Summary

Quantitative, en temps réel Analyse de l'activité de réparation par excision de base dans les lysats cellulaires Utilisant des lésions spécifiques Beacons moléculaires

Published: August 06, 2012
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode pour la détermination quantitative, mesure en temps réel de l'ADN glycosylase et des activités endonucléase AP dans des lysats de cellules nucléaires. Le test donne des taux d'activité de réparation d'ADN qui se prêtent à l'analyse cinétique et est adaptable pour la quantification de l'activité réparation de l'ADN dans les tissus et les lysats tumoraux ou avec des protéines purifiées.

Abstract

Nous décrivons une méthode pour la détermination quantitative, mesure en temps réel de l'ADN glycosylase et des activités endonucléase AP dans des lysats de cellules nucléaires de base à l'aide de réparation excision (BER) des balises moléculaires. Le substrat (balise) est constitué d'un désoxyoligonucléotide contenant une lésion de base unique avec une 6-carboxyfluorescéine (6-FAM) fragment conjugué à l'extrémité 5 'et un fragment Dabcyl conjugué à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide. La balise BER moléculaire est de 43 bases de longueur et la séquence est conçu pour favoriser la formation d'une structure tige-boucle avec 13 nucléotides dans la boucle et 15 paires de bases dans la tige 1,2. Lorsqu'elle est pliée dans cette configuration, le groupe 6-FAM est désactivé par Dabcyl de manière non fluorescent par l'intermédiaire d'Förster résonance de l'énergie de transfert (FRET) 3,4. La lésion est positionné de telle sorte que après le retrait lésion de base et la scission brin restants 5 oligonucléotide de base contenant le groupe 6-FAM est libéré de la tige. Libérer undétachement e des quencher (DABCYL) entraîne une augmentation de la fluorescence qui est proportionnelle au niveau de la réparation de l'ADN. En recueillant de multiples lectures des valeurs de fluorescence, en temps réel d'évaluation de l'activité BER est possible. L'utilisation de la norme quantitative instruments PCR en temps réel permet l'analyse simultanée de nombreux échantillons. La conception de ces balises BER moléculaires, avec une lésion de base unique, est soumise à des analyses cinétiques, la quantification et la validation BER inhibiteur et est adaptable pour la quantification de l'activité réparation de l'ADN dans les tissus et les lysats de cellules tumorales ou avec des protéines purifiées. L'analyse de l'activité BER dans les lysats tumoraux ou de tissus aspire à l'aide de ces balises moléculaires peuvent être applicables à des mesures de biomarqueurs fonctionnels. En outre, l'analyse de l'activité du TEB avec des protéines purifiées en utilisant ce dosage quantitatif fournit un moyen rapide, à haut débit méthode pour la découverte et la validation des inhibiteurs de BER.

Protocol

1. Conception de la balise moléculaire 1.1 Conception et commander votre balise moléculaire La conception de votre balise moléculaire doit tenir compte de ce qui suit: Nous avons de bons résultats avec des oligonucléotides d'ADN 43-mer. La teneur en GC devrait être> 32%. Exclure une base G à l'extrémité 5 '. Demande 6-FAM (6-carboxyfluorescéine) conjugaison sur l'extrémité 5 'et en 3 Dabcyl' …

Discussion

Il ya plus de 600 citations à l'aide «molecular beacon» le terme pour la détection et la quantification de nombreuses molécules et les activités enzymatiques, y compris l'activité hélicase 6, une activité ADN polymérase 7,8, l'ADN ligase l'activité 9, 10 activité de la télomérase, l'ADN photolyase d'activité de 11 et de l'ADN / ARN hybrides 12, parmi beaucoup d'autres. En plus de l'utilisation de balises moléculair…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de Pittsburgh et le National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] pour RWS. Prise en charge de l'UPCI Facilité Lentiviral a été fournie à RWS par la subvention d'appui du Centre du cancer de la National Institutes of Health [P30 CA047904]. Soutien a également été fourni par le ministère Université de Pittsburgh de pharmacologie et de biologie chimique à la DS. Soutien a également été fourni par l'ESTRO à CV.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Potassium Chloride Fisher P217-500 Molecular grade
EDTA Fisher BP120-500  
Glycerol Fisher BP229-1 Molecular grade
DTT Fisher BP172-5  
HEPES- Solution Invitrogen 15630  
HEPES-Salt Sigma H4034-500G  
Potassium Hydroxide Sigma 17-8  
0.22μM filter Nalgene 167-0020  
Slide-A-Lyzer Dialysis Products Pierce 66373 MW 7000
Syringe Fisher 309659  
Needle Fisher 305196  
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Black
15 mL Falcon Tubes Fisher 352097  
NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183  
PBS Invitrogen 14190  
Molecular Beacons IDT    
BioRad Protein assay dye reagent concentrate BioRad Cat# 500-0006  

References

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Cite This Article
Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).

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