RNA-interferens (RNAi) har många fördelar jämfört med gen knockout och har i stort sett användas som ett verktyg i gen funktionella studier. Uppfinningen av DNA-vektor-baserad RNAi teknik har gjort långsiktiga och inducerbara gen knockdown möjligt och ökade också möjligheterna att geners uttryck<em> In vivo</em>.
RNA-interferens (RNAi) hämmar genuttryck genom att specifikt nedbrytande mål mRNA. Sedan upptäckten av dubbelsträngat liten störning RNA (siRNA) i geners uttryck 1 har RNAi blivit ett kraftfullt forskningsverktyg i studier genfunktion. Jämfört med gen, har RNAi-medierad geners uttryck många fördelar, såsom den lätthet med vilken den genomförs och dess lämplighet för de flesta cellinjer. Flera studier har visat på tillämpningar av RNAi-teknik inom cancerforskningen. Framför allt har utvecklingen av DNA-vektor-baserad teknik för att producera små hårnål RNA (shRNA) drivs av U6 eller H1 promotor göras lång sikt och inducerbara gen tysta möjligt 2,3. Dess användning i kombination med genetiskt manipulerade virala vektorer, såsom lentivirus, underlättar höga effektiviteter av shRNA leverans och / eller integration i genomiskt DNA för stabil uttryckning shRNA.
Vi beskriver ett detailed procedur med hjälp av DNA-vektor-baserad RNAi teknik för att bestämma genfunktion, inklusive konstruktion av lentivirala vektorer som uttrycker shRNA, lentivirus produktion och cell infektion och funktionella studier med en modell musen xenotransplantat.
Olika strategier har rapporterats att generera shRNA konstruktioner. Det protokoll som beskrivits här använda PCR-amplifiering och en 3-fragmentet ligering kan användas för att direkt och effektivt generera shRNA-innehållande lentivirala konstruktionerna utan att lämna någon extra nukleotiden intill en shRNA kodande sekvensen. Eftersom shRNA-expressionskassetter som skapas av denna strategi kan skäras ut genom restriktionsenzymer, kan de lätt flyttas till andra vektorer med olika fluorescerande eller antibiotikum markörer. De flesta kommersiella transfektionsreagenser kan användas i lentivirus produktion. Men i denna rapport ger vi en ekonomisk metod för att använda kalciumfosfatutfällning som kan nå över 90% transfektion effektivitet i293T-celler. Jämfört med konstitutiva shRNA expressionsvektorer, är en inducerbar shRNA systemet speciellt lämpligt att taga isär en gen nödvändig för cellproliferation. Vi visar genen tysta Yin Yang 1 (YY1), en potentiell onkogen i bröstcancer 4,5, med en Tet-On inducerbara shRNA systemet och dess effekter på tumörbildning. Forskning med lentivirus kräver granskning och godkännande av ett protokoll om biosäkerhet från biosäkerhet kommittén en forskares institution. Forskning med djurmodeller kräver granskning och godkännande av ett djur protokoll från Animal Care and Use Committee (ACUC) av en forskares institution.
Detta protokoll beskriver en metod för att slå ner en gen med användning av shRNA och visualisera dess biologiska effekt med användning av bioluminescerande avbildning av tumörcelltillväxt in vivo. Målstället av en shRNA inte bör innehålla någon av de tre restriktionsställen (BamHI, Hindlll och EcoRI) användes för subkloning. I en sällsynt scenario när någon av dessa ställen är närvarande, kan en ytterligare restriktionsenzym användas för att ersätta den i generering av konstruktionen. </…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av forskningsbidrag Scholar (116.403-RSG-09-082-01-MgO) från American Cancer Society och intramural fonder för Wake Forest University Health Sciences till GS. DBS stöddes av NCI utbildningsbidrag 5T32CA079448.
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
Name of the reagent |
Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
PCR thermocycler |
Ultracentrifuge |
Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
Digital Vernier caliper |
IVIS imaging system |
Highly competent DH5a E. coli |
EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
T4 DNA Ligase |
Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List