Мы опишем метод для количественного, в режиме реального времени измерения ДНК гликозилаза и AP эндонуклеазы деятельности в клетке ядерный лизатов. Анализ дает темпы ремонта ДНК деятельности поддаются кинетического анализа и адаптации для количественного определения ДНК ремонт деятельности в ткани опухоли и лизатов или очищенных белков.
Мы опишем метод для количественного, в режиме реального времени измерения ДНК гликозилаза и AP эндонуклеазы деятельности в клетке ядерный лизатов с использованием базовых репарации (BER) молекулярные маяки. Подложки (маяк) состоит из deoxyoligonucleotide содержащие один поражение базы с 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) часть сопряженных с 5'end и Dabcyl часть сопряженных с 3'-конца олигонуклеотида. Маяк BER молекулярной 43 баз в длину и последовательность призвана содействовать формированию стволовых петля структуру с 13 нуклеотидов в петле и 15 пар оснований в стебле 1,2. В сложенном состоянии в этой конфигурации 6-FAM фрагмента гасится по Dabcyl в не-люминесцентные образом через Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) 3,4. Поражение расположена так, что после удаления поражение базы и нить разрыва оставшиеся 5 базой олигонуклеотида, содержащего 6-FAM часть освобождается от стебля. Отпуститей отряд из тушителя (Dabcyl) приводит к увеличению флуоресценции, которая пропорциональна уровню репарации ДНК. Собрав несколько операций чтения флуоресценции значений в реальном времени, оценка деятельности BER возможно. Использование стандартных количественный ПЦР в реальном времени инструментов позволяет одновременного анализа многочисленных образцов. Дизайн этих BER молекулярной маяки, с одним поражением базы, поддается анализу кинетических, BER количественного и ингибитор проверки и адаптируется для количественного определения ДНК ремонт деятельности в ткани опухоли и клеточные лизаты или очищенных белков. Анализ деятельности BER в опухолевых тканях лизатов или всасывает с помощью этих молекулярной маяки могут быть применимы к функциональным измерения биомаркеров. Кроме того, анализ деятельности с BER очищенных белков с помощью этого количественного анализа обеспечивает быструю, высокую пропускную способность метода для обнаружения и проверки BER ингибиторов.
Есть более чем 600 цитат с помощью "молекулярного маяк" Срок для выявления и количественной оценки многочисленных молекул и ферментативную деятельность, включая деятельность геликазы 6, активность ДНК-полимеразы 7,8, ДНК-лигазы деятельности 9, активность теломераз?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами от Питтсбурга и Фонда Национальных Институтов Здоровья (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] для RWS. Поддержка UPCI лентивирусов фонда была оказана RWS по поддержке онкологического центра грант от Национального института здоровья [P30 CA047904]. Была также оказана поддержка в Университете Питтсбурга кафедра фармакологии и химической биологии для DS. Была также оказана поддержка по ESTRO к резюме.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
EDTA | Fisher | BP120-500 | |
Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
DTT | Fisher | BP172-5 | |
HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
Syringe | Fisher | 309659 | |
Needle | Fisher | 305196 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
PBS | Invitrogen | 14190 | |
Molecular Beacons | IDT | ||
BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |