Medicine

NADH的荧光成像隔离双心室工作离体兔心

Published: July 24, 2012 doi: 10.3791/4115

Huda Asfour¹, Anastasia M. Wengrowski¹, Rafael Jaimes III¹, Luther M. Swift², Matthew W. Kay¹

¹Electrical and Computer Engineering Department, The George Washington University, ²Pharmacology and Physiology Department, The George Washington University

Summary

目标是在生理前，后负荷压力的情况下离体心脏的线粒体氧化还原状态监测。提出了一个双心室工作兔心脏模型。高时空分辨率的NADH荧光成像是用来监测线粒体外膜组织的氧化还原状态。

Abstract

离体心脏的Langendorff ¹成立以来，仍然是一个突出的工具，学习心脏生理^2。然而，它不能很好地适合心脏代谢的研究，这需要在生理前，后负荷压力的情况下执行工作的心脏。尼利介绍修改的Langendorff技术，建立适当的左心室（LV）的前，后负荷压力^3。模型被称为孤立的LV工作心脏模型，并已被广泛用于研究LV的性能和代谢^4-6。然而，这种模式下，不提供正确加载的右心室（RV）。 demmy 等人。首次报道了修改LV的工作心脏模型^7，8 1双心室模型。他们发现，每搏输出量，心输出量和压力，发展，提高在工作的LV模式转换为双心室工作模式⁸心8输出主动脉，肺血流量，平均动脉压，心脏率，心肌ATP水平。

研究，如缺血，心肌损伤的代谢作用时，它往往是必要的，以确定受影响的组织位置。这可以通过成像的NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的简化形式^）9-11荧光，辅酶大量的发现在线粒体。 NADH的荧光（fNADH）的显示与当地的氧气浓度¹²附近的线性反比关系，并提供了线粒体氧化还原状态的措施^13。 fNADH成像在缺氧和缺血性条件已被用作染料的方法，以确定缺氧地区^14，15和监察进展随着时间的推移¹⁰缺氧的条件。

该方法的目的是监测期间的协议，改变心肌细胞的新陈代谢率，或引起缺氧或创建一个组合两个双心室工作心线粒体氧化还原状态。从新西兰白兔的心被连接到1双心室工作心脏系统（雨果萨克斯Elektronik公司）和改性的克雷布斯-Henseleit溶液¹⁶灌注在37°C。记录主动脉，左心室，肺动脉，左，右心房压力。使用单相动作电位电极的电活动。到图像fNADH，从汞灯的光过滤（350±25纳米），用来照亮的外膜。发出的光被过滤（460±20纳米）和CCD相机成像使用。在双心室心外膜fNADH的变化，在不同的起搏率。心脏模型和fNADH成像的结合为研究内的急性心肌病理生理条件下现实的情况下提供了一个新的，有价值的实验工具。

Protocol

1。设立研究

准备四个改性克雷布斯Henseleit溶液¹⁶升（MM： _氯化钙，1.20，2.00，3.30氯化钾118氯化钠，24.0 _硫酸镁 1.20碳酸氢钠_{3，KH 2} PO _4计，10.0葡萄糖，2.00 NaPyruvate，和20.0毫克/ L，白蛋白）。应准备开始实验尽可能接近的解决方案。（孔径：22微米，康宁）无菌过滤后，pH值应调整至7.4。溶液渗透压，应该是275和295 mOsm /公斤之间。
用纯化水冲洗管和商会的工作心脏系统。从系统中删除，直到所有的水已经运行泵。
添加纤维素膜过滤器（孔径5微米，Advantec）在用灌注泵（Langendorff灌流泵，左心灌注泵，右心灌注泵）。
执行每个压力传感器的两点校准（0和60毫米汞柱）。
打开水洗澡。一个加热循环水浴（科尔帕尔默）用于地暖的水套式管和热交换器。灌流预温在一个单独的水浴（Oakton仪器）。这两个浴场保持溶液温度37℃
打开泵在一个闭环循环灌流。灌流通过毒气95％O ₂和5％的CO ₂在80千帕的超细纤维氧合（hemofilters）的传递。含氧灌流然后流入维持在温度为37°C，进入心脏插管前，通过热交换器。

