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Biology

定量,实时分析,利用分子信标病​​变特定的细胞裂解液中的碱基切除修复活动

doi: 10.3791/4168 Published: August 6, 2012

Summary

我们描述了DNA糖基化酶和AP内切酶的活动,在核细胞裂解定量,实时测量的方法。该法产生服从动力学分析DNA修复活动率,是适应组织和肿瘤裂解物或纯化蛋白质的DNA修复能力的量化。

Abstract

我们描述了一个定量,实时测量碱基切除修复(BER)的分子信标DNA糖基化酶和AP内切酶的活动,在核细胞裂解方法。基板(灯塔)是由deoxyoligonucleotide包含单碱基损伤与6 - 羧基荧光素(6-FAM)基团结合到5'端和DABCYL基的共轭寡核苷酸的3'结束。 BER分子信标是43基地在长度和序列的目的是为了促进与13环和15个碱基对中干1,2个核苷酸的茎环结构的形成。在此配置折叠时6-FAM基淬火DABCYL非荧光的方式通过福斯特共振能量转移(FRET)3,4。病变位置等基地,以下病灶切除和链的断裂,其余5个基地的寡核苷酸,含6-FAM基干公布。释放第二支队从猝灭(DABCYL)荧光的增加,DNA修复水平是相称的结果。通过收集多个读取的荧光值,实时误码活动的评估是可能的。标准定量实时PCR仪器的使用,使许多样品同时分析。这些BER分子信标设计,用一个单一的基础病变,是适合进行动力学分析,误码率的量化和抑制剂验证,是适应组织和肿瘤细胞裂解物中的DNA修复能力的量化或用纯化的蛋白质。在肿瘤裂解物或使用这些分子信标组织抽吸的BER活动的分析,可能是适用于功能性的生物标志物的测量。此外,使用这种定量检测与纯化蛋白质的BER活动分析,误码率抑制剂的发现和验证提供了一种快速,高通量的方法。

Protocol

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1。分子信标设计

1.1设计和分子信标订购

您的分子信标设计必须考虑以下几点:

  1. 我们有43-MER DNA寡核苷酸,有良好的效果。 GC含量应大于32%。排除在G碱基的5'端。
  2. 6-FAM(6 - 羧基)共轭上的5'端和“修改为3 DABCYL请求。
  3. 病变的位置,应该是基地,从5'端#6。
  4. 干或发夹双工的长度应该是至少15个基点。
  5. 建议环路长度是13个基地。
  6. 灯塔的整体结构如图1所示。
  7. 一旦决定的顺序和病变型,寡核苷酸可以责令从最寡核苷酸公司。我们从内幕交易审裁处订购的寡核苷酸和寡核苷酸的高效液相色谱纯化和提供商的要求作为粉末或在干燥的格式。

您的分子信标1.2退火

  1. 在寡糖的稀释缓冲液溶解冻干粉的DNA寡核苷酸(10毫米的Tris-HCl,pH值8.0,0.1 mM的EDTA)给予40μM浓分子信标储备溶液。
  2. 准备1 200nm的分子信标,从40微米的分子信标使用BER反应缓冲液(见下文)的股票解决方案有效的解决方案。新增的200纳米的分子信标无菌黑1.5 mL管工作的解决方案。
  3. 孵育3分钟开水的大烧杯中含有200纳米分子信标工作液管。
  4. 3分钟后,取出烧杯从热源和孵育过夜,以促进退火分子信标在水中。使用隔热材料和下烧杯减缓冷却过程。
  5. 分装到无菌的,黑色的1.5 mL管灯塔,每管100μL。
  6. 储存在-30°C。

