Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Echtzeit-Messung der DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten in Kerntransfer-Lysaten. Der Test liefert Raten von DNA-Reparatur-Aktivität zugänglich kinetische Analyse und ist anpassungsfähig für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität im Gewebe und Tumor-Lysaten oder mit gereinigten Proteinen.
Wir beschreiben eine Methode zur quantitativen Echtzeit-Messung von DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten im Zellkern-Lysaten mit Basenexzisionsreparatur (BER) Molecular Beacons. Das Substrat (Beacon) aus einem Deoxyoligonukleotid enthaltend eine einzelne Base Läsion mit einem 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) konjugiert an die 5'-Ende und ein DABCYL-Rest konjugiert an das 3'-Ende des Oligonukleotids umfaßt. Die BER Molecular Beacon ist 43 Basen Länge und die Sequenz wurde entwickelt, um die Bildung einer Stamm-Schleifen-Struktur mit 13 Nukleotiden in der Schleife und 15 Basenpaaren in dem Schaft 1,2 zu präsentieren. In dieser Konfiguration geklappt und der 6-FAM-Einheit durch Dabcyl in einem nicht-fluoreszierenden Weise über Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4 abgeschreckt. Die Läsion ist so, dass die folgenden Basis-Läsion Entfernung und Strangbruch die restlichen 5 Basis-Oligonukleotid mit der 6-FAM-Rest vom Stamm gelöst wird positioniert. Lassen Sie einRunde Ablösung von den Quencher (Dabcyl) führt zu einer Zunahme der Fluoreszenz, die im Verhältnis zu der Ebene der DNA-Reparatur. Durch das Sammeln mehrerer liest der Fluoreszenz-Werte, ist eine Echtzeit-Bewertung von BER-Aktivität möglich. Der Einsatz von Standard quantitative Echtzeit-PCR-Instrumente erlaubt die gleichzeitige Analyse zahlreicher Proben. Das Design dieser BER Molecular Beacons mit einer einzigen Basisstation Läsion, zugänglich ist, um kinetische Analysen, Quantifizierung und BER-Inhibitor Validierung und anpassbar ist für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität in Gewebe und Tumor Zelllysaten oder mit gereinigten Proteinen. Die Analyse der BER-Aktivität in Tumorlysaten oder Gewebe saugt Verwendung dieser Molecular Beacons kann für funktionelle Biomarker Messungen. Ferner stellt die Analyse von BER-Aktivität mit gereinigten Proteinen mit diesen quantitativen Assay eine schnelle, High-Throughput-Verfahren zur Identifizierung und Validierung von BER-Inhibitoren.
Es gibt über 600 Zitate mit dem Begriff "Molecular Beacon" zur Detektion und Quantifizierung zahlreiche Moleküle und enzymatische Aktivitäten, einschließlich Helikaseaktivität 6, DNA-Polymerase-Aktivität 7,8, DNA-Ligase Aktivität 9, Telomerase-Aktivität 10, 11 DNA-Photolyase Aktivität und DNA / RNA-Hybride 12, unter vielen anderen. Neben der Verwendung von Molecular Beacons für die Messung der DNA-Reparatur oben genannten Aktivitäten, haben wir …
The authors have nothing to disclose.
Zu RWS Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Pittsburgh-Stiftung und der National Institutes of Health (NIH) [;; CA148629 ES019498 GM087798] unterstützt. Die Unterstützung für die UPCI Lentivirale Fazilität wurde zu RWS durch die Cancer Center Support Stipendium der National Institutes of Health [P30 CA047904]. Unterstützung wurde auch von der University of Pittsburgh Abteilung für Pharmakologie und Chemische Biologie an DS zur Verfügung gestellt. Unterstützung wurde auch durch ESTRO zu Lebenslauf zur Verfügung gestellt.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
EDTA | Fisher | BP120-500 | |
Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
DTT | Fisher | BP172-5 | |
HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
Syringe | Fisher | 309659 | |
Needle | Fisher | 305196 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
PBS | Invitrogen | 14190 | |
Molecular Beacons | IDT | ||
BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |