Количественные, в режиме реального времени анализ базы активность репарации в клеточных лизатов Использование Поражение конкретные молекулярные маяки
Summary
Мы опишем метод для количественного, в режиме реального времени измерения ДНК гликозилаза и AP эндонуклеазы деятельности в клетке ядерный лизатов. Анализ дает темпы ремонта ДНК деятельности поддаются кинетического анализа и адаптации для количественного определения ДНК ремонт деятельности в ткани опухоли и лизатов или очищенных белков.
Abstract
Мы опишем метод для количественного, в режиме реального времени измерения ДНК гликозилаза и AP эндонуклеазы деятельности в клетке ядерный лизатов с использованием базовых репарации (BER) молекулярные маяки. Подложки (маяк) состоит из deoxyoligonucleotide содержащие один поражение базы с 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) часть сопряженных с 5'end и Dabcyl часть сопряженных с 3'-конца олигонуклеотида. Маяк BER молекулярной 43 баз в длину и последовательность призвана содействовать формированию стволовых петля структуру с 13 нуклеотидов в петле и 15 пар оснований в стебле 1,2. В сложенном состоянии в этой конфигурации 6-FAM фрагмента гасится по Dabcyl в не-люминесцентные образом через Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) 3,4. Поражение расположена так, что после удаления поражение базы и нить разрыва оставшиеся 5 базой олигонуклеотида, содержащего 6-FAM часть освобождается от стебля. Отпуститей отряд из тушителя (Dabcyl) приводит к увеличению флуоресценции, которая пропорциональна уровню репарации ДНК. Собрав несколько операций чтения флуоресценции значений в реальном времени, оценка деятельности BER возможно. Использование стандартных количественный ПЦР в реальном времени инструментов позволяет одновременного анализа многочисленных образцов. Дизайн этих BER молекулярной маяки, с одним поражением базы, поддается анализу кинетических, BER количественного и ингибитор проверки и адаптируется для количественного определения ДНК ремонт деятельности в ткани опухоли и клеточные лизаты или очищенных белков. Анализ деятельности BER в опухолевых тканях лизатов или всасывает с помощью этих молекулярной маяки могут быть применимы к функциональным измерения биомаркеров. Кроме того, анализ деятельности с BER очищенных белков с помощью этого количественного анализа обеспечивает быструю, высокую пропускную способность метода для обнаружения и проверки BER ингибиторов.
Protocol
Discussion
Есть более чем 600 цитат с помощью "молекулярного маяк" Срок для выявления и количественной оценки многочисленных молекул и ферментативную деятельность, включая деятельность геликазы 6, активность ДНК-полимеразы 7,8, ДНК-лигазы деятельности 9, активность теломераз?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Питтсбурга и Фонда Национальных Институтов Здоровья (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] для RWS. Поддержка UPCI лентивирусов фонда была оказана RWS по поддержке онкологического центра грант от Национального института здоровья [P30 CA047904]. Была также оказана поддержка в Университете Питтсбурга кафедра фармакологии и химической биологии для DS. Была также оказана поддержка по ESTRO к резюме.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
