Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ, Real-time analyse av Base Excision Reparasjon aktivitet i Cell lysates utnytte Lesjon-spesifikke Molecular Beacons

doi: 10.3791/4168 Published: August 6, 2012

Summary

Vi beskriver en metode for kvantitativ, real-time måling av DNA glykosylase og AP endonuclease aktiviteter i celle kjernefysiske lysates. Analysen gir tallene for DNA Repair aktivitet mottagelig til kinetisk analyse og er tilpasningsdyktig for kvantifisering av DNA Repair aktivitet i vev og tumor lysates eller med rensede proteiner.

Abstract

Vi beskriver en metode for kvantitativ, real-time måling av DNA glykosylase og AP endonuclease aktiviteter i celle kjernefysiske lysates med Base excision reparasjon (BER) molekylære beacons. Underlaget (beacon) består av en deoxyoligonucleotide inneholder en enkelt base lesjon med en 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety konjugert til 5'end og en Dabcyl moiety konjugert til 3 'enden av oligonukleotid. Den BER molekylære fyrtårn er 43 baser i lengde og sekvensen er utformet for å fremme dannelsen av en stilk-sløyfe struktur med 13 nukleotider i loopen og 15 basepar i stammen 1,2. Når brettet i denne konfigurasjonen den 6-FAM moiety er slukket ved Dabcyl i en ikke-fluorescerende måte via Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4. Lesjonen er plassert slik at følgende basen lesjon fjerning og strand scission de resterende fem basen oligonukleotid inneholder 6-FAM moiety frigjøres fra stammen. Slipp ennd løsrivelse fra slukkeren (Dabcyl) resulterer i en økning av fluorescens som står i forhold til nivået av DNA-reparasjon. Ved å samle flere leser av fluorescens verdier, er sanntids vurdering av BER aktivitet mulig. Bruken av standard kvantitativ real-time PCR instrumenter tillater samtidig analyse av en rekke prøver. Utformingen av disse BER molekylære signaler, med en enkelt base lesjon, er mottagelig for kinetiske analyser, BER kvantifisering og hemmer validering og er tilpasningsdyktig for kvantifisering av DNA Repair aktivitet i vev og tumorcellelinjer lysates eller med renset proteiner. Analysen av BER aktivitet i tumor lysates eller vev aspirates bruker disse molekylære signaler kan være aktuelt å funksjonelle biomarkør målinger. Videre gir analysen av BER aktivitet med renset proteiner ved hjelp av denne kvantitative analysen en rask, high-throughput metode for oppdagelsen og validering av BER hemmere.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Molekylær Beacon Design

1.1 Utforming og bestiller din molekylære fyrtårn

Utformingen av molekylære fyrtårn må vurdere følgende:

  1. Vi har gode resultater med 43-mer DNA oligonukleotider. Den GC innhold bør være> 32%. Ekskludere en G base ved 5 'enden.
  2. Be om 6-FAM (6-Carboxyfluorescein) konjugering på 5 'enden og Dabcyl som en 3' modifikasjon.
  3. Plasseringen av lesjonen bør være på basen # 6 fra 5 'enden.
  4. Lengden av stammen eller hårnål duplex bør være minimum 15 bp.
  5. Den anbefalte Loop Lengden er 13 baser.
  6. Den generelle strukturen av varden er som vist i Figur 1.
  7. Når sekvensen og lesjonen-type er bestemt, kan oligonukleotid bestilles fra de fleste oligonukleotid selskaper. Vi bestiller våre oligonucleotides fra IDT og be om at oligonukleotider er HPLC renset og innsamlingsløsEd som pulver eller i en tørket format.

1,2 annealing din molekylære fyrtårn

  1. Løs lyofiliserte DNA oligonukleotider i Oligo Fortynning buffer (10 mM Tris-HCl, 8,0 pH, 0,1 mM EDTA) for å gi en konsentrert Molecular Beacon Stamoppløsning av 40 mikrometer.
  2. Forbered en 200nm Molecular Beacon jobbe løsning fra 40 mM Molecular Beacon stamløsning bruke BER reaksjonen buffer (se nedenfor). Tilsett 200 nM Molecular Beacon arbeider løsning til en steril svart 1,5 ml tube.
  3. Inkuber røret inneholder 200 nM Molecular Beacon jobber løsning i et stort begerglass med kokende vann i 3 minutter.
  4. Etter 3 minutter, fjern begerglasset fra varmekilden og Inkuber Molecular Beacons i vann over natten for å fremme avspenning. Bruk varmeisolerende materiale både over og under begerglasset å bremse kjøleprosessen.
  5. Delmengde Beacons i sterile, svarte 1,5 ml rør, 100 mL for hvert rør.
  6. Oppbevares ved -30 ° C.