2。心脏切除

首先，设置工作心脏系统的工作在恒压的Langendorff模式。将主动脉块范围内的50至60毫米汞柱的压力。
麻醉兔子肌肉注射氯胺酮（44毫克/公斤）和甲苯噻嗪（10毫克/千克）。后兔是镇静剂，巴比妥（50毫克/ K的g）和静脉注射肝素（2000美）通过耳缘静脉或后肢内侧的横向的大隐静脉。
当兔子是完全不响应，缺乏对疼痛反射确定，胸腔被迅速拉开，心包切片，被夹住主动脉，心脏和肺被切除。肺部此时应留在心脏，以帮助隔离肺静脉。
隔离和cannulate主动脉直径5毫米的套管附加到洋溢着60毫升灌流和200单位肝素注射器。确保主动脉零号丝线缝合的套管，慢慢压下注射器冲洗心脏的血液。

3。双心室插管

连接心脏的工作心脏系统的主动脉块。防止空气进入主动脉，可引起冠状动脉栓塞。这是最好的导管主动脉BL玉珠由接近在斜角主动脉的连接和允许灌流轻轻滴入套管连接器，而它是连接。
虽然心灌注在恒压的Langendorff模式，去除脂肪和结缔组织，并找到以下的船只：劣质和上腔静脉，奇静脉，肺动脉，肺静脉。
结扎，上腔静脉。肺动脉略低于削减地方分支机构的左，右肺动脉。
集团余下的所有船只之间的心脏和肺部，并使用1缝合结扎他们（肺静脉）。取出的肺部。
切左心耳在角落的小孔。确保洛杉矶灌流充满。同时确保完全充满灌流套管，当它被插入Cannulate洛杉矶。缝合左心耳插管。
打开泵（泵＃2）左侧提供流动到T他左心房。设置2 - 6毫米汞柱，并调整±2毫米汞柱，确定心房扩张之间的预压力。
关闭的Langendorff泵（泵＃1）心脏的工作模式切换心。
一度减少到10毫米汞柱的主动脉压力，然后慢慢增加80至100毫米汞柱的范围内。这将允许打开和运作，因为它会在正常生理条件下的主动脉瓣。最终的负荷压力将取决于的LV收缩。它应设置一个值，比高峰期左室压力减少了约20毫米汞柱。
测定左室心输出量可以通过测量流量的灌流，退出的主动脉块（毫升/分钟）。正常心输出量是14.77和16.43毫升/每分钟100体重¹⁷克和平均340毫升/分钟为2.2公斤的兔子。主动脉压力应类似于图1所示的压力信号。
通过I Cannulate的RAnferior腔静脉。确保RA和套管完全充满灌流，并插入导管，同时防止形成气泡。缝合静脉插管。
打开右侧泵（泵＃3）提供流至右心房。设置约3毫米汞柱的压力。
确保房车充满灌流，并cannulate肺动脉。确保套管完全充满灌流，同时它插入，以防止气泡。缝合肺动脉插管。

