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Biology

Quantitative, en temps réel Analyse de l'activité de réparation par excision de base dans les lysats cellulaires Utilisant des lésions spécifiques Beacons moléculaires

doi: 10.3791/4168 Published: August 6, 2012

Summary

Nous décrivons une méthode pour la détermination quantitative, mesure en temps réel de l'ADN glycosylase et des activités endonucléase AP dans des lysats de cellules nucléaires. Le test donne des taux d'activité de réparation d'ADN qui se prêtent à l'analyse cinétique et est adaptable pour la quantification de l'activité réparation de l'ADN dans les tissus et les lysats tumoraux ou avec des protéines purifiées.

Abstract

Nous décrivons une méthode pour la détermination quantitative, mesure en temps réel de l'ADN glycosylase et des activités endonucléase AP dans des lysats de cellules nucléaires de base à l'aide de réparation excision (BER) des balises moléculaires. Le substrat (balise) est constitué d'un désoxyoligonucléotide contenant une lésion de base unique avec une 6-carboxyfluorescéine (6-FAM) fragment conjugué à l'extrémité 5 'et un fragment Dabcyl conjugué à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide. La balise BER moléculaire est de 43 bases de longueur et la séquence est conçu pour favoriser la formation d'une structure tige-boucle avec 13 nucléotides dans la boucle et 15 paires de bases dans la tige 1,2. Lorsqu'elle est pliée dans cette configuration, le groupe 6-FAM est désactivé par Dabcyl de manière non fluorescent par l'intermédiaire d'Förster résonance de l'énergie de transfert (FRET) 3,4. La lésion est positionné de telle sorte que après le retrait lésion de base et la scission brin restants 5 oligonucléotide de base contenant le groupe 6-FAM est libéré de la tige. Libérer undétachement e des quencher (DABCYL) entraîne une augmentation de la fluorescence qui est proportionnelle au niveau de la réparation de l'ADN. En recueillant de multiples lectures des valeurs de fluorescence, en temps réel d'évaluation de l'activité BER est possible. L'utilisation de la norme quantitative instruments PCR en temps réel permet l'analyse simultanée de nombreux échantillons. La conception de ces balises BER moléculaires, avec une lésion de base unique, est soumise à des analyses cinétiques, la quantification et la validation BER inhibiteur et est adaptable pour la quantification de l'activité réparation de l'ADN dans les tissus et les lysats de cellules tumorales ou avec des protéines purifiées. L'analyse de l'activité BER dans les lysats tumoraux ou de tissus aspire à l'aide de ces balises moléculaires peuvent être applicables à des mesures de biomarqueurs fonctionnels. En outre, l'analyse de l'activité du TEB avec des protéines purifiées en utilisant ce dosage quantitatif fournit un moyen rapide, à haut débit méthode pour la découverte et la validation des inhibiteurs de BER.

Protocol

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1. Conception de la balise moléculaire

1.1 Conception et commander votre balise moléculaire

La conception de votre balise moléculaire doit tenir compte de ce qui suit:

  1. Nous avons de bons résultats avec des oligonucléotides d'ADN 43-mer. La teneur en GC devrait être> 32%. Exclure une base G à l'extrémité 5 '.
  2. Demande 6-FAM (6-carboxyfluorescéine) conjugaison sur l'extrémité 5 'et en 3 Dabcyl' modification.
  3. La position de la lésion doit être sur la base n ° 6 à partir de l'extrémité 5 '.
  4. La longueur de la tige en épingle à cheveux ou un duplex doit être au minimum de 15 pb.
  5. La longueur de la boucle recommandée est de 13 bases.
  6. La structure globale de la balise est comme le montre la figure 1.
  7. Une fois la séquence et la lésion de type est décidé, l'oligonucléotide peut être commandé auprès de la plupart des entreprises d'oligonucléotides. Nous commandons nos oligonucléotides de IDT et demande que les oligonucléotides sont purifiés par HPLC et provided forme d'une poudre ou sous une forme séchée.

1.2 Recuit votre balise moléculaire

  1. Dissoudre oligonucléotides d'ADN dans un tampon de dilution lyophilisés Oligo (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM d'EDTA) pour donner une solution concentrée moléculaire Stock Beacon de 40 uM.
  2. Préparer une solution Beacon 200 nM moléculaire travaillant à partir de 40 uM Beacon solution mère moléculaire en utilisant le tampon de réaction BER (voir ci-dessous). Ajouter la solution 200 nM Beacon moléculaire travaillant dans un tube stérile de 1,5 mL noir.
  3. Incuber le tube contenant la solution à 200 nM Beacon moléculaire travaillant dans un grand bécher d'eau bouillante pendant 3 minutes.
  4. Après 3 minutes, retirer le bécher de la source de chaleur et laisser incuber les phares moléculaires dans l'eau nuit à promouvoir recuit. Utilisez la chaleur des matériaux isolants à la fois sur et sous le bécher à ralentir le processus de refroidissement.
  5. Beacons aliquotes dans des tubes stériles, noir 1,5 ml, 100 pi pour chaque tube.
  6. Conserver à -30 ° C.

