Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Количественные, в режиме реального времени анализ базы активность репарации в клеточных лизатов Использование Поражение конкретные молекулярные маяки

doi: 10.3791/4168 Published: August 6, 2012

Summary

Мы опишем метод для количественного, в режиме реального времени измерения ДНК гликозилаза и AP эндонуклеазы деятельности в клетке ядерный лизатов. Анализ дает темпы ремонта ДНК деятельности поддаются кинетического анализа и адаптации для количественного определения ДНК ремонт деятельности в ткани опухоли и лизатов или очищенных белков.

Abstract

Мы опишем метод для количественного, в режиме реального времени измерения ДНК гликозилаза и AP эндонуклеазы деятельности в клетке ядерный лизатов с использованием базовых репарации (BER) молекулярные маяки. Подложки (маяк) состоит из deoxyoligonucleotide содержащие один поражение базы с 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) часть сопряженных с 5'end и Dabcyl часть сопряженных с 3'-конца олигонуклеотида. Маяк BER молекулярной 43 баз в длину и последовательность призвана содействовать формированию стволовых петля структуру с 13 нуклеотидов в петле и 15 пар оснований в стебле 1,2. В сложенном состоянии в этой конфигурации 6-FAM фрагмента гасится по Dabcyl в не-люминесцентные образом через Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) 3,4. Поражение расположена так, что после удаления поражение базы и нить разрыва оставшиеся 5 базой олигонуклеотида, содержащего 6-FAM часть освобождается от стебля. Отпуститей отряд из тушителя (Dabcyl) приводит к увеличению флуоресценции, которая пропорциональна уровню репарации ДНК. Собрав несколько операций чтения флуоресценции значений в реальном времени, оценка деятельности BER возможно. Использование стандартных количественный ПЦР в реальном времени инструментов позволяет одновременного анализа многочисленных образцов. Дизайн этих BER молекулярной маяки, с одним поражением базы, поддается анализу кинетических, BER количественного и ингибитор проверки и адаптируется для количественного определения ДНК ремонт деятельности в ткани опухоли и клеточные лизаты или очищенных белков. Анализ деятельности BER в опухолевых тканях лизатов или всасывает с помощью этих молекулярной маяки могут быть применимы к функциональным измерения биомаркеров. Кроме того, анализ деятельности с BER очищенных белков с помощью этого количественного анализа обеспечивает быструю, высокую пропускную способность метода для обнаружения и проверки BER ингибиторов.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Молекулярный дизайн Beacon

1,1 Проектирование и заказ ваш молекулярной маяк

Дизайн вашей молекулярной маяком должна учитывать следующее:

  1. У нас есть хорошие результаты с 43-Мер олигонуклеотидов ДНК. Содержание ГК должна быть> 32%. Исключить базе G на 5 'конце.
  2. Запрос 6-FAM (6-карбоксифлуоресцеина) сопряжения на 5 'конце и Dabcyl как 3' модификации.
  3. Положение поражения должны быть на базу № 6 от 5 'конца.
  4. Длина стебля или шпильки дуплекс должны быть не менее 15 б.п..
  5. Рекомендуемая длина цикла составляет 13 баз.
  6. Общая структура маяка, как показано на рисунке 1.
  7. После того, последовательность и поражения типа решается, олигонуклеотида можно заказать самые олигонуклеотидов компаний. Мы заказываем нашим олигонуклеотидов с IDT и запрос о том, что олигонуклеотиды ВЭЖХ очищенный и Providиздание в виде порошка или в сушеном виде.

1,2 Отжиг вашей молекулярной маяк

  1. Растворите лиофилизированный олигонуклеотидов ДНК в буфере разбавления Oligo (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА), чтобы дать концентрированный молекулярной маточного раствора Маяк 40 мкм.
  2. Подготовьте 200 нм молекулярной Маяк рабочего раствора из 40 мкМ молекулярной маточного раствора Маяк использованием буфера BER реакции (см. ниже). Добавить 200 нМ молекулярной Маяк рабочий раствор в стерильный черный 1,5 мл трубки.
  3. Инкубируйте пробирку, содержащую 200 нМ молекулярной Маяк рабочего раствора в большом стакане кипятка в течение 3 минут.
  4. Через 3 минуты, снимите стакан с источником тепла и инкубировать Молекулярные маяки в воде на ночь, чтобы способствовать отжига. Использование теплоизоляционных материалов и над и под стакан, чтобы замедлить процесс охлаждения.
  5. Алиготе маяки в стерильные, черный пробирки на 1,5 мл, 100 мкл в каждую пробирку.
  6. Хранить при температуре -30 ° C.

