मात्रात्मक, सेल lysates घाव विशेष आण्विक Beacons उपयोग में वास्तविक समय बेस छांटना मरम्मत गतिविधि का विश्लेषण
Summary
हम मात्रात्मक, से डीएनए glycosylase और सेल परमाणु lysates में एपी endonuclease गतिविधियों के वास्तविक समय की माप के लिए एक विधि का वर्णन. परख गतिज विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी डीएनए की मरम्मत गतिविधि की दर की पैदावार और डीएनए ऊतक और ट्यूमर lysates में या शुद्ध प्रोटीन के साथ मरम्मत गतिविधि की मात्रा का ठहराव के लिए अनुकूल है.
Abstract
हम मात्रात्मक, से डीएनए glycosylase और सेल परमाणु lysates में एपी endonuclease गतिविधियों की माप के आधार काटना की मरम्मत (BER) आणविक बीकन्स का उपयोग वास्तविक समय के लिए एक विधि का वर्णन. सब्सट्रेट (बीकन) एक युक्त deoxyoligonucleotide (6 परिवार) संयुग्मित 5'end और एक Dabcyl oligonucleotide के 3 सिरे संयुग्मित आधा आधा भाग 6 Carboxyfluorescein के साथ एक एकल आधार घाव शामिल है. प्रासंगिकता आणविक बीकन लंबाई में 43 ठिकानों है और अनुक्रम स्टेम पाश पाश और स्टेम 1,2 में 15 आधार जोड़े में 13 nucleotides के साथ एक संरचना के गठन को बढ़ावा देने के लिए डिज़ाइन किया गया है. इस विन्यास में मुड़ा हुआ आधा भाग 6 – परिवार Dabcyl द्वारा Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) 3,4 के माध्यम से एक गैर फ्लोरोसेंट तरीके में बुझती है. घाव जैसे कि निम्नलिखित आधार घाव को हटाने और शेष 5 आधार छह – परिवार आधा भाग युक्त oligonucleotide स्टेम से किनारा तराश जारी की है तैनात है. एक रिलीजप्रतिदीप्ति की वृद्धि हुई है कि डीएनए की मरम्मत के स्तर के लिए आनुपातिक है में पेय (Dabcyl) परिणाम से एन डी टुकड़ी. कई एकत्रित द्वारा प्रतिदीप्ति मूल्यों के पढ़ता है, वास्तविक समय हिट गतिविधि का आकलन संभव है. मानक मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर उपकरणों के उपयोग के कई नमूनों के साथ – साथ विश्लेषण की अनुमति देता है. इन हिट आणविक बीकन के डिजाइन, एक एकल आधार घाव के साथ, गतिज विश्लेषण, संख्या मात्रा का ठहराव और अवरोध करनेवाला सत्यापन करने के लिए उत्तरदायी है और ऊतक और ट्यूमर सेल lysates में डीएनए की मरम्मत गतिविधि की मात्रा का ठहराव के लिए या शुट्ठ प्रोटीन के साथ अनुकूलनीय है. ट्यूमर lysates या रेस्पायरेट्रस ऊतक का उपयोग करके beacons इन आणविक में हिट गतिविधि के विश्लेषण कार्यात्मक biomarker के मापन के लिए लागू हो सकता है. इसके अलावा, इस मात्रात्मक परख का उपयोग शुट्ठ प्रोटीन के साथ हिट गतिविधि का विश्लेषण, खोज और हिट inhibitors के सत्यापन के लिए एक तेजी से विधि उच्च throughput प्रदान करता है.
Protocol
Discussion
वहाँ का पता लगाने और बढ़ाता कई अणु और helicase गतिविधि 6, डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि 7,8, डीएनए ligase गतिविधि 9, गतिविधि टेलोमिरेज दस, डीएनए photolyase 11 गतिविधि और / डीएनए सहित enzymatic गतिविधियों, के लिए 600 शब्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RWS के लिए यह काम पिट्सबर्ग फाउंडेशन और राष्ट्रीय संस्थानों स्वास्थ्य के (NIH) के; CA148629 ES019498 GM087798] से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. UPCI lentiviral सुविधा के लिए समर्थन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से कैंसर केंद्र सहायता अनुदान द्वारा RWS के लिए प्रदान किया गया. [CA047904 p30] समर्थन भी पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय औषध विभाग और रासायनिक डी एस के लिए जीवविज्ञान के द्वारा प्रदान किया गया. समर्थन भी CV को ESTRO द्वारा प्रदान किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