1.3 Evaluation de la qualité de votre balise moléculaire

  1. Effectuer une analyse de la courbe de fusion pour confirmer que les balises BER moléculaires ne sont pas fluorescents jusqu'à chauffée, afin de déterminer la température de fusion optimale et de confirmer que chaque balise une fluorescence lorsqu'ils sont chauffés.
  2. Pour chaque balise, ajouter le volume de la solution indiquée de 200 nM Beacon moléculaire de travail et un tampon de réaction BER, comme indiqué dans le tableau 1, à 6 puits d'une optique rapide plaque de 96 puits (Applied Biosystems, Cat # 4346906).
  3. Utilisation d'un instrument PCR en temps réel tel que le StepOnePlus (Applied Biosystems) ou similaire du système à surveiller FAM-colorant d'excitation pendant l'analyse de la courbe à l'état fondu.
  4. Programme le temps réel instrument PCR (système StepOnePlus) pour surveiller FAM colorant d'excitation en fonction de la température augmente par petits incréments pour analyse de la courbe à l'état fondu. Le système StepOnePlus est programmé pour mesurer FAM fluorescencence et la rampe de 25 ° C à 95 ° C en 0,5 ° C intervalles. Une courbe de fusion typique est illustré à la figure 2.
  5. Fluorescence de fond que peu ou pas devrait être visible à des températures inférieures à 50 ° C. Vérifiez pour une augmentation uniforme et abrupte de la fluorescence, ce qui indique des balises de qualité pure et élevée. Valeurs de Tm d'environ 60 ° C à 80 ° C sont favorables et doivent être égales pour toutes les dilutions.
  6. Déterminer T max, la température à fluorescence maximale [Fl (max)] les valeurs, à partir de cette analyse. La proportionnalité des valeurs de fluorescence à T m ou T max à l'entrée de balise (la concentration) doit être linéaire. La valeur de fluorescence à T max, Fl (max), devrait dépasser les valeurs de fond à 37 ° C au moins 5 fois.

2. Préparation du lysat nucléaire

Excision Repair 2.1 Base de réaction tampon de 5 préparation

  1. Ajouter tous les éléments énumérésdans le tableau 2 et amener le volume du tampon à 900 ml avec ddH 2 O.
  2. Ajuster le pH à 7,8 à l'aide de potassium 8,0 N d'hydroxyde de (Sigma, Cat # 17-8).
  3. Porter le volume de la mémoire tampon à 1000 ml en utilisant ddH 2 O.
  4. Filtrer le tampon à l'aide de 0,22 um, filtre Nalgene 1 L filtre (cat # 167-0020).
  5. Ajouter dithiothréitol (DTT) immédiatement avant d'utiliser le tampon de réaction BER.

2.2 La culture cellulaire et de l'isolement cellulaire

  1. Il est suggéré de cellules en culture jusqu'à confluence 90-100%. Isoler les cellules de 4-6 plats (150 mm) afin d'obtenir suffisamment de lysat nucléaire pour un ensemble complet d'analyses (environ 5 x 10 7 cellules au total).
  2. Il est conseillé de préparer 3 cultures indépendantes pour 3 culots cellulaires indépendants pour obtenir biologique répétitions pour chaque analyse.
  3. Lysats nucléaires sont facilement préparées en utilisant la procédure d'isolement NucBuster (EMD Cat Bioscience Calbiochem # 71183-3) ALTHough tout protocole isolement nucléaire serait approprié (voir ci-dessous, la section 2.3.).

2,3 préparation de lysat nucléaire

  1. Avant de commencer, un cocktail de protéase inhibiteur lyophilisée (Calbiochem, Cat # 539131, Set 1) est d'abord remis en suspension dans 100 pl d'eau stérile pour préparer un stock 100x. Utilisez immédiatement ou congeler en aliquots à -20 ° C pour le stockage à long terme. Calculer 1 ul du stock 100x pour tous les 7 à 10 cellules extraites, selon les besoins.
  2. Toutes les étapes au cours de la procédure d'extraction doit être effectuée sur la glace ou à 4 ° C afin d'assurer la stabilité des protéines.
  3. Étiquette 15 ml tubes Falcon et les placer sur la glace.
  4. Retirez le support de croissance des cellules et laver deux fois avec 7,5 ml de PBS froid.
  5. Ajouter 5 ml de PBS froid à chaque plat et les cellules de la plaque de gratter l'aide d'un lève-cellule. Transfert des cellules du tube 15 ml Falcon réfrigérés.
  6. Centrifuger à basse vitesse (500x g, 4 ° C) pendant 5 minutes. Enlever le surnageantet d'estimer la valeur d'hématocrite par comparaison. (Jusqu'à 250 volumes ul hématocrite peuvent être traitées dans un seul tube de 1,5 ml)
  7. Centrifuger pendant encore 1 minute à 500x g et retirer le reste de PBS avec une pipette. Remettre en suspension le culot cellulaire dans réactif d'extraction NucBuster 1 selon la taille de l'hématocrite: 150 ul de réactif d'extraction NucBuster 1 pour un volume de 50 ul hématocrite. (Sinon, le culot cellulaire peut être surgelé sur la glace sèche ou à l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'au moment de procéder).
  8. Après la remise en suspension, transférer lysat à un pré-tube de 1,5 ml réfrigérés.
  9. Vortex 15 sec à vitesse élevée, incuber sur de la glace pendant 5 minutes, et le vortex à nouveau 15 sec à vitesse élevée.
  10. Centrifuger à 13000 xg pendant 5 minutes à 4 ° C.
  11. Le surnageant contient fraction cytoplasmique. Retirer et stocker à -80 ° C ou les jeter.
  12. Re-suspendre le culot dans un mélange de 1 pi de re-suspendue Cocktail Inhibiteur de la protéase 100x, 1 & mu; l de 100 mM de DTT et 75 ul de réactif d'extraction NucBuster 2 pour un volume de 50 ul de cellules emballés.
  13. Vortex 15 sec à vitesse élevée, incuber sur de la glace pendant 5 minutes, et encore vortex 15 sec à vitesse élevée.
  14. Centrifuger à 13000 xg pendant 5 minutes à 4 ° C. Le surnageant contient les protéines nucléaires. Recueillir le surnageant et passez à l'étape suivante.