1.3质量评估的分子信标

  1. 执行熔解曲线分析,以确认,不误码率的分子信标荧光,直到加热,以确定最佳的熔融温度,并确认每个灯塔将荧光加热时。
  2. 对于每一个烽火台添加指定的200纳米的分子信标工作溶液和BER反应缓冲量,如表1所示,6口井的快速光学96孔板(Applied Biosystems公司,猫#4346906)。
  3. 如StepOnePlus(Applied Biosystems公司)系统或类似的监测熔解曲线分析期间的票价调整机制染料激发使用的实时PCR仪。
  4. 计划您的实时PCR仪器(StepOnePlus制度),以监测为FAM荧光激发的温度升高熔解曲线分析的小增量的功能。 StepOnePlus系统编程来衡量票价调整机制荧光NCE和坡道从25°C至95°C在0.5°Ç的时间间隔。一个典型的熔融曲线如图2所示。
  5. 很少或没有背景荧光应该是可见的,在温度低于50°C检查在荧光的统一和急剧增加,表明纯和高品质的灯塔。 Tm值约60°C到80°C有利于所有稀释应该是平等的。
  6. 从这样的分析,判断,最大荧光[FL(最大)值的温度,T max的。 Tm或T 最大灯塔输入(浓度)的荧光值的比例应该是线性的。在37°C间至少5倍,FL(最大值),在T 最大荧光值应超过背景值。

2。核裂解液的制备

2.1碱基切除修复反应缓冲液5准备

  1. 添加列出的所有组件表2和缓冲区的体积带来900毫升DDH 2 O
  2. 调整pH值至7.8,使用氢氧化钾北纬8.0度(标准差,猫#17-8)。
  3. 带来的缓冲量1000毫升使用DDH 2 O
  4. 过滤使用0.22微米的过滤器,NALGENE 1升过滤器(猫#167-0020)的缓冲区。
  5. 立即加入二硫苏糖醇(DTT)使用前的BER反应缓冲区。

2.2细胞培养和细胞分离

  1. 建议培养细胞,直到90-100%汇合。隔离4-6菜(150毫米)的细胞获得足够的分析全套(共约5×10 7细胞)核裂解。
  2. 建议准备3个独立的细胞球的独立文化,以获取生物分析每个复制。
  3. 核裂解随时准备使用的NucBus​​ter隔离程序(EMD的生物科学Calbiochem公司猫#71183-3)although任何核隔离协议将是适当的(见下文第2.3节。)。

2.3核裂解准备

  1. 冻干的蛋白酶抑制剂(Calbiochem公司,猫#539131,设置1)在开始之前,首先重新悬浮于100μL无菌水准备了100倍的股票。立即使用或冻结在-20°C长期储存在等分。计算每10 7提取所需的细胞,μl100X股票的1。
  2. 在冰上或在4°C,应执行提取过程中的所有步骤,以确保蛋白质的稳定性。
  3. 标签15毫升的猎鹰管置于冰上。
  4. 从细胞的生长介质,并用7.5毫升的冷PBS洗两次。
  5. 加入5毫升冷PBS到每道菜,从一个细胞升降板刮细胞。传递细胞的冷冻15毫升猎鹰管。
  6. 离心5分钟的低转速(500X克,4℃)。去除上清估计红细胞体积比较。 (高达250μL红细胞压积,可以在一个单一的1.5 mL管处理)
  7. 离心机另一500XĞ1分钟,用吸管取出剩余PBS。根据红细胞体积大小:150μLNucBus​​ter的抽提试剂1包装,每50μL细胞体积重悬细胞沉淀在NucBus​​ter提取试剂1。 (另外,细胞沉淀可以是干冰或液氮速冻,保存在-80°C间,直到准备进行)。
  8. 再悬浮后,转移到预冷的1.5 mL管裂解。
  9. 涡在冰上孵育5分钟的高速,和旋涡再次在高速的15秒15秒。
  10. 在4°C离心5分钟13000 XG
  11. 上清含有细胞质部分。删除,并储存于-80°C或丢弃。
  12. 重新悬浮沉淀重新悬浮100X蛋白酶抑制剂1μL,1&M的混合物U;大号100毫米DTT和75的微升NucBus​​ter提取试剂每50μL红细胞压积2。
  13. 涡旋15秒,在高速,在冰上孵育5分钟,再次涡旋15秒高速。
  14. 在4°C离心5分钟13000 XG上清液中含有核蛋白质。收集上清,进行下一步。

