Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons
Summary
We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in cel nucleaire lysaten. De test levert de tarieven van de DNA-reparatie-activiteit vatbaar zijn voor kinetische analyse en is aanpasbaar voor de kwantificering van DNA Repair activiteit in weefsel en tumor lysaten of met gezuiverde eiwitten.
Abstract
We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in celkernen lysaten met behulp van base excisie reparatie (BER) moleculaire bakens. Het substraat (baken) bestaat uit een deoxyoligonucleotide met een base laesie met een 6-carboxyfluoresceïne (6 FAM) groep geconjugeerd aan het 5'-uiteinde en een Dabcyl groep geconjugeerd aan het 3'-uiteinde van het oligonucleotide. De BER moleculaire baken is 43 basen lang en de sequentie is ontworpen om de vorming van een lusstructuur stam-met 13 nucleotiden in de lus en 15 basenparen in de steel 1,2 bevorderen. Wanneer gevouwen deze configuratie de 6-FAM groep gedoofd door Dabcyl een niet fluorescerende wijze via Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4. Het letsel is zodanig dat na base laesie verwijderen en onderdeel splitsing de resterende 5 base oligonucleotide met de 6-FAM groep vrijkomt van de steel. Laat eennd onthechting van de quencher (Dabcyl) resulteert in een toename van de fluorescentie die evenredig is aan het niveau van DNA-herstel. Door het verzamelen van meerdere leest van de fluorescentie waarden, real-time beoordeling van de BER-activiteit is mogelijk. Het gebruik van standaard kwantitatieve real-time PCR-instrumenten maakt de gelijktijdige analyse van een groot aantal monsters. Het ontwerp van deze BER moleculaire bakens, met een enkele base laesie, vatbaar is voor kinetische analyses, BER kwantificering en validatie-remmer en is aangepast voor de kwantificering van DNA-reparatie-activiteit in het weefsel en tumor cellysaten of met gezuiverde eiwitten. De analyse van de groepsvrijstellingsverordening activiteit in de tumor lysaten of weefsel zuigt het gebruik van deze moleculaire beacons van toepassing kunnen zijn om functionele biomarker-metingen. Verder is de analyse van de BER activiteit met gezuiverde eiwitten met behulp van deze kwantitatieve test voor een snelle, high-throughput methode voor de identificatie en validatie van de BER-remmers.
Protocol
Discussion
Er zijn meer dan 600 citaten gebruik van de term 'moleculaire baken' voor het detecteren en kwantificeren van tal van moleculen en enzymatische activiteiten, waaronder helicase activiteit 6, DNA-polymerase-activiteit 7,8, DNA-ligase activiteit 9, telomerase activiteit 10, DNA photolyase activiteit 11 en DNA / RNA hybriden 12, onder vele anderen. Naast het gebruik van moleculaire bakens voor het meten van het DNA bovengenoemde activiteiten, hebben …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Pittsburgh Foundation en de National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629, ES019498] om RWS. Ondersteuning voor de UPCI Lentivirale faciliteit werd verstrekt aan RWS door de Cancer Support Grant van de National Institutes of Health [P30 CA047904]. Ook is steun verleend door de Universiteit van Pittsburgh Afdeling Farmacologie & Chemical Biology naar de DS. Ook is steun verleend door de ESTRO aan CV.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