1.3 Kvalitet vurdering av din molekylære fyrtårn

  1. Utfør en smelte kurve analyse for å bekrefte at BER molekylære beacons ikke fluoresce før oppvarmet, for å fastslå den optimale smeltetemperatur, og for å bekrefte at hver beacon vil fluoresce ved oppvarming.
  2. For hver beacon legge den indikerte volumet på 200 nM Molecular Beacon fungerer løsningen og BER reaksjon buffer, som angitt i tabell 1, 6 brønner på en rask optiske 96-brønnen plate (Applied Biosystems, Cat # 4346906).
  3. Bruk en real-time PCR instrument som StepOnePlus (Applied Biosystems) system eller lignende for å overvåke FAM-dye magnetisering under smelten kurven analysen.
  4. Program din real-time PCR instrument (StepOnePlus system) for å overvåke FAM fargestoff eksitasjon som en funksjon av økende temperatur i små intervaller for smelten kurve analyse. Det StepOnePlus systemet er programmert til å måle FAM fluoresceNCE og rampe fra 25 ° C til 95 ° C i 0,5 ° C intervaller. En typisk smelte kurve er vist i Figur 2.
  5. Lite eller ingen bakgrunnsfluorescens skal være synlig ved temperaturer under 50 ° C. Sjekk for en enhetlig og sterk økning i fluorescens, som indikerer rene og høy kvalitet beacons. Tm verdier rundt 60 ° C til 80 ° C er gunstig og bør være lik for alle fortynninger.
  6. Bestem T max, temperaturen på maksimale fluorescens [FL (maks)] verdier fra denne analysen. Forholdsmessigheten av de fluorescens verdier på T m eller T max til varden inngang (konsentrasjonen) bør være lineær. Fluorescens verdi ved T max, Fl (maks), bør overskride bakgrunnsnivå ved 37 ° C i minst fem ganger.

2. Nuclear lysate Forberedelse

2.1 Base Excision Repair reaksjon buffer 5 forberedelse

  1. Legg alle de oppførte komponentenei tabell 2 og bringe volumet av buffer til 900 ml med DDH 2 O.
  2. Juster pH til 7,8 med Kaliumhydroksid 8,0 N (Sigma, Cat # 17-8).
  3. Bring volumet av buffer til 1000 ml med DDH 2 O.
  4. Filtrer buffer med 0,22 mM filter, en Nalgene L filter (katt # 167-0020).
  5. Legg ditiotreitol (DTT) umiddelbart før bruk BER reaksjonsbuffer.

2,2 cellekultur og celleisolasjon

  1. Det er foreslått å kultur celler til 90-100% konfluent. Isoler celler fra 4-6 retter (150 mm) for å oppnå tilstrekkelig kjernefysisk lysate for et komplett sett av analyser (ca 5 x 10 7 celler totalt).
  2. Det anbefales å utarbeide 3 uavhengige kulturer for 3 uavhengige celle pellets å skaffe biologisk replikater for hver analyse.
  3. Kjernefysiske lysates er lett utarbeidet etter den NucBuster isolasjon prosedyren (EMD Biovitenskap Calbiochem Cat # 71183-3) although noen kjernefysisk isolasjon protokoll vil være hensiktsmessig (se nedenfor, kapittel 2.3.).

2,3 Nuclear lysate forberedelse

  1. Før du starter, er en lyofilisert proteasehemmer Cocktail (Calbiochem, Cat # 539131, Set 1) første re-suspendert i 100 mL sterilt vann for å forberede en 100x lager. Bruk umiddelbart eller fryse i alikvoter ved -20 ° C for langtidslagring. Beregn 1 mL av 100x lager for hver 10 7 utvunnet celler etter behov.
  2. Alle trinnene under utvinning prosedyren skal utføres på is eller ved 4 ° C for å sikre protein stabilitet.
  3. Label 15 ml Falcon rør og legg på is.
  4. Fjern vekstmedier fra celler og vask to ganger med 7,5 ml kald PBS.
  5. Tilsett 5 ml kald PBS til hver rett, og skrap celler fra platen ved hjelp av en celle løfteren. Overfør cellene til kjølte 15 ml Falcon rør.
  6. Sentrifuger ved lav hastighet (500x g, 4 ° C) i 5 minutter. Fjern supernatantenog anslå hematokrit ved sammenligning. (Opp til 250 mL hematokrit kan behandles i en enkelt 1,5 ml tube)
  7. Sentrifuger i en annen 1 minutt ved 500x g og fjerne resten av PBS med en pipette. Resuspender cellen pellet i NucBuster Ekstraksjonsreagens 1 i henhold til størrelsen på hematokrit: 150 mL NucBuster Ekstraksjonsreagens 1 per 50 mL hematokrit. (Alternativt kan cellepelleten være rask-frosset på tørris eller med flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C til den er klar til å fortsette).
  8. Etter re-suspensjon, overføre lysate til en pre-kjølt 1,5 ml tube.
  9. Vortex 15 sek på høy hastighet, inkuberes på is i 5 minutter, og virvle igjen 15 sek i høy hastighet.
  10. Sentrifuger ved 13 000 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  11. Supernatanten inneholder cytoplasmic brøk. Fjern og lagre ved -80 ° C eller kaste.
  12. Re-suspendere pellet i en blanding av 1 mL av re-suspendert 100x proteasehemmer Cocktail, 1 & mu, l 100 mM DTT og 75 mL NucBuster Ekstraksjonsreagens 2 per 50 mL hematokrit.
  13. Vortex 15 sek på høy hastighet, inkuberes på is i 5 minutter, og igjen virvle 15 sek i høy hastighet.
  14. Sentrifuger ved 13 000 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten inneholder kjernefysiske proteiner. Samle supernatanten og gå videre til neste trinn.