2,4 dialyse, la quantification des protéines et aliquotage

  1. Toutes les étapes au cours de la procédure de dialyse doit être effectuée avec pré-réfrigérés, les matériaux et l'équipement pour assurer la qualité extrait.
  2. Préparer un tampon de dialyse (1 L requis par échantillon) comme détaillé dans le tableau 3. Important: tampon doit être froide (4 ° C). Nous vous proposons de préparer au moins la veille. Tampon de dialyse filtrée peut être conservé à 4 ° C indéfiniment si la TNT n'a pas été ajouté.
  3. Pré-refroidissement béchers (2 béchers de 1 L par échantillon), un tampon de dialyse, les chambres de dialyse, micro-centrifugeusetubes, seringues et aiguilles.
  4. Juste avant d'utiliser - ajouter 1 mL 1 M DTT par litre de tampon de dialyse.
  5. Dialyser le lysat préparé à l'étape 2.3 dans 0,5 L tampon de dialyse pré-réfrigérés pendant 90 minutes à 4 ° C en agitant doucement l'aide d'un Slide-A-Lyzer PIERCE cassette de dialyse (0,5-3 cassettes dialyse mL avec 7000 MW de coupure).
  6. Transfert cassette de dialyse à un deuxième bécher contenant 0,5 tampon de dialyse L pré-réfrigérés et dialyser lysat pendant 90 minutes à 4 ° C avec une agitation douce.
  7. Recueillir la solution de protéine dialysée nucléaire de la cassette de dialyse à l'aide d'une seringue (Fisher, cat # 309659). Utilisation d'un joint différent de celui utilisé précédemment pour injecter la protéine dans la cassette de dialyse. Notez que l'extrait peut-être cristallisé en raison des concentrations en protéines. Essayez d'inclure la recherche de cristaux nuageux lorsque vous retirez la solution de protéine dialysée nucléaire.
  8. Aliquoter l'échantillon à micro-centrifugeuse tubes, 20 pl de chaque. Gel rapide sur la glace sèche et le stockagee à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  9. Déterminer la concentration de la protéine dialysée en utilisant des protocoles standard. Exemples de concentrations attendus lysat nucléaires sont présentés dans le Tableau 4.
  10. Enfin, des lysats doivent être évalués pour le contrôle de qualité. Évaluation des lysats varie en fonction de l'expérience. Comme décrit précédemment, nous avons l'habitude d'analyser lysats pour l'expression de protéines par l'intermédiaire de plusieurs BER 1,2 immunoblot.
  11. L'étape de dialyse est utilisé pour préparer une solution de réaction uniforme à travers les lignes de cellules pour faciliter la comparaison. L'omission de l'étape de dialyse peuvent influer sur les taux enzymatiques et l'analyse cinétique depuis les solutions salines et les conditions de réaction ne sont plus identiques dans les différentes lignées cellulaires et des préparations en raison des différentes dilutions nécessaires. Toutefois, nous avons observé que l'utilisation de lysats de plus de 5 ug / ul et l'ajout de tampon de réaction suffisante ne permet l'omission de l'étape de dialyse (données non présentées). Pour inhibiteur des études eà ne nécessitent pas de comparaison entre différents lysats cellulaires, la dialyse ne peut être exigé. Toutefois, nous recommandons de dialyse, comme indiqué.

3. Essai Beacon moléculaire

3.1 Les besoins en équipement

  1. Un quantitative en temps réel instrument de PCR, comme StepOnePlus qRT-PCR ou comparable, ou d'un fluorimètre plaque de 96 puits capable de détecter et de mesurer la fluorescence FAM en temps réel. Remarque: Cette procédure est applicable à n'importe quelle machine capable de lire les valeurs de fluorescence des balises et de les enregistrer en temps réel. La machine doit, toutefois, permettre à l'utilisateur d'accéder à des valeurs brutes de fluorescence pour l'analyse des données.
  2. Centrifuger compatible avec optiques QRT-PCR tubes ou des plaques utilisées.
  3. Microsoft Excel pour analyser les données recueillies.