4。信号采集：压力，单相动作电位，fNADH

双心室插管完成后，小心地插入主动脉的主动脉插管通过压力传感器导管（米勒）。轻轻地浏览过去的主动脉瓣和进LV。监察LV压力信号，以确保导管尖端的正确定位。例如LV的压力在图1。
轻轻按压对心室外膜单相动作电位电极。监测的信号，以实现相应的动作电位测量。在信号轻微的运动伪影是正常的。
一个双极刺激电极放在右心房步伐心。在我们的协议，心中节奏的周期长度在300和150毫秒之间，相应的，分别以200和400 BPM。
测量左室心外膜表面的温度。如果研究的需要，温度保持在37°C，然后放置心内的水套的心腔或淹没在加热灌流浴心保持一个恒定的温度，整个心。
定位的CCD相机（安道尔IXON DV860 128x128像素）和聚焦镜头等观察认为适当的领域。将相机连接到工作站和图像以2 fps收购使用安道尔SOLIS softwa重。
打开汞灯灯前开始的成像。通过激发滤光片（350±25纳米，色度技术）和光纤光导（HORIBA Jobin Yvon的模型1950-1M）的光被照亮的心脏表面。紫外线光通过光导衰减小。紫外线照射也可提供高功率LED LED射灯组成的系统（Mightex PLS-0365-030-S的）和一个控制单元（SLC-SA04美Mightex）。
关闭室内灯光，并尽量减少任何环境照明。着眼于心脏的光导（或LED射灯）套圈，以实现统一的外膜照明。发出的NADH的荧光（fNADH）通过排放过滤器（460±20 nm的色度技术），是由CCD相机的成像。
监测使用的成像软件的兴趣选择一个地区一段时间fNADH改变。选择生活的更新模式，以监测区域内的直径平均像素强度f利益。
心应在双心室工作模式运作，以产生适当的压力。 fNADH水平应该是在外膜表面低而稳定，以确认足够的冠状动脉灌注。在这点在研究一个具体的实验协议应实施测试假说。
当研究完成后，从系统中删除的心脏，并排出所有的灌流。纯净水冲洗系统管和商会。对于日常维护，系统应定期清洗Mucasol解决方案或稀释的双氧水，需要。

5。脱机处理fNADH图片

一种方式比较NADH的数据集（fNADH（I，J，T））之间的实验是每个荧光图像，参考图像（正常化fNADH（I，J，T _0））从⁹数据集，如以下公式所示。 NADH的荧光正常化的另一种方法是对PL王牌小块的铀玻璃在实验前^9，18，19场的观点。铀玻璃将荧光紫外灯提供一个可以用来作为一个稳定的参考信号亮起时（450 - 550纳米）。

式（1）

6。代表结果

如图1所示的双心室兔心脏的准备前，基底意见。左心室压力测量航行过去的主动脉瓣进入左心室压力传感器导管（米勒SPR-407）。主动脉，肺动脉，左心室压力压（LVP）在图1C所示。通常是介于0和10毫米汞柱，舒张压LVP的。最低的舒张主动脉压力是约60毫米汞柱。收缩期峰值LVP是依赖于充盈压（预置或洛杉矶压力）和收缩，优化，应该是80和100毫米汞柱之间。最大的主动脉压力和LVP的最大应密切配合，如在图1C所示。

单相动作电位快速去极化相和复极阶段，是典型的离体兔心（图） 如图1D所示。地图可以相对容易地记录从承包的心，但通常会在舒张小运动伪影， 如图1D所示。地图是用于心脏起搏时（捕获）确认成功夹带，也可以用来衡量当地因缺血或其他急性扰动的电生理改变。心电图也可以测量淹没在浴温暖灌流心脏和电极放置在心脏的左，右两侧的浴。第三无动于衷电极被放置在洗澡，远离心脏，或连接到主动脉。心电图将提供全球激励和复极过程，这是评估整体的电气功能和揭示存在缺血的有用信息。

fNADH成像揭示了心脏的线粒体氧化还原状态的变化，它可以用来测量缺血或缺氧地区的时空进展。在这项研究中，心外膜fNADH测量监控的氧化还原状态的变化，在三个周期长度（CLS），300，200，150毫秒的起搏率。平均fNADH值从感兴趣的区域（红色框， 图2）显示，基线fNADH水平提高，为缩短周期长。当起搏率接近窦性心律（CL = 300毫秒）基线fNADH水平相对恒定。随着周期长度缩短低于300毫秒，“基线fNADH水平的提高，在最短的CL（150毫秒）的增幅最大。高的决议fNADH成像充分的前表面在200和400 BPM是如图3所示。 200 BPM fNADH水平不变和空间均匀。 BPM在400，fNADH水平大幅增加，整个心外膜。显着的空间异质性，观察RV和LV隔地区内发生的最大升幅。

收缩（运动伪影）fNADH信号振荡，振荡频率对应的心跳率（ 图2）。在双心室插管，心脏的基地举行4套管，这有助于防止心脏收缩时的摆动。因此，振荡幅度总是比任何更长的时间尺度（5-10秒）在fNADH的趋势，缺血或缺氧引起的。

图1。典型的压力，从一个孤立的双心室单相动作电位工作RABBIT心脏。显示四个套管心脏基底观点：2，肺动脉，主动脉，左心房，右心房B.前视图显示心脏的左心室（LV）和右心室。（右）。C.代表的压力。热门：左心室压力（实线）和主动脉压力（虚线）。底部：D.肺动脉高压的代表单相动作电位。在面板C. 点击这里查看大图所示的压力信号对齐。

图2。离体兔心脏双心室fNADH成像。顶部：一个视图（左）和三个fNADH图像领域的卡通显示。每个图像上相应的起搏周期长度（CL）表示。红色框表示地区的利益为底部面板fNADH的信号。单相动作电位电极的尖端被看作是在该地区的利益的权利。心外膜汞灯和光导照明使用， 如图5所示。只底：心外膜表面被照亮了周围地区的利益。平均fNADH由该地区的利益，在顶部面板中的红色框表示。缩短生产周期长的的平均fNADH增加。

图3。完整的离体兔心脏双心室前壁表面fNADH图像。心脏是从RA在200 bpm和400 BPM的节奏。 fNADH被拍摄（2 fps的128×128像素分辨率0.4毫米），同时使用两个高功率LED（Mightex PLS-0365-030-S 365纳米，4％，照亮了整个前外膜我ntensity，最大50毫瓦）。

Discussion

孤立的Langendorff灌流心脏仍然是一个突出的工具，学习心脏生理^2。尤其是心律失常，尤其是那些使用荧光成像跨膜电位²⁰研究有用。一个优势是整个离体心脏的外膜，可观察到^21，22。另一个优点是，在血液中，有一个明确的晶体缓冲溶液灌注不干扰荧光信号。限制的Langendorff技术是没有良好的心脏的代谢，这往往需要在生理前，后负荷压力的情况下执行工作的心脏研究适合。

为了提高离体心脏的准备工作相关的代谢研究，尼利介绍修改的Langendorff技术，建立适当的左心室（LV）的前，后负荷压力^3。模型被称为孤立的LV工作心脏模型，并已被广泛用于研究LV的性能和代谢^4-6。 LV的工作心脏模型是优于功能评价Langendorff模型，但它并没有提供正确加载的右心室（RV）。 demmy 等人。首次报道了修改LV的工作心脏模型^7，8 1双心室模型（低压及RV）。他们发现，每搏输出量，心输出量和压力，发展，提高在工作的LV模式转换为双心室工作模式⁸心。一个正确加载的房车，也提高整个鼻中隔的异常压力梯度递减的间隔功能。双心室工作的心已被证明保持长达3小时⁸输出主动脉，肺血流量，平均动脉压，平均肺动脉高压，心脏率和心肌ATP，磷酸肌酸水平。双心室心脏研究工作通常使用心FROM小动物，如大鼠和家兔，由于心输出量和的灌流所需量是远远高于大型动物的心。然而，双心室心脏研究工作已进行了从猪，犬，甚至人类^23，24的心中。

双心室工作模式的离体心脏的代谢需求大大高于Langendorff灌流。重要的是，灌流的解决方案提供足够的氧气和代谢底物，以支持双心室心脏功能。标准晶体缓冲的解决方案，如克雷布斯-Henseleit ^16，17，25或Tyrodes ^26，27，有氧气的溶解度高达5.6毫克/ L。当这些解决方案毒气carbogen（95％O ₂和5％的CO ₂气体混合），并包含合适的代谢底物（葡萄糖，葡萄糖，和/或丙酮酸钠），它们是适用于双心室工作在规范跳动的心人窦率（兔子约180 BPM）。