1.3 Качество оценки вашей молекулярной маяк

  1. Выполните расплава анализа кривых, чтобы подтвердить, что BER молекулярной маяки не светиться, пока с подогревом, для определения оптимальной температуры плавления и подтвердить, что каждый маяк высветится при нагревании.
  2. Для каждого маяка добавить указанный объем 200 нМ молекулярной Маяк рабочего раствора и буферной BER реакции, как указано в таблице 1, на 6 скважинах быстрый оптический 96-луночного планшета (Applied Biosystems, Cat # 4346906).
  3. С помощью ПЦР в реальном времени инструмент, как StepOnePlus (Applied Biosystems) или аналогичные системы для контроля FAM-краска возбуждения в расплаве анализ кривой.
  4. Программа вашего ПЦР в реальном времени прибор (StepOnePlus система) для контроля FAM возбуждение красителей в зависимости от повышения температуры с небольшим шагом для расплава анализа кривой. Система StepOnePlus запрограммирован для измерения FAM светитьсяNCE и рампы от 25 ° C до 95 ° C в течение 0,5 ° C интервалом. Типичная кривая расплава показано на рисунке 2.
  5. Мало или нет фоновой флуоресценции должны быть видны при температуре ниже 50 ° C. Проверьте форму и резкий рост флуоресценции, что свидетельствует о чистом и высоком качестве маяка. Tm значения около 60 ° C до 80 ° C являются благоприятными и должны быть равными для всех разведений.
  6. Определить Т макс, температура при максимальной флуоресценции [Fl (макс.)] значения, из этого анализа. Пропорциональности флуоресценции значений Т м и Т мах к маяку вход (концентрации) должна быть линейной. Флуоресценции значение при Т мах, Fl (макс.), должна превышать фоновые значения в 37 ° C по крайней мере в 5 раз.

2. Ядерная Подготовка лизата

2,1 базы репарации реакционного буфера 5 Подготовка

  1. Добавьте все компоненты, перечисленныеВ таблице 2 и довести объем буфера до 900 мл с DDH 2 O.
  2. Отрегулируйте рН до 7,8 использование гидроксид калия 8,0 N (Sigma, Cat # 17-8).
  3. Довести объем буфера до 1000 мл использованием DDH 2 O.
  4. Фильтр буфера, используя 0,22 мкм фильтр, Nalgene 1 л фильтр (кот # 167-0020).
  5. Добавить дитиотреитола (DTT) непосредственно перед использованием буфера BER реакции.

2,2 культуре клеток и изоляция

  1. Предлагается культуре клеток до 90-100% вырожденная. Изолировать клетки 4-6 блюд (150 мм), чтобы получить достаточный ядерный лизат для полного набора анализов (примерно 5 х 10 7 клеток общего числа).
  2. Рекомендуется подготовить 3 независимых культур на 3 независимых ячейки гранул для получения биологических повторяет для каждого анализа.
  3. Ядерная лизатов легко получить с помощью процедуры NucBuster изоляции (EMD Bioscience Cat Calbiochem # 71183-3) althух любого ядерного протокол изоляции бы целесообразно (см. ниже, раздел 2.3.).

2,3 ядерной подготовки лизат

  1. Перед началом, лиофилизированный коктейль ингибиторов протеаз (Calbiochem, Cat # 539131, набор 1) сначала ресуспендировали в 100 мкл стерильной воды для приготовления 100x акций. Используйте сразу или заморозить в аликвоты при -20 ° С для длительного хранения. Вычислить 1 мкл 100x акции на каждые 10 7 извлечь клетки, по мере необходимости.
  2. Все шаги в процессе добычи процедура должна быть выполнена на льду или при температуре 4 ° С для обеспечения стабильности белка.
  3. Этикетка 15 мл Сокол труб и место на льду.
  4. Удалите питательных сред из клеток и мыть два раза с 7,5 мл холодного PBS.
  5. Добавьте 5 мл холодного PBS для каждого блюда и царапанье клетки от пластины с помощью мобильного подъемника. Передача клеток охлажденной трубки 15 мл Falcon.
  6. Центрифуги на низкой скорости (500x г, 4 ° С) в течение 5 минут. Удаляют супернатанти оценить гематокрита в сравнении. (До 250 мкл гематокрита могут быть обработаны в едином 1,5 мл трубки)
  7. Центрифуга для еще 1 минуту при 500x г и удалить оставшиеся PBS с пипеткой. Ресуспендируйте осадок клеток в NucBuster Добыча Реагент 1 в зависимости от размера гематокрита: 150 мкл реагента Добыча NucBuster 1 раз в 50 мкл гематокрита. (Кроме того, осадок клеток может быть быстрой заморозки на сухой лед или жидкий азот и хранятся при температуре -80 ° C до готовности продолжить).
  8. После повторного взвешивания, передавать лизат в заранее охлажденный 1,5 мл трубки.
  9. Vortex 15 секунд на высокой скорости, инкубировать на льду в течение 5 минут, а вихрь снова 15 секунд на высокой скорости.
  10. Центрифуга при 13000 х г в течение 5 минут при 4 ° C.
  11. Супернатант содержит цитоплазматической фракции. Удалите и хранить при температуре -80 ° C или отказаться.
  12. Повторно приостанавливать осадок в смеси 1 мкл повторно приостановил 100x коктейль ингибиторов протеаз, 1-мщ л 100 DTT мм и 75 мкл реагента Добыча NucBuster 2 в 50 мкл гематокрита.
  13. Vortex 15 секунд на высокой скорости, инкубировать на льду в течение 5 минут, и снова вихрь 15 секунд на высокой скорости.
  14. Центрифуга при 13000 х г в течение 5 минут при 4 ° C. Супернатант содержит ядерных белков. Соберите супернатант и перейти к следующему шагу.