2.4透析,蛋白质量化和aliquoting的

  1. 预冷的解决方案,材料和设备应在透析过程中的所有步骤,以确保提取物的质量。
  2. 透析缓冲区(每个样品所需的1升),如表3详细准备。重要的是:缓冲区应该是冷(4℃)。我们建议至少前一天准备。过滤透析缓冲区可以存放在4°C间,无限期,如果尚未加入数码地面电视。
  3. 前寒意烧杯,(2 1%的样品大号烧杯),透析缓冲液,透析室,微型离心机管,注射器和针头。
  4. 正确的使用 - 每公升透析液中添加1毫升1米数码地面电视前。
  5. 透析时间为90分钟准备在2.3在0.5升预冷透析缓冲步骤4的裂解°C间使用皮尔斯幻灯片一仪透析卡带(0.5-3毫升截止7000兆瓦透析卡带)轻轻搅拌。
  6. 转移到第二个烧杯中含0.5升预冷透析缓冲透析卡带和透析90分钟裂解液在4°Ç轻轻搅拌。
  7. 收集透析核蛋白质溶液透析用注射器卡带(费舍尔,猫#309659)。使用不同的垫片比以前使用的蛋白注入透析盒。请注意,提取物可能是由于蛋白质浓度高结晶。尝试包括消除透析核蛋白质溶液时多云寻找晶体。
  8. 微型离心管,每20μL分装的样品。快速冻结的干冰和STOR在-80 E°C,直到使用。
  9. 确定使用标准协议的透析蛋白的浓度。预期核裂解物浓度的例子,如表4所示。
  10. 最后,裂解应评估的质量控制。与实验评估的裂解会有所不同。如前所述,我们经常分析几个BER蛋白表达,通过免疫1,2裂解。
  11. 透析步骤是用来使整个细胞株的统一反应解决方案,以方便比较。省略透析步骤可能会影响酶率和动力学分析,自盐溶液和反应条件不再相同的,由于所需的各种稀释在不同的细胞株和准备。然而,我们观察到,使用大于5μg/μL的裂解,并添加足够的反应缓冲液透析步骤(数据未显示),并允许遗漏。为抑制剂的研究日在不需要不同的细胞裂解物之间的比较,透析可能并不需要。但是,我们建议透析所示。

3。分子灯塔法

3.1设备要求

  1. 实时定量PCR仪,如StepOnePlus QRT-PCR或类似,或96孔板荧光能够检测和测量实时荧光票价调整机制。注意:此过程是适用于任何机器能够阅读的信标荧光值和实时记录。但是,机器应允许用户访问的数据分析为原料的荧光值。
  2. 离心与光学定量RT-PCR管或正在使用的板兼容。
  3. Microsoft Excel来分析数据的收集。

3.2缓冲液和试剂

  1. 光学QRT-PCR管或相应的封面板。
  2. BER反应缓冲液(见波夫和表2)。
  3. 透析核蛋白提取准备在2.3和2.4的步骤和稀释2微克/μL蛋白含数码地面电视与误码率的反应缓冲区。
  4. BER反应缓冲稀释到200微米的分子信标,建立分子信标工作液(见上文)。

3.3检测设置(见表5)

  1. QRT-PCR机器不能正常使用荧光计,因此必须改变运行方法。
    1. 第一阶段计划,并设置一个周期时间为20秒(测量时间点)与180个(或更多,取决于维修检测设计)的最低反应温度为37°C。确保在周期中收集数据。因此,机器将收集数据,共1小时,每隔20秒。
    2. 创建第二个阶段,特别是灯塔的坡道的温度最高温度,最大荧光的温度,作为阻止开采步骤1.3(质量评估的分子信标)。周期时间应再次是20秒,共15个周期。这将收集数据,每20秒,5分钟的最大荧光灯塔可能。在Tmax周期期间所测得的荧光值用于每口井的荧光值(步进4.2A)正常化。如果使用几个不同的信标,确保包括步骤,以及提供类似的重复值,这些灯塔的最高温度为。
    3. 设置反应体积为25μL。
  2. 设置上机使用应用生物系统公司的软件的实时定量PCR板设计。我们只是在原料的荧光值感兴趣,所以选择“标准曲线” - 实验类型。
  3. 完成板布局。 表5显示了一个例子。不要添加任何东西作为选择的标准曲线的井。

3.4运行试验

  1. 进出口ortant:使用预冷的材料和解决方案。保持冷静,直到运行和检测。
  2. 添加适量的DTT的BER反应要使用的缓冲区。
  3. 蛋白质溶液稀释到使用BER反应缓冲液(DTT),浓度为2μg/μL的。
  4. 对于最初的实验中,我们建议使用10微克每口井的透析核裂解(5微升/孔)和1 pmole的基板,终浓度在40纳米的分子信标(5微升/孔)。我们一直获得细胞裂解液与10微克的高品质和可重复性的结果,虽然它是可能的,不同的细胞裂解物或灯塔基板可能会要求更高或更低的蛋白质浓度。
    1. 在每口井的试验组件15μL,误码率的反应缓冲液,5μL的灯塔和5μL核裂解。运行在一式三份,每个信标/裂解组合。
    2. 几个阴性对照都需要每一个烽火台,如25&灯塔不包括样品万亩; BER反应缓冲液,误码率与20μL反应缓冲液5μL裂解液和20μL误码率与反应缓冲液5μL无裂解灯塔大号。
    3. 几个对照样本须为每个核裂解。这些措施包括阴性对照[15μL,误码率的反应缓冲液,5μL控制的灯塔(无损伤)和5μL样品裂解。我们还建议,包括诸如包含信标模仿含有寡核苷酸的碱基网站,很容易切开[15μL,误码率反应缓冲液,5μL四氢呋喃灯塔和5μL样品裂解]四氢呋喃列入实验的阳性对照。当然,积极的精确控制,将取决于整体实验设计。
  5. 作为一个例子,按照下面的表5板布局。
  6. 成光管或板吸取冰或冷却的立场上,以尽量减少反应开始前信号检测。
  7. 吸取BER反应缓冲将首先水井。
  8. “列印吸管按到正确的井,始终吸管板布局的灯塔裂解成井的最后反应开始之前,尽量减少信号检测。
  9. 彻底密封管或板,混合和离心机旋转收集管或板底的解决方案,以
  10. 插入QRT-PCR机板,并开始检测。
  11. 项目建成后,导出原始数据,最好以Excel格式。 StepOnePlus系统的多分量数据是必要的。这包含了所有的荧光染料的颜色和读取多个排序值。

4。分子信标检测分析

我们使用Microsoft Excel软件来执行这些分析和计算。我们建议建立模板和宏来自标准96格式的数据的基础上,将允许容易和快速的分析和图形显示。

4.1去除背景

“>
  • 从多分量数据的原始荧光值,首先组织的数据,以及/样品。为StepOnePlus系统可实现出口“,”​​跨列在Excel文件显示个别多个行的数据读取列中的不同井不同周期。
  • 对于每一个个体的分子信标,减去阴性对照,在每个周期中的所有分子信标使用该井的荧光值(BER反应缓冲液:20μL和5μL灯塔)的背景荧光检测值。这将删除从未来分析裂解不相关的背景荧光的变化。
  • 4.2 FL(最高温度)正常化

    为了解决在不同的井在移液和荧光检测的可变性,我们的数据正常化的最大荧光值(与灯塔输入的关联)。

    1. 计算周期的平均荧光值在T 最大单井:FL(T max的)(步骤3.3aii)。
    2. 计算比FL(周期X)/ FL(T max的),并乘以100。在可能的假设,FL(T max的)对应的荧光值最大可能完全切开时,这些规范化的数据代表%免费FAM(=%误码率阴刻灯塔)。
    3. 结合起来,平均每个周期的3口井的数据(%免费的票价调整机制)(直到周期180)一式三份样品,并计算每个错误。
    4. 计算乘以每个周期20秒的时间。
    5. 由于在荧光检测,以及变异可以是显着的,我们建议添加红霉素,如荧光染料分子信标作为标准来重新调整个别井的荧光值的股票。在这种情况下,红霉素染料会被用来作为内部标准每单井(无源参考)。红霉素受雇于法(激励 - 495 nm,发射 - 520纳米)的6-FAM荧光激发和发射光谱(激发 - 588 nm,发射608纳米)是不同的。红霉素染料将使正常化步骤类似常规RT-PCR程序,允许以及井的差异,可能出现的文物由于正常化。这些可能导致从移液器错误或可能起源于荧光检测效率以及富裕的变化。