2,4 Dialyse, protein kvantifisering og aliquoting

  1. Alle trinnene under dialyse prosedyren skal utføres med pre-avkjølte løsninger, materialer og utstyr for å sikre ekstrakt kvalitet.
  2. Forbered dialyse buffer (1 L nødvendig per prøve) som beskrevet i Tabell 3. Viktig: Buffer skal være kaldt (4 ° C). Vi foreslår forbereder minst dagen før. Filtrert dialyse buffer kan oppbevares ved 4 ° C på ubestemt tid hvis DTT ikke har blitt lagt til.
  3. Pre-kulden begerglass (2 av en L beger per prøve), dialyse buffer, dialyse kamre, mikro-sentrifugerslanger, sprøyter og kanyler.
  4. Rett før bruk - tilsett 1 ml 1 M DTT per liter dialyse buffer.
  5. Dialyser den lysate utarbeidet i trinn 2.3 i 0,5 L pre-kjølt dialyse buffer i 90 minutter ved 4 ° C med milde omrøring ved hjelp av en PIERCE Slide-A-Lyzer Dialyse kassett (0.5-3 ml dialyse kassetter med 7000 MW cutoff).
  6. Overføring dialyse kassett til en andre begerglass som inneholder 0,5 L pre-kjølt dialyse buffer og Dialyser lysate i 90 minutter ved 4 ° C med milde omrøring.
  7. Samle dialyzed kjernefysisk protein løsning fra dialyse kassetten ved hjelp av en sprøyte (Fisher, katt # 309659). Bruk en annen pakning enn tidligere brukt til å injisere protein i dialyse kassetten. Vær oppmerksom på at ekstrakt kan ha krystallisert på grunn av høye protein konsentrasjoner. Prøv å ta overskyede etter krystaller når du fjerner dialyzed kjernefysisk protein løsning.
  8. Delmengde prøven til mikro-sentrifugerør, 20 mL hver. Rask fryse på tørris og lagringe ved -80 ° C inntil bruk.
  9. Bestem konsentrasjonen av dialyzed protein ved hjelp av standard protokoller. Eksempler på forventet kjernefysiske lysate konsentrasjoner er vist i tabell 4.
  10. Endelig bør lysates evalueres for kvalitetskontroll. Vurdering av lysates vil variere med forsøket. Som beskrevet tidligere, vi rutinemessig analysere lysates for uttrykk av flere BER proteiner via immunoblot 1,2.
  11. Det dialyse trinnet brukes til å lage en ensartet reaksjon løsning på tvers av cellelinjene å lette sammenligning. Utelate dialyse trinnet kan påvirke enzymatiske priser og kinetisk analyse siden saltløsninger og reaksjonsprodukter vilkårene ikke lenger er identisk i de ulike cellelinjer og preparater på grunn av ulike fortynninger som kreves. Vi har imidlertid observert at bruk lysates av mer enn fem mikrogram / mL og legge tilstrekkelig reaksjon buffer tillater utelatelse av dialyse trinn (data ikke vist). For hemmer studier thved ikke krever sammenligning mellom ulike celle lysates, kan dialyse ikke være nødvendig. Vi anbefaler imidlertid dialyse som angitt.

3. Molekylær Beacon Assay

3.1 Krav til utstyr

  1. En kvantitativ real-time PCR instrument, for eksempel StepOnePlus QRT-PCR eller tilsvarende, eller en 96-brønns plate fluorometer stand til å oppdage og måle FAM fluorescens i sanntid. Merk: Denne prosedyren gjelder for enhver maskin kunne lese fluorescens verdiene av sjømerker og ta dem i sanntid. Maskinen skal imidlertid tillate brukeren å få tilgang til rå fluorescens verdier for dataanalyse.
  2. Sentrifuger kompatibelt med optiske QRT-PCR-rør eller plater som brukes.
  3. Microsoft Excel til å analysere data samlet inn.

3.2 buffere og reagenser

  1. Optiske QRT-PCR-rør eller plater med tilsvarende trekk.
  2. BER reaksjon buffer (se enBove og tabell 2).
  3. Dialyzed kjernefysisk protein utvinner så forberedt i trinn 2.3 og 2.4 og fortynnes til 2 mikrogram / mL protein med BER reaksjon buffer som inneholder DTT.
  4. Molekylære Beacons fortynnet til 200 mM med BER reaksjon buffer for å skape den Molecular Beacons arbeider løsning (se ovenfor).