2,4 диализа, белок количественный и аликвоты

  1. Все действия во время диализа процедура должна быть выполнена с предварительно охлажденный решений, материалов и оборудования для обеспечения качества экстракта.
  2. Подготовить буфер диализа (1 л требуется в выборке), как указано в таблице 3. Важно: буфер должен быть холодным (4 ° С). Мы предлагаем подготовку по крайней мере за день до этого. Фильтр диализа буфера можно хранить при температуре 4 ° C до бесконечности, если DVB-T не был добавлен.
  3. Предварительное охлаждение стаканы (2 стакана 1 л в пробе), диализ буфера, диализ камерами, микро-центрифугатрубки, шприцы и иглы.
  4. Перед использовать - добавить 1 мл 1 М ДТТ на литр диализа буфера.
  5. Диализировать лизат подготовлен в шаге 2.3 в 0,5 л предварительно охлажденный диализа буфера в течение 90 минут при 4 ° С при осторожном перемешивании помощью слайд-A-анализатор, PIERCE диализа кассеты (0,5-3 мл диализа кассеты с 7000 отсечки МВт).
  6. Трансфер диализом кассету на второй стакан, содержащий 0,5 л предварительно охлажденный диализа буфера и диализировать лизата в течение 90 минут при 4 ° С при осторожном перемешивании.
  7. Соберите диализованной ядерной решение белка из диализа кассету с помощью шприца (Fisher, кот # 309659). Используйте различные прокладки, нежели раньше вводить белка в диализе кассету. Обратите внимание, что экстракт может выкристаллизовались в связи с высокой концентрацией белка. Попробуйте включить облачно ищет кристаллы при снятии ядерных диализованной белкового раствора.
  8. Алиготе образец микро-пробирок, 20 мкл. Быстрое замораживание сухим льдом и хранениемэлектронная при -80 ° C до использования.
  9. Определение концентрации белка диализа с использованием стандартных протоколов. Примеры ожидаемых ядерных концентраций лизат приведены в таблице 4.
  10. Наконец, лизаты должны быть оценены для контроля качества. Оценка лизатов будет зависеть от эксперимента. Как описано выше, мы обычно анализируем лизатов для выражения нескольких белков BER через 1,2 иммуноблота.
  11. Диализ шаг используется для единообразного решения реакции через клеточные линии, чтобы облегчить сравнение. Опуская диализа шаг может повлиять на цены и ферментативного кинетического анализа, так как растворы солей и условий реакции уже не идентичны в различных клеточных линиях и подготовки в связи с различными разведения требуется. Тем не менее, мы наблюдали, что при использовании лизатов более 5 мкг / мкл и добавления достаточного буфера реакция действительно позволяет бездействие диализа шаг (данные не представлены). Для й ингибитор исследованияв не требуют сравнения различных клеточные лизаты, диализ может не потребоваться. Тем не менее, мы рекомендуем диализа, как указано.

3. Анализ молекулярной Beacon

3,1 Требования к оборудованию

  1. Количественной ПЦР в реальном времени инструмент, такой как StepOnePlus QRT-PCR или сопоставимы, или 96-луночного планшета флуорометр способны обнаружить и измерить FAM флуоресценции в режиме реального времени. Примечание: Эта процедура применима к любой машине в состоянии прочитать флуоресценции значения маяки и записывать их в режиме реального времени. Машина должна, однако, позволяет пользователю получить доступ к сырой флуоресценции значения для анализа данных.
  2. Центрифуга совместимость с оптическими QRT-PCR труб или пластин используются.
  3. Microsoft Excel для анализа собранных данных.

3,2 Буферы и реагенты

  1. Оптический QRT-PCR труб или пластин с соответствующими крышками.
  2. BER реакционного буфера (см.Бове и таблицу 2).
  3. Диализу ядерный белок извлекается, подготовленный в шагах 2.3 и 2.4 и разбавляют до 2 мкг / мкл белка с BER реакции буфер, содержащий DTT.
  4. Молекулярные маяки разбавляют до 200 мкм буфером реакции BER для создания молекулярных маячков рабочего раствора (см. выше).