    4.3剧情

    1. 情节归荧光数据对时间(秒)(%免费的票价调整机制),在相应的错误的散点图。
    2. 我们建议维修动力学分析,至少有三个不同的核裂解准备代表生物复制。评估方差间的实验误差,从每一个人实验的平均值计算应显示。
    3. 一个具有代表性的两个肿瘤细胞裂解物分析:LN428,神经胶质瘤细胞株甲基嘌呤DNA糖基化酶(MPG)和LN428/MPG工程MPG的表达升高,同样的细胞株检测不到的水平,这两个细胞系具有同等水平的AP内切酶1(APE1的)1,2。分别探讨APE1的活动和使用误码率四氢呋喃分子信标( 图3)和误码率HX分子信标( 图4),MPG活动四氢呋喃=四氢呋喃(APE1的基板)和HX =次黄嘌呤(基材为MPG) 。注:在图3(四氢呋喃基板),从LN428/MPG裂解结果表明LN428裂解相比较低的最大绝对荧光。这是一个较低的灯塔的输入值确定使用的最高温度值(见3.3A)的结果。这个较低的值时使用了正常化的结果,它导致在在积大的变化。这很好地说明了数据正常化的重要性。仅绘制的绝对荧光值的建议,REPALN428和LN428/MPG细胞之间的红外率是不同的。然而,标准化数据时,考虑到井的变异,显示APE1的介导的修复率差异是最小的。

    5。代表结果

    我们描述了一个定量,实时使用DNA糖基化酶和AP内切酶的活动,在核细胞裂解碱基切除修复(BER)的分子信标( 图1)测量方法。退火后,我们建议进行熔解曲线分析( 见表1),作为你的分子信标质量评估( 图2)。核裂解,然后可以准备的,使用表2中列出的组件的缓冲区。在0.5升预冷透析缓冲裂解透析90分钟,在4°C间轻轻搅拌,对表3中所列的透析缓冲皮尔斯滑一仪透析录像带。收集透析核蛋白质溶液用注射器从透析录像带。使用不同的垫片比以前使用的蛋白注入透析盒。确定使用标准协议的透析蛋白的浓度。预期核裂解物浓度的例子,如表4所示。运行如上所述(步骤3.4),如表5所示,使用板布局的反应。一个具有代表性的两个肿瘤细胞裂解物分析:LN428,甲基嘌呤DNA糖基化酶(MPG)和LN428/MPG工程MPG的表达升高,同样的细胞株检测不到的水平与脑胶质瘤细胞株;细胞系具有同等水平的AP内切酶1(APE1的)1,2。分别探讨APE1的活动和使用误码率四氢呋喃分子信标( 图3)和误码率HX分子信标( 图4),其中四氢呋喃=四氢呋喃(APE1的基板)和HX =黄嘌呤MPG活动(基材为MPG)。最后,使用的BER杜/分子信标,尿嘧啶糖基化酶活性的报告,我们表明,在蛋白质10μg的最大信号输出或信号强度和0.62微克蛋白( 图5)降低到检测不到的水平。

    图1
    图1。整体结构的BER分子信标。显示的是这里作为一个单链分子的误码率分子信标序列和整体设计,退火后和再次熔化后。 粗体,斜体部分的顺序是干(15基地)和强调的部分序列是循环(13个基地)。票价调整机制= 5'荧光染料6-羧基[上的5'端;京天成= 495纳米,Emmax = 520 nm处,消光系数(260纳米):20,960;消光系数(吸光度最大):75,000和DABCYL = 3'淬火剂DAB共青团[上的3'端;京天成= 453纳米;淬火范围= 425-520纳米] =病变(取决于所研究的问题不同) Y =基地对面的病变(取决于所研究的问题不同)。 。

    图2
    图2。一位代表的熔解曲线熔解曲线。误码率的分子信标控制(A)所示,误码率包含的四氢呋喃(THF)基(B)或次黄嘌呤(HX)基(三)分子信标。寡核苷酸的浓度从0纳米(深蓝色),8 nm(红光),16纳米(绿色),32纳米(紫色),64纳米至128纳米(橙色)蓝色。在步骤1.3中所述,被加热退火寡核苷酸从25°C至95°C在0.5°C的时间间隔和StepOnePlus系统编程FAM荧光来衡量每个0.5°C的时间间隔。