3,3 Assay set-up (tabell 5)

  1. Den QRT-PCR maskin blir normalt ikke brukes som en fluorimeter så løp metoden må endres.
    1. Program et første trinn og sett reaksjonen temperaturen til 37 ° C med en syklus tid (tidspunkter for måling) av 20 sek med et minimum av 180 sykluser (eller mer, avhengig av reparasjon analysen design). Sørg for å samle inn data under sykluser. Derfor vil maskinen samle inn data hvert 20 sekund for totalt 1 time.
    2. Lag en andre etappe som ramper temperaturen til Tmax av den aktuelle varden, temperaturen med maksimal fluorescens, som avskrekkeminelagt i trinn 1.3 (kvalitetsvurdering av din molekylær beacon). Syklusen tid bør igjen være 20 sek med totalt 15 sykluser. Dette vil samle inn data hvert 20. sekund i 5 minutter ved maksimal fluorescens mulig av varden. Fluorescens målte under sykluser på Tmax brukes til å normalisere fluorescens verdiene i hver brønn (trinn 4.2a). Hvis du bruker flere forskjellige beacons sørg for å inkludere tiltak som gir tilsvarende repeterende verdier for Tmax av de beacons også.
    3. Sett reaksjonen volumet til 25 mL.
  2. Sett opp tallerkenen design på QRT-PCR maskin med Applied Biosystems programvare. Vi er bare interessert i de rå fluorescens verdiene, så velg "Standard Curve" - ​​eksperiment type.
  3. Fullfør plate layout. Et eksempel er vist i tabell 5. Ikke legg noe til brønnene som er valgt som standard kurve.

3.4 Run assay

  1. Important: Bruk pre-kjølt materiale og løsninger. Oppbevares kjølig til løp og gjenkjenning.
  2. Legg passende mengde DTT til BER reaksjonen buffer som skal brukes.
  3. Fortynn protein løsning til en konsentrasjon på 2 mg / mL hjelp BER reaksjon buffer (med DTT).
  4. For innledende forsøk anbefaler vi å bruke 10 mikrogram dialyzed kjernefysisk lysate per brønn (5 mL / brønn) og 1 pmole av substrat, molekylære fyrtårn på en 40 nm endelig konsentrasjon (5 mL / brønn). Vi har konsekvent fått høy kvalitet og reproduserbare resultater med 10 mikrogram celle lysate, selv om det er mulig at forskjellige celle lysates eller beacon substrater kan diktere høyere eller lavere protein konsentrasjoner.
    1. Analyseverdiene komponentene i hver brønn er 15 mL BER reaksjon buffer, 5 mL beacon og 5 mL kjernefysisk lysate. Kjør hver beacon / lysate kombinasjonen i tre eksemplarer.
    2. Flere negative kontroller er nødvendig for hver beacon, inkludert prøver uten fyrtårn for eksempel 25 μ L av BER reaksjon buffer bare, og 20 mL BER reaksjon buffer med 5 mL lysate og 20 mL av BER reaksjon buffer med 5 mL av fyrtårn uten lysate.
    3. Flere kontrollprøver kreves for hver kjernefysisk lysate. Disse inkluderer en negativ kontroll [15 mL BER reaksjon buffer, 5 mL kontroll beacon (ingen lesjon) og 5 mL prøve lysate]. Vi foreslår også å omfatte eksperimentelle positive kontroller, for eksempel inkludering av THF inneholder beacons som etterligner abasic nettstedet inneholder oligos og er lett radert [15 mL BER reaksjon buffer, 5 mL THF fyrtårn og fem mL prøve lysate]. Selvfølgelig, vil den presise positive kontrollen avhenger generelle eksperimentell design.
  5. Som et eksempel, følge tabell 5 nedenfor for platen layout.
  6. Pipet i optiske rør eller plater mens på is eller kjølt stand til å minimere reaksjon innvielse før signal deteksjon.
  7. Pipet BER reaksjon buffer først inn alle brønnene.
  8. Det n Pipet fyrtårn i henhold til plate layout inn riktige brønner og alltid pipette lysates siste inn i brønnene for å minimere reaksjon innvielse før signal deteksjon.
  9. Seal rør eller plate grundig, bland og spinne med en sentrifuge for å samle løsninger til bunnen av rørene eller plate
  10. Sett plate til Qrt-PCR maskin og begynne analysen.
  11. Etter ferdigstillelse, eksportere rådata, fortrinnsvis i Excel-format. For StepOnePlus systemet bare de multi-komponent data er nødvendig. Denne inneholder alle fluorescens verdier ved flere leser sortert dye farge og godt.

4. Molekylær Beacon Assay Analysis

Vi brukte Microsoft Excel-programvare til å utføre disse analysene og beregninger. Vi anbefaler etablering av maler og makroer som vil tillate enkel og rask analyse og grafen viser basert på data hentet fra standard 96-brønnen formater.

4.1 Fjerning av bakgrunn

">
  • Bruke rå fluorescens verdiene fra multi-komponent data, først organisere dataene ved brønn / prøven. For StepOnePlus system dette kan oppnås ved å eksportere data "gjennom kolonner" resulterer i en Excel-fil med de radene viser individuell flere leser på de ulike sykluser for de ulike brønnene i kolonner.
  • For hver enkelt molekylær beacon, subtrahere bakgrunnsfluorescens verdier påvist i de negative kontrollene (20 mL av BER reaksjon buffer og 5 mL av beacon) fra fluorescens verdiene i hver syklus i alle brønner som bruker den molekylære fyrtårn. Dette fjerner de bakgrunnsfluorescens endringene ikke knyttet til lysate fra fremtidige analyse.
  • 4.2 Fl (Tmax) normalisering

    For å møte variasjonen i pipettering og fluorescens deteksjon i forskjellige brønner, normalisere vi dataene til maksimal fluorescens verdier (som korrelerer med beacon inngang).

    1. Beregne gjennomsnittlig fluorescens verdiene av sykluser på T max for den enkelte brønn: Fl (T max) (trinn 3.3aii).
    2. Beregn forholdstall Fl (syklus x) / Fl (T max) og multipliser med 100.. Under sannsynlig antagelse om at Fl (T max) tilsvarer den maksimale mulige fluorescens verdi når helt radert disse normaliserte dataene representerer% fri FAM (=% BER Stort snittsår beacon).
    3. Kombiner de tre eksemplarer prøvene ved gjennomsnitt dataene (% gratis FAM) av de 3 brønner for hver syklus (inntil syklus 180) og beregne feil på hver.
    4. Beregn ganger ved å multiplisere 20 sek til hver syklus.
    5. Siden den godt-til-brønn variansen i fluorescens deteksjon kan være betydelig, anbefaler vi å legge til et fluorescerende fargestoff som ROX til molekylære fyrtårn lager som fungerer som standard å etterjustere fluorescens verdier av de enkelte brønnene. I dette tilfellet ville ROX fargestoff brukes som en intern standard (passiv referanse) i hver enkelt brønn. ROXeksitasjon og emisjon spektra (eksitasjon - 588 nm, 608 nm utslipp) er forskjellig fra den 6-FAM dye ansatt i analysen (eksitasjon - 495 nm, utslipp - 520 nm). Den ROX fargestoff ville muliggjøre en normalisering skritt lik konvensjonelle RT-PCR prosedyrer som tillater normalisering av brønn-til-brønn forskjeller som kan oppstå på grunn av gjenstander. Disse kan skyldes pipettering feil eller kan stamme fra brønn-til-brønn variasjon i fluorescens deteksjon effektivitet.

    4.3 Plot

    1. Tomt normaliserte fluorescens data (% gratis FAM) mot tiden (i sekunder) i et spredningsdiagram med tilsvarende feil.
    2. Vi anbefaler å analysere reparasjon kinetikk i minst tre forskjellige kjernefysiske lysate forberedelsene representerer biologisk replikater. For å vurdere avvik, bør inter-eksperimentelle feil beregnes ut fra gjennomsnitt av hver enkelt eksperiment kan vises.
    3. En representant analyse av to tumorcellelinjer lysates: LN428, en gliomacellelinje med målbare nivåer av Methyl purine DNA glykosylase (MPG) og LN428/MPG, det samme celle linje konstruert for forhøyet uttrykk av MPG; begge cellelinjene har tilsvarende nivåer av AP endonuclease 1 (APE1) 1,2. Hver ble analysert for APE1 aktivitet og MPG aktivitet ved hjelp av BER THF Molecular Beacon (figur 3) og BER Hx Molecular Beacon (figur 4), hvor THF = tetrahydrofuran (substrat for APE1) og Hx = hypoxantin (substrat for MPG) . Merk: I figur 3 (THF substrat), resultatene fra de LN428/MPG lysates viser en lavere maksimal absolutt fluorescens i forhold til de LN428 lysates. Dette er resultatet av en lavere fyrtårn inngangsverdi som fastsettes ved Tmax verdier (se 3.3a). Når denne lavere verdi ble brukt til å normalisere resultatene, resulterer det i en stor endring i plottet. Dette illustrerer pent viktigheten av å normalisere dataene. Plotte absolutte fluorescens verdiene alene skulle tilsi det REPAir priser mellom LN428 og LN428/MPG cellene er forskjellige. Men når data er normalisert til å vurdere godt-til-brønn variabilitet, er APE1-mediert reparasjon rente forskjell vist seg å være minimal.