快节奏的代谢需求增加和标准灌流液中溶解氧量可能不足以充分支持双心室工作的心，在高利率承包。晶体缓冲区含有红细胞或全血混合的解决方案已用于心脏的准备工作，以确保足够的氧气供应。以往的研究表明，添加到的克雷布斯-Henseleit溶液的红细胞，改善工作心脏功能，并在严格的起搏协议第¹⁶心室颤动的发生率也减少了。一个限制使用全血红细胞或混合物，是血红蛋白的干扰与光的波长，用于荧光成像^13。其他基板，如白蛋白，也可添加到灌注液解决方案，延长心脏活力，减少水肿^28。

在荧光成像激发光的强度高，光线分布应均匀。实现均匀的照明，是不是总是很容易，由于外膜表面的曲率。在我们的研究，我们形象fNADH过滤从汞灯的光（350±25纳米）。一个岔光纤导光板用于直接到心外膜表面的紫外线灯。两个输出套管通过适当的定位，可以实现均匀照明。紫外线LED光源，也可以使用，正如我们在图3。 LED光源是相对便宜，因此可分为成像系统中的多个来源。 LED也可以骑自行车在高利率和关闭同步激发光图像采集。

NADH的漂白，应尽量减少组织光照时间^29。这可以通过骑自行车上的照明和关闭使用电子IC快门和一盏灯或LED照明系统和控制器。如果照明与心动周期同步，然后fNADH图像采集局限于舒张，这会减少运动伪影的荧光信号。 trigging照明和图像采集，使用，如LV的压力，压力信号，将是一个办法做到这一点。

在我们的研究中，我们观察到，在fNADH单位时间的变化，可以5倍以上400 BPM高于200 BPM。这表明，快节奏，提高心脏的氧化还原状态。这是否造成缺氧或无力的心肌细胞氧化辅酶为NAD +速度不够快，以避免对NADH的积累仍然是一个悬而未决的问题。

的双心室工作心脏准备的性能取决于多种因素。其中最重要的是设置适当的前，后负荷的压力，模仿生理条件正在调查中。必须调整，特别是LV后负荷（主动脉压）代表全身的压力。如果实在是太高了，LV将无法克服的压力，导致在返流。压力过低会影响冠状动脉灌注。 LV的预压力（左心房压力）也应调整，以提供舒张末容积，是适当的实验协议。

fNADH活组织成像荧光成像^13的既定模式。其心脏组织中的应用说明了巴洛和机会时，他们醒目海拔地区缺血组织内的fNADH后结扎冠状动脉血管^14。用一个Fairchild的示波器相机和UV闪光摄影，电影，他们fNADH图像记录上。 coremans 等人。扩大后使用的NADH荧光/紫外反射率来衡量的概念E的离体心脏血液灌流大鼠心脏³⁰外膜的代谢状态。一个videofluorimeter用于成像，并用录像机录得的数据。后来，肖尔茨等。用摄谱仪和光电二极管阵列测量从一个LV的大面积平均fNADH。这种方法减少外膜荧光非均质性和流通中的局部变化的影响，同时又揭示fNADH ³¹宏观与工作有关的变化。这种方法计算的利息跨越一个fNADH成像数据集， 如图2所示，所有帧地区的的平均fNADH水平相似。正如我们在这篇文章中提出，今天的技术，提供高速CCD相机和数字控制的高功率紫外线射灯。这些技术使的fNADH和心脏代谢的时空动态研究许多新的观点。相对低成本的光学和光源使FNADH的成像有用的配件为传统的心脏光学标测系统^。9，32

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是由来自美国国立卫生研究院的拨款（以R01-HL095828兆瓦凯）支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S-3014
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-500G
CaCl₂	Fisher Scientific	C77-500
MgSO₄	Sigma-Aldrich	M-7506
NaHCO₃	Fisher Scientific	S-233
KH₂PO₄	Fisher Scientific	423-316
Glucose	Sigma-Aldrich	158968-500G
NaPyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25G
Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-100G