    内容“> 图3
    图3。代表性的数据,使用的BER四氢呋喃分子信标在控制细胞株(LN428)和MPG的过度表达细胞株(LN428/MPG)核裂解为特定的碱基现场模拟四氢呋喃(THF)水解AP内切酶的活性测定。每个裂解物进行了分析,使用的BER分子信标控制(LN428,绿色; LN428/MPG,紫色)或误码率四氢呋喃分子信标(LN428,蓝色; LN428/MPG,红色)。结果报告(一)平均荧光反应的单位和(B)归在上述第4(四氢呋喃四氢呋喃)中所述的灯塔输入相同的数据。

    图4
    图4。有代表性的数据,使用的BER HX分子信标 DNA的糖基化酶活性的MPG基板Ĥ搬迁的具体ypoxanthine(HX)测量在核裂解从控制细胞株(LN428)和MPG的过表达细胞株(LN428/MPG)。每个裂解物进行了分析,使用的BER分子信标控制(LN428,绿色; LN428/MPG,紫色)或误码率HX分子信标(LN428,蓝色; LN428/MPG,红色)。结果报告(一)平均荧光反应的单位和(B)相同的归为一节(HX =黄嘌呤)4描述的数据。

    图5
    图5。有代表性的数据,使用的误码率的du /分子信标在不同的蛋白质水平。DNA糖基化酶(UNG),活性去除尿嘧啶(DU / A)的具体测量T98G细胞的核裂解。 T98G裂解使用的BER分子信标控制或误码率杜/分子信标,在10的蛋白水平,5,2.5,1.25或0.62微克分析指出,在Figure。结果是规范化的数据,在上述第4节。

    灯塔的浓度(NM) 0 8 16 32 64 128
    分子信标工作液 (200纳米)的增值(微升) 0 1 2 4 8 16
    BER反应缓冲液(W / O型DTT),(微升) 25 24 23 21 17 9

    表1。熔解曲线实验的布局。

    1 L总 需要联合解决方案的体积 CON。原液 终浓度。
    HEPES-KOH 25毫升 1M pH7.8 25毫米</ TD>
    氯化钾 75毫升 2米 150毫米
    EDTA的 1毫升 0.5M pH8.0时 0.5毫米
    甘油 10毫升 N / A 1%
    (DTT使用前添加) 0.5毫升 1米 0.5毫米
    H 2 O 888.5毫升 N / A N / A

    表2。 BER反应缓冲液。

    1 L总 需要联合解决方案的体积 CON。原液 终浓度。
    HEPES-KOH 50毫升 1M pH7.5的 50毫米
    氯化钾 50毫升 2米 100毫米
    EDTA的 1毫升 0.5M pH8.0时 0.5毫米
    甘油 200毫升 N / A 20%
    (DTT使用前添加) 1毫升 1米 1毫米
    H 2 O 698毫升 N / A N / A

    表3。透析缓冲。

    细胞株 蛋白浓度(微克/微升)
    LN428 5.34
    LN428/MPG 4.79

    表4。蛋白质的测定结果。

    阴性对照25μL误码率缓冲区 (背景控制)20μL误码率缓冲区
    5μLCON信标
    NO的裂解
    (一式三份测试)<BR />15μL误码率缓冲区
    5μLCON信标
    5μLLN428裂解物
    (一式三份测试)
    15μL的BER缓冲器
    5μLCON信标
    5μLLN428/MPG裂解物
    阴性对照25μL误码率缓冲区 (背景控制)20μL误码率缓冲区
    5μL四氢呋喃信标
    NO的裂解
    (一式三份测试)15μL误码率缓冲区
    5μL四氢呋喃信标
    5μLLN428裂解物
    (一式三份测试)15μL误码率缓冲区
    5μL四氢呋喃信标
    5μLLN428/MPG裂解物
    阴性对照
    20μL的BER缓冲器
    5μL裂解
    (背景控制)20μL误码率缓冲区
    5μLHX信标
    NO的裂解
    (一式三份测试)
    15μL的BER缓冲器
    5μLHX信标
    5μLLN428裂解物
    (一式三份测试)15μL误码率缓冲区
    5μLHX信标
    5μLLN428/MPG LY沙爹
    阴性对照
    20μL的BER缓冲器
    5μL裂解