    5. Representative Resultater

    Vi beskriver en metode for kvantitativ, real-time måling av DNA glykosylase og AP endonuclease aktiviteter i celle kjernefysiske lysates med Base excision reparasjon (BER) molekylære fyrtårn (Figur 1). Når glødet, foreslår vi å utføre en smelte kurve analyse (tabell 1) som en kvalitetsvurdering av molekylær beacon (figur 2). Kjernefysiske lysates kan da være forberedt, bruke buffer komponenter er oppført i tabell 2. Dialyser den lysate i 0,5 L pre-kjølt dialyse buffer i 90 minutter ved 4 ° C med milde omrøring ved hjelp av en PIERCE Slide-A-Lyzer Dialyse kassett mot dialysen buffer oppført i tabell 3. Samledialyzed kjernefysisk protein løsning fra dialyse kassetten ved hjelp av en sprøyte. Bruk en annen pakning enn tidligere brukt til å injisere protein i dialyse kassetten. Bestem konsentrasjonen av dialyzed protein ved hjelp av standard protokoller. Eksempler på forventet kjernefysiske lysate konsentrasjoner er vist i tabell 4. Kjør reaksjonen som angitt ovenfor (trinn 3,4), ved hjelp av platen oppsettet som vist i tabell 5. En representant analyse av to tumorcellelinjer lysates: LN428, en glioma celle linje med målbare nivåer av Methyl purine DNA glykosylase (MPG) og LN428/MPG, det samme celle linje konstruert for forhøyet uttrykk av MPG; begge cellelinjene har tilsvarende nivåer av AP endonuclease 1 (APE1) 1,2. Hver ble analysert for APE1 aktivitet og MPG aktivitet ved hjelp av BER THF Molecular Beacon (figur 3) og BER Hx Molecular Beacon (figur 4), hvor THF = tetrahydrofuran (substrat for APE1) og Hx = hypoxantin(Et substrat for MPG). Til slutt, ved hjelp av en BER dU / A Molecular Beacon som rapporterer om uracil glykosylase aktivitet, viser vi at signalet eller signalstyrken er maksimal ved 10μg protein og reduseres til en usynlig nivå på 0,62 mikrogram protein (figur 5).

    Figur 1
    Figur 1. Samlet struktur BER Molecular Beacon. Vises er sekvensen og generell utforming av BER Molecular Beacons brukes her som en enkelt-strandet molekyl, etter annealing og igjen etter smelting. Den fet, kursiv delen av sekvensen er stammen (15 baser) og understreket delen av sekvensen er sløyfen (13 baser). FAM = 5 'fluorescerende fargestoff 6-Carboxyfluorescein [på 5'end; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, Extinction koeffisient (260 nm): 20 960; Extinction koeffisienten (ved absorbans maks): 75 000] og Dabcyl = den 3 'slukke middel Dab syl [på 3'end; Abmax = 453 nm, leskende Range = 425-520 nm] X = lesjonen (varierer avhengig av problemstilling) og Y = basen på motsatt side av lesjonen (varierer avhengig av problemstilling). .

    Figur 2
    Figur 2. Smelt Curve. En representant smelting kurve er vist for BER Molecular Beacon Control (A), og til den nye Molecular Beacons inneholder tetrahydrofuran (THF) moiety (B) eller hypoxantin (Hx) moiety (C). Oligonukleotid konsentrasjoner varierte fra 0 nM (mørk blå), 8 nM (rød), 16 nM (grønn), 32 nm (lilla), 64 NM Blue til 128 nM (oransje). Som beskrevet i trinn 1.3, ble glødet oligonucleotides oppvarmet fra 25 ° C til 95 ° C i 0,5 ° C intervaller og StepOnePlus systemet er programmert til å måle FAM fluorescens i hver 0,5 ° C intervall.

    innhold "> Figur 3
    Figur 3. Representative data ved hjelp av BER THF Molecular Beacon. AP endonuclease aktivitet spesifikk for hydrolyse av abasic nettstedet analoge tetrahydrofuran (THF) ble målt i kjernefysiske lysates fra kontroll cellelinje (LN428) og MPG over-uttrykk cellelinje (LN428/MPG) . Hver lysate ble analysert ved hjelp av enten BER Molecular Beacon Control (LN428, grønn, LN428/MPG, lilla) eller BER THF Molecular Beacon (LN428, blå, LN428/MPG, rød). Resultatene rapporteres som (A) var gjennomsnittlig fluorescens respons enheter og (B) de samme dataene normalisert til varden innspill som beskrevet i punkt 4 ovenfor (THF = tetrahydrofuran).

