RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite arttı<em> In vivo</em>.
RNA müdahalesi (RNAi) özellikle aşağılayıcı hedef mRNA tarafından gen ekspresyonunu inhibe. Gen suskunluğu 1 çift zincirli küçük parazit RNA (siRNA) keşfinden beri, RNAi gen fonksiyonu çalışmalarında güçlü bir araştırma aracı haline gelmiştir. Genetik delesyon ile karşılaştırıldığında, RNAi-aracılı gen suskunluğu gibi bu gerçekleştirildiği ile kolaylıkla ve en hücre serileri için uygunluğu gibi birçok avantajı, sahiptir. Çoklu çalışmalar kanser araştırma RNAi teknolojinin uygulamaları göstermiştir. Özellikle, U6 veya H1 promotör tarafından tahrik küçük firkete RNA (shRNA) üretmek için DNA vektörü tabanlı teknolojinin geliştirilmesi mümkün 2,3 susturulmasında uzun vadeli gen ve indüklenebilir yapmıştır. Böyle lentivirüs gibi genetiği viral vektörlerin, birlikte kullanımı stabil shRNA ifade için genomik DNA'ya shRNA teslimat ve / veya entegrasyon yüksek verimlilik kolaylaştırır.
Bir detaile tarifd prosedürü shRNA, lentivirüs üretimi, hücre enfeksiyonu, ve bir fare xenograft modeli kullanılarak fonksiyonel çalışmalar ifade vektörlerinin lentiviral inşaat dahil geni fonksiyonu, belirlemek için DNA vektörü bazlı RNAi teknolojisi kullanılarak.
Çeşitli stratejiler shRNA yapıları oluşturmak bildirilmiştir. Protokol PCR büyütmesi ve bir 3-fragmanı ligasyon kullanıldığı doğrudan ve verimli bir şekilde üretmek için kullanılabilir burada açıklanan shRNA-içeren bir shRNA kodlama sekansı için herhangi bir ek nükleotid bitişik çıkmadan lentiviral yapıları. Bu stratejinin yarattığı shRNA ifade kasetleri restriksiyon enzimleri tarafından kesilebilir olduğundan, bunlar kolaylıkla farklı floresan veya antibiyotik işaretleri ile diğer vektörlere taşınmış olabilir. En çok ticari transfeksiyon reaktifler lentivirüs üretiminde kullanılabilir. Ancak, bu raporda, biz% 90 transfeksiyon verim üzerinde elde edebilirsiniz kalsiyum fosfat kullanarak ekonomik bir yöntem sağlamak293T hücreler. Bünye shRNA ifade vektörlerinin karşılaştırıldığında, indüklenebilir shRNA sistemi hücre çoğalması için gerekli bir gen aşağı vurma özellikle uygundur. Biz Yin Yang 1 (YY1), meme kanseri 4,5 potansiyel bir onkogeninin gen susturulması göstermek, bir Tet-On indüklenebilir shRNA sistemi ve tümör oluşumu üzerindeki etkileri. Lentivirüs kullanarak Araştırma İnceleme ve bir araştırmacının kurumu Biyogüvenlik Komitesi tarafından bir biyogüvenlik protokolü onayı gerektirir. Hayvan modelleri kullanılarak Araştırma İnceleme ve bir araştırmacının kurumu Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından bir hayvan protokolünün onaylanması gerekiyor.
Bu protokol kullanılarak bir gen shRNA sökülebilen ve in vivo olarak tümör hücresi büyümesinin bioluminescent görüntüleme kullanılarak biyolojik etkisini canlandırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bir shRNA hedef sitesi (BamHI, HindIII ve EcoRI) kullanılan üç sınırlandırma bölgeleri herhangi bir içermemelidir on klonlama sonrasında için. Nadir bir senaryo bu siteleri arasında herhangi bir mevcut olduğu zaman, ilave bir kısıtlama enzimiyle yapı üreten yerini almak ü…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Araştırmacı Amerikan Kanser Derneği Hibeler (116.403-RSG-09-082-01-MGO) ve GS Wake Forest Üniversitesi Sağlık Bilimleri intramural fonları kısmen desteklenmiştir. DBS NCI eğitim bursu 5T32CA079448 tarafından desteklenmiştir.
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
Name of the reagent |
Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
PCR thermocycler |
Ultracentrifuge |
Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
Digital Vernier caliper |
IVIS imaging system |
Highly competent DH5a E. coli |
EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
T4 DNA Ligase |
Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List