    表5。分子灯塔法设置。

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    Discussion

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    有超过600个使用“分子信标”检测和量化许多分子和酶的活动,包括解旋酶的活性,DNA聚合酶活性7,8,DNA连接酶的活动9,10端粒酶活性,DNA光解酶的活性11和DNA /引用许多人的RNA之间的杂交种12。除了 ​​利用分子信标测量DNA修复上面列出的活动,我们和其他人已经证明误码活动1,2,13-15分析这些探头的效用。

    实时BER活性测定,我们描述了本采用了单一的改装基地,并允许不同的病变或在对面​​病变的基础上改建的误码率的定量评估。应用范围可以从分子机理研究抑制剂屏幕。我们证明了误码率特异性比较lysa从省油TES表达细胞与非表达细胞和缺乏控制信标活动。该法是高度敏感的,允许的缺陷检测的BER的蛋白质省油2或XRCC1基因1表达和足够的检测[准备手稿DNA修复动力学参数的细微变化和DNA修复酶抑制剂的疗效。多次读取整个活动的维修时间计算动能率和支持,在这些动能率的任何变化的意义。因此,适用于高通量研究DNA修复酶抑制剂(抑制剂屏幕)或个别核元件的作用研究屏幕的BER分子灯塔法。核裂解的分析,使DNA修复中的BER复杂的背景下进行评估,因此也描绘间接改建或对BER机械(如翻译后修饰或突变)的影响。

    “协议,描述的那样,应该得到高度重复性和定量结​​果。然而,有几个细节要考虑,以确保正确的分析:(1)阴性对照的背景值可能过高,这可能是由于不良的贮存或制造的寡核苷酸。高背景值在没有航标的裂解表明混杂自动荧光(即由污染或外源性荧光蛋白表达细胞)。如果荧光蛋白表达的是不可避免的,记者染料和荧光蛋白的激发/发射光谱不重叠;(2)FL(最高温度)低:DNA浓度是不同的,比给定的。检查分光光度法测定DNA浓度(OD值260nm处 ),例如使用的NanoDrop。高与低楼(最高温度)的DNA浓度表示不足的票价调整机制装载上的信标。 HPLC纯化防止污染与未修改的DNA(见上文);(3)修复能力差:如果FL(最高温度)值过去周期表明有足够的的灯塔输入和荧光检测,这可能表明,核提取准备失败。核提取物的质量是至关重要的。气温低,应保证在整个过程中包括长期储存在-80°C和(4)维修活动曲线与高值启动:即使是很短的样品暴露于室温,在分析之前启动修复。在任何时候都保持冷静。

    这一高度敏感和定量误码率检测,也适用于纯化蛋白质的分析,使底物特异性的研究,相应地改变分子信标。最后,该法适用于肿瘤组织裂解分析,提供了一个机会来衡量DNA修复反应或疗效的生物标志物的功能端点,作为我们评估肿瘤对烷化剂替莫唑胺2 PARP1抑制剂时程增强的建议。

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    Disclosures

    RWS的是一个科学顾问公司Trevigen,其余作者的声明,有没有利益冲突。

    Acknowledgments

    从匹兹堡基金会和国家卫生研究院(NIH)的[GM087798; CA148629; ES019498] RWS的赠款,以支持这项工作。 UPCI慢病毒设施的圣淘沙名胜世界提供了支持,从国家卫生研究院癌症研究中心支援津贴[P30的CA047904]。由美国匹兹堡大学的药理学部化学生物学的DS也提供了支持。也提供了支持ESTRO到CV。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Potassium Chloride Fisher P217-500 Molecular grade
    EDTA Fisher BP120-500
    Glycerol Fisher BP229-1 Molecular grade
    DTT Fisher BP172-5
    HEPES- Solution Invitrogen 15630
    HEPES-Salt Sigma H4034-500G
    Potassium Hydroxide Sigma 17-8
    0.22μM filter Nalgene 167-0020
    Slide-A-Lyzer Dialysis Products Pierce 66373 MW 7000
    Syringe Fisher 309659
    Needle Fisher 305196
    1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Black
    15 mL Falcon Tubes Fisher 352097
    NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183
    PBS Invitrogen 14190
    Molecular Beacons IDT
    BioRad Protein assay dye reagent concentrate BioRad Cat# 500-0006

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    References

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    定量,实时分析,利用分子信标病​​变特定的细胞裂解液中的碱基切除修复活动
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    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).More

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).

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