3,3 Анализ настройки (табл. 5)

  1. QRT-PCR машины обычно не используется в качестве флуориметра так перспективе метод должен быть изменен.
    1. Программы на первом этапе и установить температуру реакции до 37 ° C с циклом времени (моментов времени для измерений) от 20 секунд с минимум 180 циклов (или больше, в зависимости от конструкции анализ ремонт). Убедитесь, что для сбора данных в течение цикла. Таким образом, машина будет собирать данные каждые 20 секунд в общей сложности 1 час.
    2. Создайте второй этап, пандусы температуры Tmax конкретного маяк, температуры с максимальной флуоресценции, как удержатьдобываемого в шаге 1.3 (оценка качества вашей молекулярной маяк). Время цикла больше не будет 20 секунд в общей сложности 15 циклов. Это позволит собирать данные каждые 20 секунд в течение 5 минут при максимальной флуоресценции можно больше маяк. Флуоресценции значений, измеренных в течение циклов при Tmax используется для нормализации значений флуоресценции в каждой лунке (шаг 4.2a). При использовании нескольких маяков обязательно включать меры, которые предоставляют аналогичные повторяющиеся значения Tmax этих маяков, а также.
    3. Установить реакционном объеме 25 мкл.
  2. Настройку плиты на QRT-PCR машины с помощью программного обеспечения Applied Biosystems в. Мы заинтересованы только в сыром флуоресценции значения, поэтому выберите "Standard Curve" - ​​эксперимент типа.
  3. Заполните пластины макета. Пример приведен в таблице 5. Ничего не добавляют в лунки выбрана в качестве стандартной кривой.

3,4 Выполнить анализ

  1. Чертенокortant: Использование предварительно охлажденный материал и решения. Хранить в прохладном месте до выполнения и обнаружения.
  2. Добавить соответствующее количество DTT в буфер BER реакции, которые будут использоваться.
  3. Разбавить раствор белка в концентрации 2 мкг / мкл использованием BER реакционного буфера (с DVB-T).
  4. Для начальных экспериментов мы предлагаем использовать 10 мкг диализованной ядерной лизата на скважину (5 мкл / лунку) и 1 пмоль подложки, молекулярные маяк на 40 нм конечной концентрации (5 мкл / лунку). Мы последовательно получить высокое качество и воспроизводимые результаты с 10 мкг клеточного лизата, хотя вполне возможно, что различные клеточные лизаты или маяк подложки могут диктовать более высокие или более низкие концентрации белка.
    1. Анализ компонентов в каждую лунку в 15 мкл буфера реакции BER, 5 мкл маяк и 5 мкл ядерной лизат. Запуск каждого маяка / лизат сочетание в трех экземплярах.
    2. Несколько отрицательных контролей, необходимых для каждого маяка, в том числе образцы без маяка например, 25 иму, л BER реакционного буфера только, и 20 мкл буфера реакции BER с 5 мкл лизата и 20 мкл реакционного буфера BER с 5 мкл маяк без лизата.
    3. Несколько контрольных образцов, необходимых для каждой ядерной лизат. Они включают в себя отрицательный контроль [15 мкл буфера реакции BER, 5 мкл маяк контроль (без поражений) и 5 ​​мкл лизата образца]. Мы также предлагаем включить экспериментальный положительные элементы управления, такие как включение ТГФ содержащие маяки, которые имитируют abasic сайт, содержащий олиго и легко врезанные [15 мкл буфера реакции BER, 5 мкл маяк ТГФ и 5 мкл лизата образца]. Конечно, точный положительного контроля будет зависеть от общей эксперимента.
  5. В качестве примера, приведены в табл 5 ниже пластины макета.
  6. Внесите в оптических труб или пластин в то время как на льду или охлажденного позиции, чтобы минимизировать реакцию начала до сигнала.
  7. Внесите BER реакцию сначала в буфер все скважины.
  8. маяков я пипеткой по пластине расположение в правильном скважин и всегда пипетки лизаты последний в скважины, чтобы минимизировать инициирования реакции до сигнала.
  9. Печать трубы или пластины тщательно перемешать и спина с центрифугой собрать решения в нижней части трубы или пластины
  10. Вставьте пластину в QRT-PCR машину и начать анализ.
  11. После завершения экспорта необработанных данных, предпочтительно в формате Excel. Для того чтобы система StepOnePlus только многокомпонентных данных не требуется. Она содержит все флуоресценции значений в несколько читает отсортированные по цвету краситель и хорошо.

