Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari. Il test produce tassi di attività DNA Repair suscettibili di analisi cinetica ed è adattabile per la quantificazione delle attività di riparazione del DNA nei tessuti e lisati tumorali o con le proteine purificate.
Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari di base utilizzando escissione riparazione (BER) segnali molecolari. Il substrato (beacon) è costituito da un deoxyoligonucleotide contenente una singola lesione base con un 6-carbossifluoresceina (6-FAM) porzione coniugata alla estremità 5 'e una frazione DABCYL coniugato all'estremità 3' dell'oligonucleotide. Il faro BER molecolare è 43 basi di lunghezza e la sequenza è progettato per favorire la formazione di una forcina struttura con 13 nucleotidi nel ciclo e 15 coppie di basi in 1,2 stelo. Quando ripiegato in questa configurazione il 6-FAM frazione viene bloccata mediante DABCYL in un modo non fluorescente tramite trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) 3,4. La lesione è posizionato in modo tale che in seguito alla rimozione lesione base e scissione filamento il restante 5 oligonucleotide base contenente il 6-FAM frazione viene rilasciato dallo stelo. Rilasciare undistacco dalle nd (DABCYL) risultati quencher in un aumento di fluorescenza che è proporzionale al livello di riparazione del DNA. Con la raccolta di più letture dei valori di fluorescenza, valutazione in tempo reale dell'attività BER è possibile. L'impiego di standard quantitativa PCR in tempo reale strumenti consente l'analisi simultanea di numerosi campioni. La progettazione di questi fari BER molecolari, con una lesione singola base, è suscettibile di analisi cinetica, la quantificazione BER e convalida inibitore ed è adattabile per la quantificazione dell'attività riparazione del DNA in tessuto e lisati cellulari tumorali o con proteine purificate. L'analisi dell'attività BER in lisati tumorali o tessuto aspira utilizzando questi segnali molecolari può essere applicabile a misurazioni biomarker funzionali. Inoltre, l'analisi dell'attività BER con proteine purificate utilizzando questo saggio quantitativo fornisce una rapida, ad alta capacità metodo per la scoperta e la convalida di inibitori BER.
Ci sono più di 600 citazioni usando 'faro molecolare' il termine per rilevare e quantificare molecole di numerose attività enzimatiche, inclusa l'attività elicasi 6, attività di DNA polimerasi 7,8, l'attività del DNA ligasi 9, l'attività della telomerasi 10, l'attività del DNA fotoliasi 11 e DNA / RNA ibridi 12, tra molti altri. Oltre all'uso di segnali molecolari per la misurazione delle attività di riparazione del DNA…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione Pittsburgh e il National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] per RWS. Il supporto per lo strumento UPCI lentivirale è stata fornita RWS mediante la concessione di supporto Cancer Center dal National Institutes of Health [P30 CA047904]. Il sostegno è stato fornito anche dalla University of Pittsburgh Dipartimento di Farmacologia & Chemical Biology al DS. Il sostegno è stato fornito anche da ESTRO a CV.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
EDTA | Fisher | BP120-500 | |
Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
DTT | Fisher | BP172-5 | |
HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
Syringe | Fisher | 309659 | |
Needle | Fisher | 305196 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
PBS | Invitrogen | 14190 | |
Molecular Beacons | IDT | ||
BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |