Kvantitativ, Real-time analyse av Base Excision Reparasjon aktivitet i Cell lysates utnytte Lesjon-spesifikke Molecular Beacons
Summary
Vi beskriver en metode for kvantitativ, real-time måling av DNA glykosylase og AP endonuclease aktiviteter i celle kjernefysiske lysates. Analysen gir tallene for DNA Repair aktivitet mottagelig til kinetisk analyse og er tilpasningsdyktig for kvantifisering av DNA Repair aktivitet i vev og tumor lysates eller med rensede proteiner.
Abstract
Vi beskriver en metode for kvantitativ, real-time måling av DNA glykosylase og AP endonuclease aktiviteter i celle kjernefysiske lysates med Base excision reparasjon (BER) molekylære beacons. Underlaget (beacon) består av en deoxyoligonucleotide inneholder en enkelt base lesjon med en 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety konjugert til 5'end og en Dabcyl moiety konjugert til 3 'enden av oligonukleotid. Den BER molekylære fyrtårn er 43 baser i lengde og sekvensen er utformet for å fremme dannelsen av en stilk-sløyfe struktur med 13 nukleotider i loopen og 15 basepar i stammen 1,2. Når brettet i denne konfigurasjonen den 6-FAM moiety er slukket ved Dabcyl i en ikke-fluorescerende måte via Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4. Lesjonen er plassert slik at følgende basen lesjon fjerning og strand scission de resterende fem basen oligonukleotid inneholder 6-FAM moiety frigjøres fra stammen. Slipp ennd løsrivelse fra slukkeren (Dabcyl) resulterer i en økning av fluorescens som står i forhold til nivået av DNA-reparasjon. Ved å samle flere leser av fluorescens verdier, er sanntids vurdering av BER aktivitet mulig. Bruken av standard kvantitativ real-time PCR instrumenter tillater samtidig analyse av en rekke prøver. Utformingen av disse BER molekylære signaler, med en enkelt base lesjon, er mottagelig for kinetiske analyser, BER kvantifisering og hemmer validering og er tilpasningsdyktig for kvantifisering av DNA Repair aktivitet i vev og tumorcellelinjer lysates eller med renset proteiner. Analysen av BER aktivitet i tumor lysates eller vev aspirates bruker disse molekylære signaler kan være aktuelt å funksjonelle biomarkør målinger. Videre gir analysen av BER aktivitet med renset proteiner ved hjelp av denne kvantitative analysen en rask, high-throughput metode for oppdagelsen og validering av BER hemmere.
Protocol
Discussion
Det er over 600 siteringer bruker begrepet "molekylære fyrtårn" for å påvise og kvantifisere mange molekyler og enzymatiske aktiviteter, inkludert helicase aktivitet 6, DNA polymerase aktivitet 7,8, DNA ligase aktivitet 9, telomerase aktivitet 10, DNA photolyase aktivitet 11 og DNA / RNA 12 hybrider, blant mange andre. I tillegg til bruk av molekylære signaler for måling av DNA-reparasjon som er oppført ovenfor, har vi og andre demonstrer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Pittsburgh Foundation og National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629, ES019498] til RWS. Støtte for UPCI Lentiviral Facility ble gitt til RWS ved Cancer Center Support Grant fra National Institutes of Health [P30 CA047904]. Støtte ble også gitt av Universitetet i Pittsburgh Institutt for farmakologi og Chemical Biology til DS. Støtte ble også gitt av ESTRO til CV.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