4. Молекулярный анализ Анализ Beacon

Мы использовали Microsoft Excel программного обеспечения для выполнения этих анализов и расчетов. Мы рекомендуем создание шаблонов и макросов, которые позволят легко и быстро анализа и график дисплеев на основе данных, полученных от стандартного 96-луночного формата.

4,1 удаления фона

">
  • Использование сырья флуоресценции значения из многокомпонентных данных, в первую организации данных и / образца. Для StepOnePlus системы это может быть достигнуто путем экспорта данных "по столбцам" в результате файл Excel со строками отображения отдельных считывание несколько раз на различных циклов для различных скважин в столбцах.
  • Для каждого отдельного молекулярного маяк, вычитания фона флуоресценции значения обнаружены в отрицательной контрольной группы (20 мкл буфера реакции BER и 5 мкл маяк) по флуоресценции значений в каждом цикле во всех скважин с использованием, что молекулярные маяк. Это избавляет от фоновой флуоресценции изменения не связаны с лизат из последующего анализа.
  • 4,2 Fl (Tmax) нормализация

    Для решения этой изменчивости пипетирования и флуоресценции обнаружения в разных скважинах, мы нормализации данных в максимальной флуоресценции значений (которые коррелируют с маяком на входе).

    1. Расчет средней величины флуоресценции циклов при Т макс для отдельных людей, так: Fl мах) (шаг 3.3aii).
    2. Рассчитайте соотношение Fl (цикл х) / FL мах) и умножить на 100. Под вероятно предположение, что Fl мах) соответствует максимально возможное значение флуоресценции при полном надрезанные, эти данные представляют собой нормированную% свободного FAM (=% BER врезанных маяк).
    3. Объединение трех образцов путем усреднения данных (% свободного FAM) из 3-х скважин для каждого цикла (цикл до 180) и рассчитать ошибки на каждом.
    4. Рассчитать раз умножая 20 секунд, чтобы на каждом цикле.
    5. Так как обеспеченные и разница в флуоресценции обнаружения могут быть значительными, мы рекомендуем добавить флуоресцентного красителя, таких как ROX на молекулярном акции маяком, который служит в качестве стандарта подрегулировать флуоресценции значения отдельных скважин. В этом случае красителя ROX будет использоваться в качестве внутреннего стандарта (пассивный ссылка) в каждом отдельном хорошо. ROXспектры возбуждения и излучения (возбуждения - 588 нм, излучение 608 нм) отличается от 6-FAM краситель, занятых в анализе (возбуждения - 495 нм, эмиссия - 520 нм). Красителя ROX позволит нормализации шаг похож на обычный ПЦР-процедур, что позволяет нормализации обеспеченных и различия, которые могут возникнуть в связи с артефактами. Это может быть результатом ошибки или пипетки может исходить от обеспеченных и изменение флуоресценции обнаружения.

    Участок 4,3

    1. Участок нормированной флуоресценции данных (% свободного FAM) от времени (в секундах) в точечной диаграммы с соответствующей ошибки.
    2. Мы рекомендуем анализа кинетики ремонт, по крайней мере три различных ядерных приготовлений лизат представляющих биологическую повторяет. Для оценки отклонения, в частности, экспериментальные ошибки рассчитывается как среднее арифметическое каждого эксперимента должны быть показаны.
    3. Представитель анализ двух опухоли клеточные лизаты: LN428, глиомыклеточные линии с неопределяемого уровня метил пуриновых ДНК гликозилаза (МПГ) и LN428/MPG, те же линии клеток разработан для повышенной экспрессии MPG, обе клеточные линии имеют эквивалентные уровни AP эндонуклеазы 1 (APE1) 1,2. Каждый были исследованы для APE1 деятельности и деятельности с использованием MPG BER ​​ТГФ молекулярной Beacon (рис. 3) и BER Hx молекулярной Beacon (рис. 4), где THF = тетрагидрофуран (субстрат для APE1) и Нх = гипоксантин (субстрат для MPG) . Примечание: На рисунке 3 (ТГФ подложки), результаты LN428/MPG лизатов показывают более низкую максимальную абсолютную флуоресценции по сравнению с LN428 лизатов. Это является результатом более низкого значения, как маяк вход определяется с помощью Tmax значений (см. 3.3а). При этом меньшее значение было использовано для нормализации результатов, это приводит к значительным изменениям в сюжете. Это хорошо иллюстрирует важность нормализации данных. Построение абсолютных значений флуоресценции только хотел бы предложить репал ставки между LN428 и LN428/MPG клеток различны. Однако, когда данные нормализованы рассмотреть обеспеченных и изменчивости, APE1 опосредованной ремонт курсовой разницы Показано, что минимальные.

