다. DSS 7 일이 autoclaved 물을 2 주 뒤에 있습니다. DSS의 추가 두 사이클은 희생 사전에 관리하고 있습니다.
AOM과 DSS 관리 기간 동안 기준에 비해 그림 2. 마우스 무게. 주, 마우스 로스를 각 DSS주기를 따라합니다 자신의 몸무게의 전자 5~10%. 이 실험에서 체중 감량 대장염의 심각성에 대한 대리 마커입니다.
그림 3. AOM / DSS 치료 일 50 손쥐 내시경을 통해 말초 콜론에서 종양의보기. 일반 콜론에 비해 말초 콜론의 내강을 방해 여러 polypoid 대중 (B, C)를 (A) 있습니다.
그림 4는. 길이 방향으로 종양의 총 모양을 보여주는 마우스 콜론을 열었습니다. 콜론 / 직장 (왼쪽 상단 이미지) 말초에서 높은 종양 부담하고, 작은 종양의 성장과 근위 대장 (오른쪽 상단 이미지)의 특성 rugated 질감을합니다. 말초 콜론의 전망을 최대 가까이는 다양한 크기 (아래)의 다양한 종양을 보여줍니다.
Alcian 파란의 응용 프로그램에 의해 강조 그림 5. 종양 얼룩. 염료는 대장의 정상적인 질감뿐만 아니라 각 종양의 국경을 강조하는 방법 있습니다. 이러한 착색은 통치자 또는 디지털 측정하여 종양 영역의 정확한 측정에 도움이 될 수 있습니다.
그림 6. AOM / DSS로 치료 마우스를 당 종양의 평균 개수의 대표 유통. 종양의 대부분은 말초 콜론에 자리 잡고 있습니다 참고 및 크기에 <2mm 있습니다.
그림 7. 파라핀 - 임베디드 (위) 카세트의 대장의 길이 방향 섹션H & E 다음 슬라이드에서 D (아래) 얼룩. 그 잔여 Alcian이 얼룩 푸른 H & E의 착색을 방해하지 않습니다. 큰 종양은 슬라이드 이미지 (원)에 동그라미되어 있습니다. 지정 "말초", "중간"및 "이게 맹장과 항문 사이의 3에 전체 콜론을 sectioning에서 근위 '결과.
그림 8. 말초 콜론에 AOM / DSS 관리로 인한 종양 대표 조직학. H & E, BrdU, 그리고 (맨 위 패널) 50X와 400 배로 확대 한 β-catenin 스테인드 슬라이드 (아래 패널) 각각 콜론 인간의 adenocarcinomas와 유사한 dysplastic 변경 사항을 보여줍니다.
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Discussion
신속하고 효율적으로 모델을 인간 대장염 - 관련 암 AOM과 DSS있는 마우스의 치료. 대장염 - 관련 암에 기여 요소를 물려 전할 수있는에 관한 가설을 쉽게 유전 공학 마우스와 함께 공부 할 수 있습니다. 13, 또는 16, 대장염 - 관련 암의 pharmacologic 목표의 효과가 야생 형 생쥐를 고용하여 공부 할 수 있습니다.
이 모델은 높은 염증의 설정에 결장 종양 개발의 연구에 관심을 가진 자에 의해 가치를하는 동안, 제한이 존재합니다. 이 모델의 생쥐에서 관찰 질병의 정도는 상당히 마우스 변형 및 주택 조건 (caging, 먹이, microbiota 등)에 따라 달라질 수 있습니다. 스즈키 동부 표준시. 알은 Balb / C 마우스는 (종양 발생과 다양성을 감소 위해) / 129에서 혼자 DSS와 AOM를 포함 C57BL/6N, C3H/HeN 및 DBA/2N 마우스. 17 실험 뒤에 AOM / DSS에 가장 민감한 있다는보고 SV 마우스는 모드를 예측 것C57/BL6J 마우스 18, 19과 유사한 결합 치료 속도 응답. 따라서, 파일럿 실험이 가능 시설과 자원에 따라 가장 효과적인 주입 프로토콜을 결정해야 할 수도 있습니다. 콜론의 AOM / DSS 종양 histologically 인간의 대장 암과 유사하지만, 그들은 거의 전이을 전시하지 않습니다. 분자 수준에서 β-catenin, COX-2 및 iNOS하지만, p53의에 변경이보고되었습니다. 20 Kanneganti 동부 표준시가. 알이 있습니다. 관심에 대한 CAC의 유도를위한 대안 모델의 철저한 개요를 제공합니다. 5
결과의 재현성을 향상하기 위해, 우리는 서로 다른 유전 적 배경 (예 : WT와 마우스 아웃 유전자 특정 노크 등) 3-4주 전에 실험 시작에 특정 병원체 무료 (SPF) 시설에서 공동 갇힌 수의 쥐를 권장합니다,이입니다 마우스 경우 특히 중요 새로 상업 사육 시설에서 전달됩니다. 모든 섹스와 나이와 일치하는 마우스를 사용할 수 있습니다 있지만, we는 모든 여성 생쥐에서 가장 일관된 결과를 관찰했습니다. AOM 재고 솔루션은 이전 1 년 이상있는 경우 사용하고,이 솔루션의 여러 냉동 해동 사이클을 방지하는 것이 중요합니다되어서는 안됩니다. 대장염의 심각성은 잘 DSS 소스로 사용되는 마우스 피드의 종류에 따라 영향을받을 수 있으며 이러한 요소는 실험 사이의 일관성을 유지해야합니다. , 따라서 냉동하고 각 행정의 시작에서 신선한 DSS를 준비하면이 합병증을 피할 것, 우리는 오염의 암시 오랜 기간 (> 4 일)에 마우스 케이지에 남아 DSS 병에 탁도를 관찰했습니다. 몇 종양 개발하거나 마우스는 성급하게 Neufert 동부 표준시 죽을하십시오. 알이.의 AOM / DSS 프로토콜 요약 문제 해결 조언의 훌륭한 테이블을 제공합니다. 6
