Quantitative, en temps réel Analyse de l'activité de réparation par excision de base dans les lysats cellulaires Utilisant des lésions spécifiques Beacons moléculaires
Summary
Nous décrivons une méthode pour la détermination quantitative, mesure en temps réel de l'ADN glycosylase et des activités endonucléase AP dans des lysats de cellules nucléaires. Le test donne des taux d'activité de réparation d'ADN qui se prêtent à l'analyse cinétique et est adaptable pour la quantification de l'activité réparation de l'ADN dans les tissus et les lysats tumoraux ou avec des protéines purifiées.
Abstract
Nous décrivons une méthode pour la détermination quantitative, mesure en temps réel de l'ADN glycosylase et des activités endonucléase AP dans des lysats de cellules nucléaires de base à l'aide de réparation excision (BER) des balises moléculaires. Le substrat (balise) est constitué d'un désoxyoligonucléotide contenant une lésion de base unique avec une 6-carboxyfluorescéine (6-FAM) fragment conjugué à l'extrémité 5 'et un fragment Dabcyl conjugué à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide. La balise BER moléculaire est de 43 bases de longueur et la séquence est conçu pour favoriser la formation d'une structure tige-boucle avec 13 nucléotides dans la boucle et 15 paires de bases dans la tige 1,2. Lorsqu'elle est pliée dans cette configuration, le groupe 6-FAM est désactivé par Dabcyl de manière non fluorescent par l'intermédiaire d'Förster résonance de l'énergie de transfert (FRET) 3,4. La lésion est positionné de telle sorte que après le retrait lésion de base et la scission brin restants 5 oligonucléotide de base contenant le groupe 6-FAM est libéré de la tige. Libérer undétachement e des quencher (DABCYL) entraîne une augmentation de la fluorescence qui est proportionnelle au niveau de la réparation de l'ADN. En recueillant de multiples lectures des valeurs de fluorescence, en temps réel d'évaluation de l'activité BER est possible. L'utilisation de la norme quantitative instruments PCR en temps réel permet l'analyse simultanée de nombreux échantillons. La conception de ces balises BER moléculaires, avec une lésion de base unique, est soumise à des analyses cinétiques, la quantification et la validation BER inhibiteur et est adaptable pour la quantification de l'activité réparation de l'ADN dans les tissus et les lysats de cellules tumorales ou avec des protéines purifiées. L'analyse de l'activité BER dans les lysats tumoraux ou de tissus aspire à l'aide de ces balises moléculaires peuvent être applicables à des mesures de biomarqueurs fonctionnels. En outre, l'analyse de l'activité du TEB avec des protéines purifiées en utilisant ce dosage quantitatif fournit un moyen rapide, à haut débit méthode pour la découverte et la validation des inhibiteurs de BER.
Protocol
Discussion
Il ya plus de 600 citations à l'aide «molecular beacon» le terme pour la détection et la quantification de nombreuses molécules et les activités enzymatiques, y compris l'activité hélicase 6, une activité ADN polymérase 7,8, l'ADN ligase l'activité 9, 10 activité de la télomérase, l'ADN photolyase d'activité de 11 et de l'ADN / ARN hybrides 12, parmi beaucoup d'autres. En plus de l'utilisation de balises moléculair…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de Pittsburgh et le National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] pour RWS. Prise en charge de l'UPCI Facilité Lentiviral a été fournie à RWS par la subvention d'appui du Centre du cancer de la National Institutes of Health [P30 CA047904]. Soutien a également été fourni par le ministère Université de Pittsburgh de pharmacologie et de biologie chimique à la DS. Soutien a également été fourni par l'ESTRO à CV.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