3.2 Tampons et réactifs

  1. Optiques QRT-PCR tubes ou des plaques avec des couvertures correspondantes.
  2. Tampon de réaction BER (voir unBove et le tableau 2).
  3. Dialyse protéine nucléaire extrait tel que préparé dans les étapes 2.3 et 2.4 et dilué à 2 ug / uL protéines avec un tampon de réaction contenant du DTT BER.
  4. Beacons moléculaires dilué à 200 uM avec un tampon de réaction BER pour créer la solution Beacons moléculaire de travail (voir ci-dessus).

3.3 Essai de set-up (tableau 5)

  1. La machine qRT-PCR n'est pas normalement utilisée comme un fluorimètre de sorte que la méthode run doit être changé.
    1. Programme d'une première étape et régler la température de réaction à 37 ° C avec un temps de cycle (points dans le temps pour les mesures) de 20 secondes avec un minimum de 180 cycles (ou plusieurs, en fonction de la conception du test de réparation). Assurez-vous de recueillir des données au cours des cycles. Par conséquent, la machine sera de recueillir des données toutes les 20 secondes pour un total de 1 h.
    2. Créer une deuxième étape que les rampes de la température Tmax de la balise particulière, la température avec la fluorescence maximale, comme dissuader lesextrait à l'étape 1.3 (évaluation de la qualité de votre balise moléculaire). Le temps de cycle devrait être à nouveau 20 secondes avec un total de 15 cycles. Ce sera de recueillir des données toutes les 20 secondes pendant 5 minutes à la fluorescence maximale possible de la balise. Les valeurs de fluorescence mesurées pendant les cycles à Tmax est utilisée pour normaliser les valeurs de fluorescence dans chacun des puits (étape 4.2a). Si vous utilisez plusieurs balises différentes veillez à inclure des mesures qui fournissent des valeurs semblables répétitives pour le Tmax de ces balises ainsi.
    3. Réglez le volume de réaction à 25 pi.
  2. Mise en place de la conception de la plaque sur la machine qRT-PCR en utilisant le logiciel de l'Applied Biosystems a. Nous sommes seulement intéressés par les valeurs brutes de fluorescence, afin de sélectionner la «courbe standard" - expérience de type.
  3. Remplissez le disposition de la plaque. Un exemple est montré dans le tableau 5. Ne rien ajouter dans les puits sélectionnés comme la courbe standard.

3,4 dosage Run

  1. Lutinortant: Utilisation pré-réfrigérée matériau et des solutions. Tenir au frais avant l'exécution et la détection.
  2. Ajouter quantité appropriée de DTT dans la mémoire tampon de réaction de BER à être utilisé.
  3. Diluer la solution de protéine à une concentration de 2 ug / uL en utilisant un tampon de réaction BER (avec la TNT).
  4. Pour les premières expériences, nous vous suggérons d'utiliser 10 pg de lysat nucléaire dialyse par puits (5 pl / puits) et 1 pmole de substrat, la balise moléculaire à une concentration de 40 nM finale (5 pl / puits). Nous avons toujours obtenu de haute qualité et des résultats reproductibles avec 10 pg de lysat cellulaire, mais il est possible que des lysats cellulaires différents ou des substrats de balises peuvent dicter des concentrations de protéines plus ou moins élevés.
    1. Les composants de l'essai dans chaque puits sont de 15 pi de tampon de réaction BER, 5 balise ul et 5 lysat ul nucléaire. Exécuter chaque combinaison balise / lysat en triple exemplaire.
    2. Plusieurs contrôles négatifs sont nécessaires pour chaque balise, y compris des échantillons, sans balise, comme 25 μ L de tampon de réaction BER seulement, et 20 pi de tampon de réaction BER avec 5 ul de lysat et 20 ul de tampon de réaction du TEB avec 5 pi de balise sans lysat.
    3. Plusieurs échantillons de contrôle sont nécessaires pour chaque lysat nucléaire. Il s'agit notamment un contrôle négatif [15 pi de tampon de réaction BER, 5 balise de contrôle ul (pas de lésion) et 5 lysat échantillon ul]. Nous vous suggérons aussi d'inclure des contrôles positifs expérimentaux tels que l'inclusion de THF contenant des balises qui imitent site abasique contenant des oligos et sont facilement incisée [15 pi de tampon de réaction BER, 5 balise ul THF et 5 pi lysat échantillon]. Bien sûr, le contrôle précis positif dépendra de la conception globale expérimentale.
  5. A titre d'exemple, suivre le tableau 5 ci-dessous pour la disposition de la plaque.
  6. Pipeter dans des tubes ou des plaques optiques tandis que sur la glace ou un support refroidi afin de minimiser initiation de la réaction avant la détection du signal.
  7. Tampon de réaction Pipet BER d'abord dans tous les puits.
  8. La balises pipette n en fonction de la disposition de la plaque dans les puits appropriés et toujours pipette lysats dernière dans les puits afin de minimiser initiation de la réaction avant la détection du signal.
  9. Fermer les tubes ou des plaques à fond, mélanger et tourner avec une centrifugeuse pour recueillir des solutions au fond des tubes ou des plaques
  10. Insérez la plaque en qRT-PCR de la machine et commencer à dosage.
  11. Après l'achèvement, exporter les données brutes, de préférence en format Excel. Pour le système StepOnePlus uniquement les données multi-composants sont nécessaires. Celui-ci contient toutes les valeurs de fluorescence à de multiples lectures de l'classées par couleur de teinture et bien.

4. Analyse moléculaire de dosage Beacon

Nous avons utilisé le logiciel Microsoft Excel pour effectuer ces analyses et les calculs. Nous recommandons l'établissement de modèles et des macros qui permettent une analyse simple et rapide et affichages graphiques basées sur des données provenant de formats standard de 96 puits.

4.1 Enlèvement des Contexte

">
  • Utilisation des valeurs brutes de fluorescence à partir des données multi-composants, d'une part organiser les données en même / échantillon. Pour que le système StepOnePlus cela peut être réalisé en exportant les données "à travers les colonnes" résultant dans un fichier Excel avec les lignes d'affichage multiple individuel lit dans les différents cycles pour les différents puits dans les colonnes.
  • Pour chaque balise moléculaire individuel, il faut soustraire les valeurs de fluorescence de fond détectées dans les contrôles négatifs (20 pi de tampon de réaction BER et 5 pi de balise) à partir des valeurs de fluorescence à chaque cycle dans tous les puits en utilisant cette balise moléculaire. Cela supprime les changements de fluorescence de fond ne sont pas associés avec le lysat de l'analyse future.
  • 4.2 Fl (Tmax) de normalisation

    Pour faire face à la variabilité de pipetage et détection par fluorescence dans différents puits, on normalise les données à des valeurs maximales de fluorescence (qui corrèlent avec entrée de balise).

    1. Calculer les valeurs moyennes de fluorescence de cycles à T max pour l'individu ainsi: FI (T max) (étape 3.3aii).
    2. Calculer le taux de Fl (cycle x) / Fl (T max) et multiplier par 100. Dans l'hypothèse probable que Fl (T max) correspond à la valeur maximale de fluorescence possible lorsqu'il est complètement incisée, ces données normalisées représentent% gratuit FAM (balise =% BER incisé).
    3. Combiner les trois échantillons par la moyenne des données (% gratuite FAM) des 3 puits pour chaque cycle (jusqu'au cycle 180) et de calculer les erreurs sur chaque.
    4. Calculer les temps de 20 secondes en multipliant à chaque cycle.
    5. Depuis la variance et à bien dans la détection par fluorescence peut être importante, nous recommandons d'ajouter un colorant fluorescent tel que ROX au stock balise moléculaire qui sert de standard pour ré-ajuster les valeurs de fluorescence des puits individuels. Dans ce cas, le colorant ROX serait utilisé comme étalon interne (référence passive) dans tous les puits unique. ROXspectres d'excitation et d'émission (excitation - 588 nm, 608 nm d'émission) est distincte de celle du colorant 6-FAM occupée dans l'essai (d'excitation - 495 nm, l'émission - 520 nm). Le colorant ROX permettrait une étape de normalisation semblable à RT-PCR conventionnelle des procédures qui permet la normalisation de puits à puits différences qui peuvent survenir en raison d'artefacts. Ils peuvent résulter d'erreurs de pipetage ou peuvent provenir de puits à puits variation de l'efficacité de détection par fluorescence.

    4.3 Terrain

    1. Terrain de données normalisées fluorescence (% gratuite FAM) en fonction du temps (en secondes) dans un nuage de points avec des erreurs correspondantes.
    2. Nous recommandons l'analyse cinétique de réparation dans au moins trois différentes préparations lysat nucléaires représentant réplique biologique. Afin d'évaluer la variance inter-expérimentales erreurs calculées à partir des moyennes de chaque expérience individuelle doit être affiché.
    3. Une analyse représentative de deux lysats de cellules tumorales: LN428, un gliomelignée cellulaire avec des niveaux indétectables de méthyle purine ADN glycosylase (MPG) et LN428/MPG, la même lignée cellulaire conçu pour une expression élevée de la MPG, les deux lignées de cellules ont des niveaux équivalents de AP endonucléase 1 (APE1) 1,2. Chaque ont été sondées pour l'activité et l'activité APE1 MPG en utilisant le BER THF moléculaire Beacon (Figure 3) et le BER Hx moléculaire Beacon (Figure 4), où le THF = tétrahydrofuranne (un substrat pour APE1) et Hx = hypoxanthine (un substrat pour MPG) . Remarque: Dans la figure 3 (substrat THF), les résultats des lysats LN428/MPG montrent une fluorescence inférieure au maximum absolu que par rapport aux LN428 lysats. Ceci est le résultat d'une valeur d'entrée inférieure de balise telle que déterminée en utilisant des valeurs Tmax (voir 3.3a). Lorsque cette valeur inférieure a été utilisée pour normaliser les résultats, il en résulte un changement important dans l'intrigue. Ceci illustre bien l'importance de normaliser les données. Représentation graphique des valeurs absolues de fluorescence à lui seul suggère le rapatriementtaux IR entre LN428 et les cellules LN428/MPG sont différents. Toutefois, lorsque les données sont normalisées compte de la variabilité et à bien, la différence APE1 médiation réparation taux est montré à être minimes.

    5. Les résultats représentatifs

    Nous décrivons une méthode pour la détermination quantitative, mesure en temps réel de l'ADN glycosylase et des activités endonucléase AP dans des lysats de cellules nucléaires de base à l'aide de réparation excision (BER) des balises moléculaires (Figure 1). Une fois recuit, nous vous suggérons d'effectuer une analyse courbe de fusion (tableau 1) comme une évaluation de la qualité de votre balise moléculaire (Figure 2). Lysats nucléaires peuvent ensuite être préparée, en utilisant les composants du tampon énumérés dans le tableau 2. Dialyser le lysat dans 0,5 L tampon de dialyse pré-réfrigérés pendant 90 minutes à 4 ° C en agitant doucement à l'aide d'une cassette PIERCE dialyse Slide-A-Lyzer contre le tampon de dialyse listés dans le tableau 3. Recueillir ledialyse solution de protéine nucléaire de la cassette de dialyse à l'aide d'une seringue. Utilisation d'un joint différent de celui utilisé précédemment pour injecter la protéine dans la cassette de dialyse. Déterminer la concentration de la protéine dialysée en utilisant des protocoles standard. Exemples de concentrations attendus lysat nucléaires sont présentés dans le Tableau 4. Exécuter la réaction comme indiqué ci-dessus (étape 3.4), en utilisant la disposition de la plaque, comme indiqué dans le tableau 5. Une analyse représentative de deux lysats de cellules tumorales: LN428, une lignée cellulaire de gliome avec des niveaux indétectables de méthyle purine ADN glycosylase (MPG) et LN428/MPG, la même lignée cellulaire conçu pour une expression élevée de la MPG, les deux lignées de cellules ont des niveaux équivalents de AP endonucléase 1 (APE1) 1,2. Chaque ont été sondées pour l'activité et l'activité APE1 MPG en utilisant le BER THF moléculaire Beacon (Figure 3) et le BER Hx moléculaire Beacon (Figure 4), où le THF = tétrahydrofuranne (un substrat pour APE1) et Hx = hypoxanthine(Un substrat pour MPG). Enfin, l'aide d'un dU BER / A Beacon moléculaire que les rapports sur l'activité glycosylase uracile, nous montrons que le signal de sortie ou de la force du signal est maximale à 10 pg de protéines et diminue à un niveau indétectable à 0,62 pg de protéine (figure 5).

    Figure 1
    Figure 1. La structure générale du BER Beacon moléculaire. Montré est la séquence et la conception globale des balises BER moléculaires utilisés dans les présentes comme étant une molécule simple brin, après recuit et de nouveau après la fusion. Le caractère gras, italique partie de la séquence est la tige (15 bases) et la partie soulignée de la séquence est la boucle (13 bases). FAM = 5 'colorant fluorescent 6-carboxyfluorescéine [sur l'extrémité 5'; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, coefficient d'extinction (260 nm): 20960; coefficient d'extinction (au max absorbance): 75.000] et Dabcyl = l' 3 'Dab agent d'extinction cyl [sur l'extrémité 3 '; Abmax = 453 nm; Gamme Trempe = Une 425-520 nm] X = la lésion (varie en fonction de la question de recherche) et Y = la base opposé à la lésion (varie en fonction de la question de recherche). .

    Figure 2
    Figure 2. Faire fondre le Curve. Une courbe de fusion représentant est indiqué pour le contrôle BER Beacon moléculaire (A), et les balises BER moléculaires contenant du tétrahydrofurane (THF) fragment (B) ou l'hypoxanthine (HX) groupement (C). Concentrations d'oligonucléotides variait de 0 nM (bleu foncé), 8 nm (rouge), 16 nm (vert), 32 nm (violet), 64 nM bleu à 128 nm (orange). Comme décrit dans l'étape 1.3, les oligonucléotides recuits ont été chauffés de 25 ° C à 95 ° C en 0,5 ° C et le système des intervalles StepOnePlus est programmé pour mesurer la fluorescence FAM à chaque intervalle de 0,5 ° C.

    contenu "> Figure 3
    Figure 3. Les données représentatives à l'aide du BER THF moléculaire Beacon. Activité endonucléase AP spécifique pour l'hydrolyse de l'abasique le site analogique tétrahydrofurane (THF) a été mesurée dans les lysats nucléaires de la lignée cellulaire de contrôle (LN428) et le MPG lignée cellulaire sur-expression (LN428/MPG) . Chaque lysat a été analysée en utilisant soit le contrôle BER Beacon moléculaire (LN428, vert; LN428/MPG, violet) ou le BER THF moléculaire Beacon (LN428, bleu; LN428/MPG, rouge). Les résultats sont présentés en tant que (A) les unités moyennes de réponse de fluorescence et (B) les mêmes données normalisées à l'entrée de balise comme décrit dans la section 4 ci-dessus (THF = tétrahydrofuranne).

    Figure 4
    Figure 4. Les données représentatives en utilisant le REC Hx moléculaire balise activité ADN glycosylase spécifique pour l'enlèvement du substrat MPG hypoxanthine (Hx) a été mesurée dans les lysats nucléaires de la lignée cellulaire de contrôle (LN428) et le MPG lignée cellulaire sur-expression (LN428/MPG). Chaque lysat a été analysée en utilisant soit le contrôle BER Beacon moléculaire (LN428, vert; LN428/MPG, violet) ou le BER Hx moléculaire Beacon (LN428, bleu; LN428/MPG, rouge). Les résultats sont présentés en tant que (A) les unités moyennes de réponse de fluorescence et (B) les mêmes données normalisées comme décrit dans la section 4 ci-dessus (Hx = hypoxanthine).

    Figure 5
    Figure 5. Les données représentatives en utilisant le dU BER / Une balise moléculaire à des niveaux de protéines différentes. ADN glycosylase (UNG) activité spécifique pour l'élimination de l'uracile (dU / A) a été mesurée dans les lysats nucléaires à partir de cellules T98G. Le lysat T98G été analysée en utilisant soit le contrôle BER Beacon moléculaire ou le BER dU / A Beacon moléculaire, à des niveaux de protéines de 10, 5, 2,5, 1,25 ou 0,62 pg, comme indiqué dans le figure. Les résultats sont données normalisées telles que décrites à la section 4 ci-dessus.

    Concentration de Beacon (nM) 0 8 16 32 64 128
    Solution Beacon moléculaire de travail (200 nM) ajoutée (pl) 0 1 2 4 8 16
    Tampon de réaction BER (w / o TNT) (pi) 25 24 23 21 17 9

    Tableau 1. Mise en page d'une expérience de courbe de fusion.

    1 Total L Volume de solution mère nécessaire Con. de la solution mère Con final.
    HEPES-KOH 25 ml 1M pH 7,8 25 mM </ Td>
    KCl 75 ml M 2 150 mM
    EDTA 1 ml PH 8,0 0,5 M 0,5 mM
    Glycérol 10 ml N / A 1%
    TNT (ajouter avant utilisation) 0,5 ml M 1 0,5 mM
    H 2 O 888,5 ml N / A N / A

    Tableau 2. Tampon de réaction BER.

    1 Total L Volume de solution mère nécessaire Con. de la solution mère Con final.
    HEPES-KOH 50 ml 1M pH 7,5 50 mM
    KCl 50 ml M 2 100 mM
    EDTA 1 ml PH 8,0 0,5 M 0,5 mM
    Glycérol 200 ml N / A 20%
    TNT (ajouter avant utilisation) 1 ml M 1 1 mM
    H 2 O 698 ml N / A N / A

    Tableau 3. Tampon de dialyse.

    Lignée cellulaire Concentration en protéines (pg / pl)
    LN428 5,34
    LN428/MPG 4,79

    Tableau 4. Résultats détermination des protéines.

    Contrôle Négatif 25 pi BER tampon (Contrôle de fond) 20 pi BER tampon
    5uL Con Beacon
    NO lysat
    (Test en trois exemplaires) <br /> 15μL de tampon BER
    5uL Con Beacon
    5uL LN428 Lysate
    (Test en trois exemplaires)
    15μL de tampon BER
    5uL Con Beacon
    5uL LN428/MPG Lysate
    Contrôle Négatif 25 pi BER tampon (Contrôle de fond) 20 pi BER tampon
    5uL THF Beacon
    NO lysat
    (Test en trois exemplaires) 15μL de tampon BER
    5uL THF Beacon
    5uL LN428 Lysate
    (Test en trois exemplaires) 15μL de tampon BER
    5uL THF Beacon
    5uL LN428/MPG Lysate
    Contrôle négatif
    20 pi de tampon BER
    5uL lysat
    (Contrôle de fond) 20 pi BER tampon
    5uL Hx Beacon
    NO lysat
    (Test en trois exemplaires)
    15μL de tampon BER
    5uL Hx Beacon
    5uL LN428 Lysate
    (Test en trois exemplaires) 15μL de tampon BER
    5uL Hx Beacon
    Ly LN428/MPG 5uLassouvir
    Contrôle négatif
    20 pi de tampon BER
    5uL lysat

    Tableau 5. Essai Beacon moléculaire mis en place.

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    Discussion

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    Il ya plus de 600 citations à l'aide «molecular beacon» le terme pour la détection et la quantification de nombreuses molécules et les activités enzymatiques, y compris l'activité hélicase 6, une activité ADN polymérase 7,8, l'ADN ligase l'activité 9, 10 activité de la télomérase, l'ADN photolyase d'activité de 11 et de l'ADN / ARN hybrides 12, parmi beaucoup d'autres. En plus de l'utilisation de balises moléculaires pour la mesure des activités de réparation d'ADN mentionnés ci-dessus, nous et d'autres ont démontré l'utilité de ces sondes pour l'analyse de l'activité BER 1,2,13-15.

    Le dosage en temps réel l'activité du BER, nous décrivons ici intègre une base unique modifié et permet l'évaluation quantitative des taux de BER pour différentes lésions ou des altérations dans la base opposé à la lésion. Les applications peuvent aller de moléculaires études mécanistiques sur les écrans d'inhibiteurs. Nous avons démontré la spécificité du BER en comparant lysates de MPG cellules exprimant avec non-cellules exprimant et le manque d'activité dans les balises de contrôle. Le test est très sensible, permettant la détection de défauts dans l'expression de la MPG BER ​​protéines 2 ou 1 et XRCC1 est suffisante pour détecter des changements mineurs dans les paramètres cinétiques et réparation de l'ADN de l'efficacité des inhibiteurs de la réparation de l'ADN [manuscrit en préparation]. Plusieurs lectures tout au long de l'appui le temps de réparation active calculée taux cinétiques et de l'importance dans les modifications de ces taux cinétiques. Le test BER balise moléculaire est donc adapté à haut débit des études à l'écran pour les inhibiteurs de l'enzyme de réparation de l'ADN (inhibiteur écrans) ou pour des études sur le rôle des différents composants nucléaires. L'analyse des lysats nucléaires permet l'évaluation de la réparation de l'ADN dans le contexte global du complexe BER donc aussi représentant des altérations ou des influences indirectes sur les machines BER (par exemple, modifications post-traductionnelles ou mutations).

    Laprotocole, tel que décrit, devrait donner des résultats très reproductibles et quantitatives. Cependant, il ya plusieurs détails à prendre en considération pour assurer une analyse appropriée: (1) les valeurs de fond de contrôles négatifs peut être trop élevé: Cela peut être dû à un mauvais entreposage ou la fabrication de l'oligonucléotide. Des valeurs de fond élevées dans les lysats sans balises indiquent autofluorescence confusion (par exemple par la contamination ou l'expression cellulaire des protéines fluorescentes exogènes). Si l'expression d'une protéine fluorescente est inévitable, les spectres d'excitation / émission pour le colorant reporter et la protéine fluorescente peut se chevauchent pas; (2) Fl (Tmax) est faible: la concentration en ADN est différent de celui donné. Vérifier la concentration d'ADN par spectrophotométrie (DO 260nm), par exemple, en utilisant le Nanodrop. Concentration d'ADN de haut avec une faible Fl (Tmax) indique une charge insuffisante sur le FAM balises. Purification par HPLC empêche la contamination par l'ADN non modifié (voir ci-dessus); (3) l'activité de réparation est pauvre: Si les Fl (Tmax) des valeurs àles derniers cycles indiquent d'entrée de balise suffisante et détection par fluorescence, ce qui pourrait suggérer que la préparation d'extrait nucléaire a échoué. La qualité extrait nucléaire est cruciale. Les basses températures devraient être assurés tout au long de la procédure, y compris à long terme de stockage à -80 ° C et (4) courbes d'activité de réparation engager avec des valeurs élevées: l'exposition Même très court des échantillons à température ambiante avant l'analyse initie réparation. Tenir au frais en tout temps.

    Ce test BER très sensible et quantitative est également applicable à l'analyse des protéines purifiées, permettant des études sur la spécificité de substrat en modifiant les balises moléculaire en conséquence. Enfin, le dosage est applicable à l'analyse de la tumeur et des tissus lysats, fournissant une occasion de mesurer les points de terminaison fonctionnels réparation de l'ADN en tant que biomarqueurs de réponse ou de l'efficacité thérapeutique, comme nous l'avons suggéré pour évaluer les tumeurs pour PARP1 potentialisation inhibiteur de la témozolomide agent alkylant 2.

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    Disclosures

    RWS est un consultant scientifique pour Trevigen, Inc Le reste des auteurs déclarent qu'il n'ya pas de conflits d'intérêts.

    Acknowledgments

    Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de Pittsburgh et le National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] pour RWS. Prise en charge de l'UPCI Facilité Lentiviral a été fournie à RWS par la subvention d'appui du Centre du cancer de la National Institutes of Health [P30 CA047904]. Soutien a également été fourni par le ministère Université de Pittsburgh de pharmacologie et de biologie chimique à la DS. Soutien a également été fourni par l'ESTRO à CV.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Potassium Chloride Fisher P217-500 Molecular grade
    EDTA Fisher BP120-500
    Glycerol Fisher BP229-1 Molecular grade
    DTT Fisher BP172-5
    HEPES- Solution Invitrogen 15630
    HEPES-Salt Sigma H4034-500G
    Potassium Hydroxide Sigma 17-8
    0.22μM filter Nalgene 167-0020
    Slide-A-Lyzer Dialysis Products Pierce 66373 MW 7000
    Syringe Fisher 309659
    Needle Fisher 305196
    1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Black
    15 mL Falcon Tubes Fisher 352097
    NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183
    PBS Invitrogen 14190
    Molecular Beacons IDT
    BioRad Protein assay dye reagent concentrate BioRad Cat# 500-0006

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    3. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
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    5. Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
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    Quantitative, en temps réel Analyse de l&#39;activité de réparation par excision de base dans les lysats cellulaires Utilisant des lésions spécifiques Beacons moléculaires
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    Cite this Article

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).More

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).

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