대장염 - 관련 암의 개발을위한 AOM / DSS 기술이 마스터되면,이 마우스의 여러 가지 추가 조사를 수행 할 수 있습니다. 21 후보의 표현유전자가 추출 RNA의 정량 PCR 증폭을 통해 대장의 종양이 대 종양이없는 부분에서 공부 할 수 있습니다. DSS 자체가이 과정을 방해 할 수 있기 때문에, 우리는 증폭 이전에 폴리-A 정화를 권장합니다. 대장 22 일부 서양 얼룩에 의해 단백질의 발현을 위해 공부를 할 냉동 플래시 할 수 있습니다. 대장염 - 관련 암의 수사관은 세포 증식의 시각적 표시에 관심이있을 수 있습니다. 이를 위해 AOM / DSS 처리 쥐들이 bromodeoxyuridine (BrdU) 희생 할 전에 90 분으로 주입 될 수있다, 종양과 종양이없는 부분에서 모두 가장 상피 확산과 콜론에 잘이 표시 핵 문서 영역에 대한 immunohistochemistry. 23
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 DK089016와 L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS) 및 P30-DK52574 (워싱턴 대학 소화기 질환 연구 코어까지)에 의해 부분적으로 재정 지원을했습니다. AIT는 하워드 휴즈 의학 연구소 의학 연구 교육 연구원이었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Azoxymethane (AOM) | Sigma Aldrich | A5486-100MG | Stock solution: dilute to 10 mg/ml in distilled water to be kept at -20 °C as 0.5 - 1 ml aliquots. Working solution: dilute stock to 1 mg/ml in isotonic (0.9%) saline |
| Dextran Sulfate Sodium (DSS) | TdB Consultancy | DB001 | MW 40 kDa (36-50 kDa preparations from other sources are acceptable; The same lot should be used for a single experiment)6 |
| Coloview miniendoscopic system | Karl Storz | Multiple | See Becker et al. for detailed explanation of equipment and setup.11 |
| TPP Rapid FILTERMAX 500 ml Bottle-Filter, 0.22 μm PES | Midwest Scientific | TP99500 | Any standard tissue culture filter is acceptable |
| Ethyl Alcohol 200 Proof ASC/USP | Pharmaco-AAPER (or other) | 11ACS200 | Dilute to 70% in distilled water |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 4029405 | Place mouse in glass jar with gauze or a small cloth soaked in anesthetic |
| 18G Straight Gavage Needle | Braintree Scientific | N-008 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | Dilute to 1X (0.01 M) in distilled water |
| Cold Tray (Tissue Tek II Cold Plate) | Fisher Scientific | NC9491941 | Store at -20 °C |
| ImageJ Software | NIH (free download) | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Scientific | F79-500 | Dilute to 10% in PBS |
| BD Bacto Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Use hotplate to create 2% solution in distilled water |
| Miltex Eye Dressing Forceps | MedPlus Inc. | 18-780 | |
| Miltex Eye Scissors | MedPlus Inc. | 18-1430 | Curved points prevent damage to colon during opening. |
| Alcian Blue 8GX (powder) | Sigma Aldrich | A5268 | Add 1 g powder to 100 ml 3% acetic acid (3 ml glacial acetic acid + 97 ml distilled water) |
| 1 mL Tuberculin syringe with attached 26 G x 3/8 in intradermal bevel needle | BD | 305946 | For injection of AOM |
References
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