    Figur 4
    Figur 4. Representative data ved hjelp av BER Hx Molecular Beacon DNA glykosylase aktivitet spesifikk for fjerning av MPG underlaget hypoxanthine (Hx) ble målt i kjernefysiske lysates fra kontroll cellelinje (LN428) og MPG over-uttrykk cellelinje (LN428/MPG). Hver lysate ble analysert ved hjelp av enten BER Molecular Beacon Control (LN428, grønn, LN428/MPG, lilla) eller BER Hx Molecular Beacon (LN428, blå, LN428/MPG, rød). Resultatene rapporteres som (A) var gjennomsnittlig fluorescens respons enheter og (B) de samme dataene normalisert som beskrevet i punkt 4 ovenfor (Hx = hypoxantin).

    Figur 5
    Figur 5. Representative data ved hjelp av BER dU / T Molekylær Beacon på ulike protein nivåer. DNA glykosylase (UNG) aktivitet spesifikk for fjerning av uracil (DU / A) ble målt i kjernefysiske lysates fra T98G celler. Den T98G lysate ble analysert ved hjelp av enten BER Molecular Beacon kontroll eller BER dU / A Molekylær Beacon, på protein nivåer av 10, 5, 2.5, 1.25 eller 0.62 _g, som vist på figure. Resultatene er normaliserte data som beskrevet i punkt 4 ovenfor.

    Konsentrasjon av Beacon (nM) 0 8 16 32 64 128
    Molekylær Beacon fungerer løsning (200nm) lagt til (mL) 0 1 2 4 8 16
    BER reaksjon Buffer (w / o DTT) (mL) 25 24 23 21 17 9

    Tabell 1. Oppsett av en smelte kurve eksperiment.

    1 L Total Volum av stamløsningen nødvendig Con. på lager Solution Endelig Con.
    HEPES-KOH 25 ml 1M pH7.8 25 mm </ Td>
    KCl 75 ml 2 M 150 mm
    EDTA 1 mL 0.5M pH8.0 0,5 mm
    Glyserol 10 ml N / A 1%
    DTT (legg før bruk) 0,5 mL 1 M 0,5 mm
    H 2 O 888,5 mL N / A N / A

    Tabell 2. BER reaksjon buffer.

    1 L Total Volum av stamløsningen nødvendig Con. på lager Solution Endelig Con.
    HEPES-KOH 50 ml 1M pH7.5 50 mM
    KCl 50 ml 2 M 100 mm
    EDTA 1 mL 0.5M pH8.0 0,5 mm
    Glyserol 200 ml N / A 20%
    DTT (legg før bruk) 1 mL 1 M 1 mm
    H 2 O 698 ml N / A N / A

    Tabell 3. Dialyse buffer.

    Cellelinje Protein Konsentrasjon (mg / mL)
    LN428 5,34
    LN428/MPG 4,79

    Tabell 4. Protein Bestemmelse resultater.

    Negativ kontroll 25μL BER Buffer (Bakgrunn Control) 20μL BER Buffer
    5μL Con Beacon
    NO lysate
    (Test i tre eksemplarer) <br /> 15μL BER Buffer
    5μL Con Beacon
    5μL LN428 lysate
    (Test i tre eksemplarer)
    15μL BER Buffer
    5μL Con Beacon
    5μL LN428/MPG lysate
    Negativ kontroll 25μL BER Buffer (Bakgrunn Control) 20μL BER Buffer
    5μL THF Beacon
    NO lysate
    (Test i tre eksemplarer) 15μL BER Buffer
    5μL THF Beacon
    5μL LN428 lysate
    (Test i tre eksemplarer) 15μL BER Buffer
    5μL THF Beacon
    5μL LN428/MPG lysate
    Negativ kontroll
    20μL BER Buffer
    5μL lysate
    (Bakgrunn Control) 20μL BER Buffer
    5μL Hx Beacon
    NO lysate
    (Test i tre eksemplarer)
    15μL BER Buffer
    5μL Hx Beacon
    5μL LN428 lysate
    (Test i tre eksemplarer) 15μL BER Buffer
    5μL Hx Beacon
    5μL LN428/MPG Lysate
    Negativ kontroll
    20μL BER Buffer
    5μL lysate

    Tabell 5. Molekylær Beacon Assay satt opp.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Det er over 600 siteringer bruker begrepet "molekylære fyrtårn" for å påvise og kvantifisere mange molekyler og enzymatiske aktiviteter, inkludert helicase aktivitet 6, DNA polymerase aktivitet 7,8, DNA ligase aktivitet 9, telomerase aktivitet 10, DNA photolyase aktivitet 11 og DNA / RNA 12 hybrider, blant mange andre. I tillegg til bruk av molekylære signaler for måling av DNA-reparasjon som er oppført ovenfor, har vi og andre demonstrerte nytten av disse sonder for analyse av BER aktivitet 1,2,13-15.