    5. Представитель Результаты

    Мы опишем метод для количественного, в режиме реального времени измерения ДНК гликозилаза и AP эндонуклеазы деятельности в клетке ядерный лизатов с использованием базовых репарации (BER) молекулярные маяки (рис. 1). После отжигали, рекомендуется выполнить анализ кривой расплава (табл. 1), а оценка качества вашего молекулярной маяк (рис. 2). Ядерная лизатов может быть подготовленными, с помощью буфера компоненты, перечисленные в таблице 2. Диализировать лизат в 0,5 л предварительно охлажденный диализа буфера в течение 90 минут при 4 ° С при осторожном перемешивании помощью диализа PIERCE Слайд-A-анализатор, кассета с диализом буфера приведены в таблице 3. Собирайтедиализованной ядерной решение белка из диализа кассету с помощью шприца. Используйте различные прокладки, нежели раньше вводить белка в диализе кассету. Определение концентрации белка диализа с использованием стандартных протоколов. Примеры ожидаемых ядерных концентраций лизат приведены в таблице 4. Запуск реакции, как указано выше (шаг 3.4), используя расположение пластин, как показано в таблице 5. Представитель анализ двух опухоли клеточные лизаты: LN428, линии глиомы ячейки с неопределяемого уровня метил пуриновых ДНК гликозилаза (МПГ) и LN428/MPG, те же линии клеток разработан для повышенной экспрессии MPG, обе клеточные линии имеют эквивалентные уровни AP эндонуклеазы 1 (APE1) 1,2. Каждый были исследованы для APE1 деятельности и деятельности с использованием MPG BER ​​ТГФ молекулярной Beacon (рис. 3) и BER Hx молекулярной Beacon (рис. 4), где THF = тетрагидрофуран (субстрат для APE1) и Нх = гипоксантин(Субстрат для MPG). Наконец, используя BER DU / Молекулярная Beacon, что доклады о деятельности гликозилаза урацил, мы покажем, что выходной сигнал или сигнала максимальна при 10 мкг белка и снижается до неопределяемого уровня на 0,62 мкг белка (рис. 5).

    Рисунок 1
    Рисунок 1. Общая структура BER молекулярной Beacon. Показана последовательность и общий дизайн BER Молекулярные маяки используется здесь как одноцепочечной молекулы, после отжига и снова после плавления. Жирный, курсив часть последовательности ствола (15 баз), а также подчеркнул, часть последовательности цикла (13 баз). FAM = 5 'флуоресцентный краситель 6-карбоксифлуоресцеина [по 5'end; Abmax = 495 нм, Emmax = 520 нм, коэффициента экстинкции (260 нм): 20960; коэффициента экстинкции (при абсорбции макс.): 75 000] и Dabcyl = 3 'тушителя Dab цилиндра [по 3'; Abmax = 453 нм, тушение Range = 425-520 нм] X = поражения (варьируется в зависимости от исследования вопроса) и Y = база напротив поражения (варьируется в зависимости от исследования вопроса). .

    Рисунок 2
    Рисунок 2. Растопить Curve. Представитель кривой плавления показано BER молекулярной управления Beacon (А), и BER Молекулярные маяки содержащие тетрагидрофурана (ТГФ) часть (B) или гипоксантин (Hx) часть (С). Олигонуклеотидов концентрации в диапазоне от 0 нм (синий), 8 нм (красный), 16 нм (зеленый), 32 нм (фиолетовый), 64 нм голубой до 128 нм (оранжевый). Как описано в шаге 1.3, отожженных олигонуклеотиды нагревается от 25 ° C до 95 ° C в течение 0,5 ° C интервалов и система StepOnePlus запрограммирован для измерения FAM флуоресценции в каждом интервале 0,5 ° C.

    Содержание "> Рисунок 3
    Рисунок 3. Представитель данных, используя BER ТГФ молекулярной Beacon. AP эндонуклеазы деятельности, специфичные для гидролиза сайт abasic аналоговых тетрагидрофурана (ТГФ) измерялось в ядерных лизатов от линии контроля ячейки (LN428) и MPG на выражение клеточной линии (LN428/MPG) . Каждый лизат анализировали с помощью либо BER молекулярной управления Beacon (LN428, зеленый, LN428/MPG, фиолетовый) или BER ТГФ молекулярной Beacon (LN428, синий, LN428/MPG, красный). Результаты представлены в виде () среднее единицах флуоресценции реагирования и (б) те же данные нормированы на маяк вход, как это описано в разделе 4 (THF = тетрагидрофуран).

    Рисунок 4
    Рисунок 4. Представитель данных, используя BER Hx молекулярной Маяк ДНК гликозилаза деятельность специфична для удаления MPG подложки чypoxanthine (Hx) измерялось в ядерных лизатов от линии контроля ячейки (LN428) и MPG на выражение клеточной линии (LN428/MPG). Каждый лизат анализировали с помощью либо BER молекулярной управления Beacon (LN428, зеленый, LN428/MPG, фиолетовый) или BER Hx молекулярной Beacon (LN428, синий, LN428/MPG, красный). Результаты представлены в виде () среднее единицах флуоресценции реагирования и (б) те же данные нормированы, как описано в разделе 4 (Hx = гипоксантин).

    Рисунок 5
    Рисунок 5. Представитель данных, используя BER DU / Молекулярная Маяк на различных уровнях белка. ДНК гликозилаза (УНГ) деятельность специфична для удаления урацил (DU /) измерялось в ядерных лизатов от T98G клеток. Лизат T98G были проанализированы с использованием либо BER молекулярной управления Beacon или BER DU / Молекулярная Beacon, на уровни белка 10, 5, 2,5, 1,25 или 0,62 мкг, как указано в еigure. Результаты нормализованные данные, как описано в разделе 4.

    Концентрация Beacon (нм) 0 8 16 32 64 128
    Молекулярная Маяк рабочего раствора (200 нм) Добавлено (мкл) 0 1 2 4 8 16
    BER реакции Buffer (без DVB-T) (мкл) 25 24 23 21 17 9

    Таблица 1. Схема эксперимента расплава кривой.

    Всего 1 л Объем исходного раствора необходимо Con. Решение на месте Окончательный Con.
    HEPES-КОН 25 мл 1M pH7.8 25 мМ </ TD>
    KCl 75 мл 2 M 150 мм
    ЭДТА 1 мл 0,5 м pH8.0 0,5 мМ
    Глицерин 10 мл N / A 1%
    DTT (добавить перед употреблением) 0,5 мл 1 M 0,5 мМ
    H 2 O 888,5 мл N / A N / A

    Таблица 2. BER реакции буфера.

    Всего 1 л Объем исходного раствора необходимо Con. Решение на месте Окончательный Con.
    HEPES-КОН 50 мл 1M pH7.5 50 мМ
    KCl 50 мл 2 M 100 мМ
    ЭДТА 1 мл 0,5 м pH8.0 0,5 мМ
    Глицерин 200 мл N / A 20%
    DTT (добавить перед употреблением) 1 мл 1 M 1 мМ
    H 2 O 698 мл N / A N / A

    Таблица 3. Диализ буфера.

    Сотовые линии Концентрация белка (мкг / мкл)
    LN428 5,34
    LN428/MPG 4,79

    Таблица 4. Результаты определения белка.

    Отрицательный контроль 25 мкл буфера BER (История Control) 20 мкл буфера BER
    5 мкл Con Beacon
    НЕТ лизат
    (Тест в трех экземплярах) <бр /> 15μL BER буфер
    5 мкл Con Beacon
    5 мкл лизата LN428
    (Тест в трех экземплярах)
    15μL BER буфер
    5 мкл Con Beacon
    5 мкл LN428/MPG лизата
    Отрицательный контроль 25 мкл буфера BER (История Control) 20 мкл буфера BER
    5 мкл ТГФ Beacon
    НЕТ лизат
    (Тест в трех экземплярах) 15μL BER буфер
    5 мкл ТГФ Beacon
    5 мкл лизата LN428
    (Тест в трех экземплярах) 15μL BER буфер
    5 мкл ТГФ Beacon
    5 мкл LN428/MPG лизата
    Отрицательный контроль
    20 мкл буфера BER
    5 мкл лизата
    (История Control) 20 мкл буфера BER
    5 мкл Hx Beacon
    НЕТ лизат
    (Тест в трех экземплярах)
    15μL BER буфер
    5 мкл Hx Beacon
    5 мкл лизата LN428
    (Тест в трех экземплярах) 15μL BER буфер
    5 мкл Hx Beacon
    5 мкл Ли LN428/MPGнасыщать
    Отрицательный контроль
    20 мкл буфера BER
    5 мкл лизата

    Таблица 5. Анализ молекулярной Маяк настройки.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Есть более чем 600 цитат с помощью "молекулярного маяк" Срок для выявления и количественной оценки многочисленных молекул и ферментативную деятельность, включая деятельность геликазы 6, активность ДНК-полимеразы 7,8, ДНК-лигазы деятельности 9, активность теломеразы 10, ДНК фотолиазы деятельности 11 и ДНК / РНК, гибридов 12 и многие другие. В дополнение к использованию молекулярных маяков для измерения репарации ДНК видов деятельности, перечисленных выше, и другие продемонстрировали полезность этих зондов для анализа BER деятельности 1,2,13-15.

    В режиме реального времени BER тест деятельность мы описываем здесь объединяет одно изменение базы и позволяет количественно оценить BER тарифы для различных повреждений или изменений в базу напротив поражения. Приложения могут варьироваться от молекулярной механистические исследования, ингибитор экранов. Мы показали, BER специфику по сравнению ЛысаяTES из MPG экспрессирующие клетки с не-экспрессирующие клетки и отсутствие активности в контрольных маячков. Анализ обладает высокой чувствительностью, что позволяет обнаружения дефектов в выражении MPG BER ​​белками 2 или XRCC1 1 и достаточно, чтобы обнаружить незначительные изменения в репарации ДНК кинетические параметры и эффективность ингибиторов репарации ДНК [рукопись в подготовке]. Несколько читает всей активной поддержке время ремонта рассчитывается кинетическая ставок и значение в любых изменений в эти кинетической ставки. BER молекулярного анализа маяк поэтому подходит для высокой пропускной способности исследования для выявления репарации ДНК фермента (ингибиторы экранов) или для изучения роли отдельных компонентов ядерного. Анализ ядерной лизатов позволяет оценить репарации ДНК в полном контексте BER комплекс, следовательно, также изображающие косвенного изменения и влияние на технику BER (например, после перевода изменения или мутации).

    Протокол, как описано выше, должно дать высокую воспроизводимость и количественных результатов. Однако, есть некоторые детали, чтобы рассмотреть для обеспечения надлежащего анализа: (1) Фоновые значения отрицательного контроля может быть слишком высокой: это может быть связано с плохим хранением или производства олигонуклеотидов. Высокие значения фона в лизатах без маяки показывают смешанные флуоресценции авто (т.е. в результате загрязнения или сотовой выражение экзогенных флуоресцентных белков). Если выражение флуоресцентного белка неизбежно, возбуждение / спектры излучения красителя журналиста и флуоресцентных белков не могут пересекаться, (2) Fl (Tmax) низкая: концентрация ДНК отличается от данной. Проверьте концентрацию ДНК спектрофотометрически (ОП 260 нм), например, с помощью Nanodrop. Высокие концентрации ДНК с низким Fl (Tmax) указывает на недостаточную загрузку FAM по маякам. HPLC очистки предотвращает загрязнение немодифицированные ДНК (см. выше), (3) Ремонт деятельности бедных: Если Fl (Tmax) значенийпоследние циклы показывают достаточный входной маяк и флуоресценции обнаружения, это может свидетельствовать о том, что ядерная подготовки экстракт не удалось. Ядерная качество экстракта имеет решающее значение. Низкие температуры должны быть уверены в течение всей процедуры, включая длительное хранение при температуре -80 ° C (4) кривые Ремонт деятельность начала с высокими значениями: Даже очень короткие экспозиции образцов до комнатной температуры перед анализом инициирует ремонта. Хранить в прохладном месте в любое время.

    Это очень чувствительный и количественного анализа BER также применяется для анализа очищенных белков, что позволяет исследования субстратной специфичности, изменяя молекулярную маяков соответственно. Наконец, анализ применим для анализа опухолей и тканей лизатов, что дает возможность измерить функциональные конечные точки восстановления ДНК в качестве биомаркеров ответа или терапевтической эффективности, как мы предложили для оценки опухоли для PARP1 ингибитор потенцирование алкилирующих агентов темозоломида 2.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    RWS является научный консультант Trevigen, Inc остальные авторы заявляют, что нет конфликта интересов.

    Acknowledgments

    Эта работа была поддержана грантами от Питтсбурга и Фонда Национальных Институтов Здоровья (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] для RWS. Поддержка UPCI лентивирусов фонда была оказана RWS по поддержке онкологического центра грант от Национального института здоровья [P30 CA047904]. Была также оказана поддержка в Университете Питтсбурга кафедра фармакологии и химической биологии для DS. Была также оказана поддержка по ESTRO к резюме.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Potassium Chloride Fisher P217-500 Molecular grade
    EDTA Fisher BP120-500
    Glycerol Fisher BP229-1 Molecular grade
    DTT Fisher BP172-5
    HEPES- Solution Invitrogen 15630
    HEPES-Salt Sigma H4034-500G
    Potassium Hydroxide Sigma 17-8
    0.22μM filter Nalgene 167-0020
    Slide-A-Lyzer Dialysis Products Pierce 66373 MW 7000
    Syringe Fisher 309659
    Needle Fisher 305196
    1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Black
    15 mL Falcon Tubes Fisher 352097
    NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183
    PBS Invitrogen 14190
    Molecular Beacons IDT
    BioRad Protein assay dye reagent concentrate BioRad Cat# 500-0006

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
    2. Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
    3. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
    4. Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
    5. Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
    6. Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
    7. Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
    8. Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
    9. Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
    10. Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
    11. Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
    12. Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
    13. Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
    14. Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). (2009).
    15. Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
    Количественные, в режиме реального времени анализ базы активность репарации в клеточных лизатов Использование Поражение конкретные молекулярные маяки
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).More

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter