כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית
Summary
אנו מתארים את שיטת מדידה כמותית בזמן אמת, של ה-DNA glycosylase ופעילויות איי פי endonuclease ב lysates גרעיני התא. Assay מניב שיעורי פעילות תיקון דנ"א מקובל ניתוח הקינטית ניתנת להתאמה עבור כימות של פעילות ה-DNA תיקון רקמות lysates הגידול או עם חלבונים מטוהרים.
Abstract
אנו מתארים את שיטת מדידה כמותית בזמן אמת, של ה-DNA glycosylase ופעילויות איי פי endonuclease ב lysates גרעיני התאים באמצעות כריתה בסיס תיקון (BER) אלומות מולקולריות. המצע (משואה) מורכב deoxyoligonucleotide המכיל הנגע בסיס יחיד עם 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) מחצית מצומדות כדי 5'end ואת מחצית Dabcyl מצומדות עד הסוף '3 של oligonucleotide. משואת מולקולרית BER בן 43 בסיסים באורך רצף נועד לקדם את הקמתה של מבנה גזע לולאה עם 13 נוקלאוטידים לולאה ו -15 זוגות בסיסים ב 1,2 גזע. כאשר מקופל בתצורה זו מחצית 6-FAM הוא הרווה ידי Dabcyl באופן לא ניאון באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) 3,4. הנגע ממוקם כך בסיס הבאה הנגע הסרת scission גדיל oligonucleotide הנותרים 5 בסיס המכיל מחצית 6-FAM משתחרר מן הגבעול. לשחררND ניתוק מן (Dabcyl) תוצאות quencher לעלייה של הקרינה, כי הוא מידתי לרמת תיקון ה-DNA. על ידי איסוף מספר רב של קורא של ערכי הקרינה, בזמן אמת, הערכת הפעילות BER אפשרי. השימוש תקן כמותי בזמן אמת PCR מכשירים בו זמנית מאפשר ניתוח של דוגמאות רבות. העיצוב של אלה משואות BER מולקולרית, עם הנגע בסיס אחד, הוא מקובל ניתוחים הקינטית, כימות בער אימות מעכב והוא להתאמה עבור כימות של פעילות ה-DNA תיקון רקמות lysates תאים סרטניים או עם חלבונים מטוהרים. ניתוח של פעילות BER ב lysates הגידול או רקמות באמצעות aspirates אלה משואות מולקולרית עשויות לחול על מדידות סמן תפקודית. יתר על כן, ניתוח של פעילות BER עם חלבונים מטוהרים באמצעות זה assay כמותי מספק מהירה, תפוקה גבוהה השיטה על גילוי ואימות של מעכבי בר.
Protocol
Discussion
ישנם למעלה מ -600 אזכורים באמצעות "משואת מולקולרי" טווח לגילוי וכימות מולקולות רבות ופעילויות אנזימטיות, כולל פעילות helicase 6, DNA פולימרז פעילות 7,8, ה-DNA פעילות ligase 9, פעילות telomerase 10, פעילות ה-DNA ו-DNA photolyase 11 / RNA כלאיים 12, בין רבים אחרים. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של קרן פיטסבורג המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] כדי לצריבה חוזרת. תמיכה עבור מתקן UPCI lentiviral נמסר לצריבה חוזרת על ידי גרנט מרכז התמיכה הסרטן של המכון הלאומי לבריאות [p30 CA047904]. התמיכה ניתנה גם על ידי משרד אוניברסיטת פיטסבורג לפרמקולוגיה & לביולוגיה כימית DS. התמיכה ניתנה גם על ידי ESTRO כדי קורות חיים.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