    Den sanntid BER aktivitet analysen beskriver vi her har et enkelt modifisert base og åpner for kvantitativ vurdering av BER satser for ulike lesjoner eller endringer i basen på motsatt side av lesjonen. Søknader kan variere fra molekylære mekanistiske studier til hemmer skjermer. Vi viste BER spesifisitet ved å sammenligne LysaTES fra MPG uttrykke celler med ikke-uttrykke celler og mangel på aktivitet i kontrollen beacons. Den analysen er svært følsom, slik at påvisning av defekter i uttrykket for BER proteiner MPG 2 eller XRCC1 1 og er tilstrekkelig til å oppdage små forandringer i DNA-reparasjon kinetiske parametere og effekten av DNA-reparasjon hemmere [manuskript i forberedelse]. Flere leser gjennom aktiv reparasjonstiden støtte beregnet kinetiske priser og betydningen i eventuelle endringer i disse kinetiske priser. Den BER molekylære fyrtårn analysen er derfor egnet for høy gjennomstrømming studier til skjermen for DNA-reparasjon hemmere (hemmer skjermer) eller for studier på rollen individuelle kjernefysiske komponenter. Analysen av kjernefysiske lysates gjør vurderingen av DNA reparasjon i full sammenheng med BER kompleks dermed også viser indirekte forandringer eller påvirkninger på BER maskiner (f.eks post-oversettelse endringer eller mutasjoner).

    Detprotokollen, som beskrevet, bør gi svært reproduserbare og kvantitative resultater. Det er imidlertid flere detaljer å vurdere for å sikre riktig analyse: (1) Bakgrunn verdier av negative kontroller kan være for høyt: Dette kan skyldes dårlig lagring eller produksjon av Oligonucleotide. Høy bakgrunn verdier i lysates uten beacons indikere confounding auto fluorescens (dvs. ved forurensning eller cellulære uttrykk av eksogene fluorescerende proteiner). Dersom uttrykk for en fluorescerende protein er uunngåelig, kan eksitasjon / utslipp spektra for reporteren fargestoff og fluorescerende protein ikke overlapper, (2) Fl (Tmax) er lav: DNA konsentrasjon er annerledes enn gitt. Sjekk DNA konsentrasjon av spektrofotometri (OD 260 nm) for eksempel ved hjelp av Nanodrop. Høy DNA konsentrasjon med lav Fl (Tmax) indikerer en utilstrekkelig FAM belastning på beacons. HPLC rensing forhindrer kontaminering med umodifisert DNA (se ovenfor), (3) Reparasjon aktivitet er dårlig: Hvis FL (Tmax) verdier vedDe siste syklusene tyde tilstrekkelig fyrtårn innspill og fluorescens deteksjon, kan dette tyde på at den kjernefysiske ekstrakt forberedelse mislyktes. Nuclear ekstrakt kvalitet er avgjørende. Lave temperaturer må sikres gjennom hele prosedyren inkludert langtidslagring ved -80 ° C og (4) Reparasjon aktivitet kurver innlede med høye verdier: Selv svært kort eksponering av prøvene til romtemperatur før analyse initierer reparasjon. Oppbevares kjølig til enhver tid.

    Denne svært følsom og kvantitativ BER-analysen er også gjelder for analyse av renset proteiner, slik at studier på substratspesifisitet ved å endre den molekylære beacons tilsvarende. Endelig er analysen gjelder for analyse av svulsten og vev lysates, gir en mulighet til å måle funksjonelle DNA-reparasjon endepunkter som biomarkører for respons eller terapeutisk effekt, som vi har foreslått for å vurdere svulster for PARP1 hemmer potensering av alkylerende agenten Temozolomide to.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    RWS er ​​en vitenskapelig konsulent til Trevigen, Inc. Resten av forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Pittsburgh Foundation og National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629, ES019498] til RWS. Støtte for UPCI Lentiviral Facility ble gitt til RWS ved Cancer Center Support Grant fra National Institutes of Health [P30 CA047904]. Støtte ble også gitt av Universitetet i Pittsburgh Institutt for farmakologi og Chemical Biology til DS. Støtte ble også gitt av ESTRO til CV.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Potassium Chloride Fisher P217-500 Molecular grade
    EDTA Fisher BP120-500
    Glycerol Fisher BP229-1 Molecular grade
    DTT Fisher BP172-5
    HEPES- Solution Invitrogen 15630
    HEPES-Salt Sigma H4034-500G
    Potassium Hydroxide Sigma 17-8
    0.22μM filter Nalgene 167-0020
    Slide-A-Lyzer Dialysis Products Pierce 66373 MW 7000
    Syringe Fisher 309659
    Needle Fisher 305196
    1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Black
    15 mL Falcon Tubes Fisher 352097
    NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183
    PBS Invitrogen 14190
    Molecular Beacons IDT
    BioRad Protein assay dye reagent concentrate BioRad Cat# 500-0006

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
    2. Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
    3. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
    4. Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
    5. Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
    6. Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
    7. Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
    8. Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
    9. Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
    10. Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
    11. Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
    12. Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
    13. Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
    14. Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). (2009).
    15. Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
    Kvantitativ, Real-time analyse av Base Excision Reparasjon aktivitet i Cell lysates utnytte Lesjon-spesifikke Molecular Beacons
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).More

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter