Summary
Qui descriviamo un romanzo ad alto contenuto di test infiammazione indotta chimicamente finalizzate alla individuazione di immuno-modulatori bioattivi. Abbiamo unito con successo la microscopia automatizzata con software sviluppati script personalizzati che consentano la quantificazione automatizzata della risposta infiammatoria, nonché ulteriore elaborazione dati, analisi, estrazione e stoccaggio.
Abstract
Zebrafish larve sono particolarmente suscettibili a intero animale piccola molecola 1,2 schermi a causa della loro piccola dimensione e la relativa facilità di manipolazione e di osservazione, così come il fatto che i composti possono essere semplicemente aggiunto all'acqua di balneazione e sono facilmente assorbito quando somministrato in un <soluzione di DMSO 1%. A causa della chiarezza ottica di larve zebrafish e la disponibilità di linee transgeniche esprimenti proteine fluorescenti in leucociti, zebrafish offrono il vantaggio unico di monitoraggio una risposta infiammatoria acuta in vivo. Di conseguenza, utilizzando il pesce zebra ad alto contenuto di schermi di piccole molecole volte all'individuazione di immuno-modulatori composti con alto rendimento è stato proposto 3-6, suggerendo scenari induzione infiammazione esempio scalfitture localizzate nel tessuto pinna, danni laser diretto alla superficie di tuorlo 7 embrioni o amputazione tailfin 3,5,6. Lo svantaggio principale di questi metodi, tuttavia, erail requisito di manipolazione manuale larva per indurre ferite, impedendo così elevata throughput screening. Introduzione della infiammazione indotta chimicamente (Chin) test 8 eliminati questi ostacoli. Dal momento che è ferita inflitta chimicamente il numero di embrioni che possono essere trattate allo stesso tempo è praticamente illimitata. Trattamento temporaneo di larve di zebrafish con solfato di rame induce selettivamente morte delle cellule in cellule ciliate del sistema della linea laterale e si traduce in un rapido reclutamento di granulociti neuromasti feriti. La risposta infiammatoria può essere seguita in tempo reale utilizzando composto transgenica cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 6,9 larve zebrafish che esprimono una proteina verde fluorescente in cellule neuromast, nonché un fluorescente rosso granulociti etichettatura proteine.
Al fine di elaborare una strategia di screening che consentisse entrambe le analisi ad alta contenuti e high-throughput abbiamo introdotto robotizzato di gestione dei liquidi e MICR combinata automaticaoscopy con uno script personalizzato software sviluppato. Questo script consente una quantificazione automatica della risposta infiammatoria segnando l'area occupata dalla percentuale rossi leucociti fluorescenti all'interno di un'area definita empiricamente circostante lese neuromasti fluorescenti verdi. Inoltre, il trattamento automatizzato dei dati, la gestione, la visualizzazione e archiviazione tutti basati su MATLAB e personalizzato sviluppato gli script Python.
In breve, si introduce un sistema automatico HC / HT schermata che permette la sperimentazione di composti chimici per il loro effetto sulle inizio, la progressione o la risoluzione di una risposta infiammatoria granulocitica. Questo protocollo serve un buon punto di partenza per ulteriori analisi approfondite dei meccanismi di droga e le vie coinvolte nella orchestrazione di una risposta immunitaria innata. In futuro, possono contribuire ad identificare intollerabili effetti tossici o off-target a fasi precedenti della scoperta di nuovi farmaci e quindi ridurre i rischi ei costi procedurali per lo sviluppo di farmaci.
Protocol
1. Animal Handling
Per il saggio Chin uso 3 larve dpf derivante da accoppiamenti di gruppo tra omozigote doppio transgenico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 e AB (wild-type) i pesci. Raccogliere embrioni di riproduzione naturale e sollevarle a 29 ° C in terreno E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 0,1% e blu di metilene, equilibrata a pH 7,0) in piastre di Petri. È essenziale mantenere una densità di embrioni non superiore a 50-70 per piastra.
2. Larva Ordinamento
Controllare tutte le larve sotto uno stereoscopio a fluorescenza per l'espressione reporter fluorescente, infiammazione spontanea e lo sviluppo appropriato all'età correlati.
3. Screening Preparazione Medium (Preparare sempre fresco)
Preparare un mezzo E3 senza il blu di metilene integrato con DMSO (1% finale) e MS222 (0,05 g / l).
4. CuSO4Preparazione (Preparare sempre fresco)
Prima pesare CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) e preparare una soluzione stock 20 mM in dH 2 O. Preparare 120 pM CuSO 4 soluzione di lavoro (da 20 mM soluzione stock) in E3/DMSO (1%) / MS-222. Proteggere CuSO 4 soluzione dalla luce.
5. 384 ben Preparazione Plate (Greiner 384 Well Microplate)
Pre-aggiungono 20 pl di E3/DMSO (1%) / MS-222 ad ogni pozzetto con una pipetta inversa. Un aumento della punta di pipetta foro è necessario per gestire gli embrioni con cura senza infliggere alcun ferimento, questo viene fatto tagliando la punta ad un foro mm 2. Trasferimento larva singolo in 74 microlitri di terreno ad ogni pozzetto (84 microlitri per controllo non trattato). Se necessario, larve orientare in una posizione laterale all'interno del pozzetto usando un flessibile Eppendorf Microloader punta di pipetta (Eppendorf, 5242 956,003).
Condurre tutte le seguenti fasi di manipolazione dei liquidi con un liquido robotgestione workstation per garantire un trattamento simultaneo di tutte le larve.
6. Drug Treatment
Mescolare composti in lamiera di droga magazzino 5 volte pipettando su e giù. Aggiungere 16 microlitri di piastra 7.5x magazzino della droga in ciascun pozzetto e mescolare 5 volte. Regolare la posizione della punta all'interno dei pozzetti per evitare lesioni delle larve ed erogare il mezzo a 10 pl / s. Mescolare mezzo in pozzetti 4 volte per garantire una distribuzione omogenea del farmaco all'interno del pozzo.
7. Incubazione
Incubare la piastra di screening per 1 ora a 29 ° C coperto con un foglio di alluminio per proteggere i composti così come CuSO 4 dalla luce.
8. Chemical Ferimento
Aggiungere 10 pl di 120 pM CuSO 4 soluzione di lavoro a ciascun pozzetto tranne controlli negativi, mix 4 volte e incubare ancora per 1 ora a 29 ° C.
9. Lavaggio
Rimuovere e scambiare 80 microlitri di me dium da ogni ben due volte (con incrementi di 20 pl) per rimuovere i composti e CuSO 4.
10. Acquisizione di immagini
Avviare l'acquisizione delle immagini su un microscopio invertito automatico (ad esempio: Olympus scan ^ R) 90 minuti dopo il trattamento iniziale di rame. Set iniziale di z-livello in modo che neuromasti da destra e sinistra la linea laterale posteriore sono visibili. Immagine ciascun bene una volta ogni ora nella brightfield canali, Cy3 e GFP in 4 piani focali (distanza di 50 micron) con un obiettivo 4x (NA = 0,13).
Ulteriori informazioni su elaborazione di immagini e dati sono disponibili su richiesta.
11. Image Processing
1. Ordinamento dei dati
Le immagini Raw vengono elaborate con il nostro script personalizzato software LabView. La prima operazione della pipeline di elaborazione dell'immagine è l'ordinamento di immagini crude dalla cartella microscopio generato dal canale dati, e ben time-point informazioni.
ove_step "> 2. messa a fuoco estesaSuccessivamente, il software crea immagini sfuocate estesa da 4 piani focali per ciascuno dei canali.
3. RGB-overlay
In un ultima fase di messa a fuoco delle immagini estese dai 3 canali sono uniti per portare in una finale RGB-sovrapposizione di immagini.
4. Neuromast rilevamento automatico
Uno strumento di pattern recognition (LabView IA strumento di prototipazione rapida) identifica neuromasti all'interno delle immagini sovrapposte degli RGB e crea un'area empiricamente definito di interesse intorno alle neuromasti.
5. Quantificazione
All'interno dell'area empiricamente definito di interesse che circonda neuromasti feriti rosse fluorescenti (leucociti riflessa come pixel rossi) sono segnati con un conseguente lettura primaria di p ercent uno o ragione ccupied da eukocytes l (Paol). In media 95,27 ± 2,11% (FDA1) e di 95,12 ±1,56% (FDA2) di pozzetti (larve) sono stati rilevati correttamente e sono stati successivamente sottoposti a ulteriore elaborazione dei dati. L'uscita dei dati grezzi (Paol per ogni neuromast rilevato) è memorizzato in un file txt e serve come ingresso dati per gli script MATLAB che elaborano i dati grezzi ulteriormente.
12. Elaborazione dei dati
1. Imaps
Valutare il successo di esperimenti individuali attraverso la visualizzazione grafica del greggio Paol dati in uscita un codice di colore può essere realizzato con le cosiddette carte infiammazione (imaps) (Figura 2). Verde brillante riflette un alto indice infiammatoria iniziale, nero indica l'assenza di infiammazione. Questa breve panoramica permette l'identificazione rapida di esperimenti falliti, che possono poi essere esclusi da ulteriori analisi dei dati.
2. Media dei controlli
Ogni piastra sperimentale contiene 320 composti che riflettono unadati singoli composti e punto per punto temporale nonché 32 controlli positivi e negativi, rispettivamente. Il controllo 32 replica viene calcolata la media e la deviazione standard viene calcolata. Per i controlli solo i punti dati entro 2 deviazioni standard sono inclusi.
3. Normalizzazione
La normalizzazione viene effettuata per analisi foglio di calcolo. Il valore medio di DMSO, essendo il controllo negativo, è impostato a 0 e la massima Paol mediata per il controllo rame è impostato su 1, in modo che la differenza massima tra il controllo positivo e negativo è impostato su 1. Paol Ogni mescola è interpolati o estrapolati linearmente ai rispettivi controlli sulla piastra sperimentale.
4. Finale read-out: indice infiammatorio
Dopo gli esperimenti replicati sufficienti (cioè 15) sono stati condotti, normalizzati i dati grezzi provenienti da esperimenti replicati viene calcolata la media, risultando in un finale di read-out - il infiammatoriaindice. L'indice iniziale infiammatoria del controllo rame inizia al 100% per tempo-punto zero e correlato al tempo di inizio acquisizione di immagini (90 minuti dopo il trattamento iniziale di rame).
5. Monotona raccordo regressione esponenziale
A causa di risoluzione della risposta infiammatoria nel corso del tempo si esegue una monotona raccordo esponenziale di regressione lineare verso l'infiammazione iniziale utilizzando 
- Uno 0 è una misura per la risposta iniziale all'istante t = 0, a 1 è legato alla pendenza della grandezza nel tempo.
6. 2-D spazio grafico funzione (figura 4)
Per generare lo spazio funzionalità, non-regressione lineare viene applicato a grappolo analisi divide lo spazio in funzione regioni caratteristici, consentendo così l'identificazione automatizzata di candidati interessanti da diversi immuno-modulatori categorie (anti-inflammatORY, anti-risoluzione, pro-infiammatori, pro-risoluzione). Tutti i composti sono visualizzati in 2-D trama in base ai parametri a 0 e 1.
13. Gestione dei dati e archiviazione
I nostri dati routine di gestione creare pagine web di visualizzare e rappresentare tali schermi di droga che forniscono una rapida panoramica dell'immagine e di elaborazione dei dati dei risultati passi ', così come una visione dettagliata, quando richiesto dall'utente 10. Soft link ad altri pertinenti basi di dati eterogenee biologici e chimici sono integrati, nonché per fornire una preziosa risorsa per gli studi comparativi e romanzo 11. Con queste routine, adeguati standard di dati e metainformazione sono fissati per la conservazione a lungo termine di questi dati.
14. Risultati rappresentativi
In uno schermo pilota abbiamo analizzato una libreria composta da 640 approvati dalla FDA noti composti bioattivi per gli effetti sui inizio, la progressione o la risoluzione di Granulocytic risposta infiammatoria. Sulla base degli effetti osservati abbiamo classificato 4 tipi di fenotipi modulatori del sistema immunitario che possono essere indicativi di diversi modi di azione: anti-infiammatori (1), anti-risoluzione (2), pro-infiammatorie (3) e pro-risoluzione (4) , che può essere descritto con i parametri di uno 0 e un 1, che derivano da un monotona non lineare raccordo regressione (AO e + ALX -) verso l'infiammazione iniziale. A 0 rappresenta la grandezza della risposta infiammatoria, mentre un 1 caratterizza la pendenza della curva e quindi descrive risoluzione infiammazione. Visualizzazione tutti i composti in un 2-D plot funzione spazio (a 1 vs uno 0) permette l'identificazione automatica di candidati colpiti dalle diverse categorie modulatori del sistema immunitario (Figura 3).
45 su 640 composti esercitata significativo effetto anti-infiammatorio, riducendo l'indice infiammatoria iniziale al 50% o meno. All'interno di this categoria abbiamo trovato 6 composti appartenenti alla classe farmacologica della non-steroidei anti-infiammatori non steroidei (FANS), confermando la validità del nostro approccio. Tuttavia, i FANS non classificato tra i più potenti farmaci anti-infiammatori. Oltre ai FANS abbiamo trovato diverse classi farmacologiche farmaci aggiuntivi come ad esempio bloccanti del recettore dell'angiotensina (ARB), antibiotici e inibitori della pompa protonica.
7 composti soddisfatto i criteri di soglia definiti empiricamente per potenziali farmaci pro-risoluzione.
18 farmaci esercitato un effetto pro-infiammatorio, con conseguente esagerata reclutamento dei leucociti al neuromasti feriti rispetto ai controlli positivi.
Solo 2 composti impedito tempestiva risoluzione della risposta infiammatoria.
L'effetto anti-infiammatorio dei candidati colpito diversi (i candidati esemplari provenienti da classi di farmaci di cui sopra farmacologiche) dalla coul schermo pilotad essere confermato in un modo dipendente dalla dose in successive saggi Chin secondari (dati non mostrati). Ripetizione di 4 potenziali pro-farmaci risoluzione non ha confermato la modalità indicata di azione esercitata nella schermata principale. 2 dei farmaci hanno un leggero anti-infiammatorie a concentrazioni più elevate (20 pM). Un terzo farmaco esibito una marginale non-dose-dipendente effetto antinfiammatorio a concentrazioni comprese farmaco 5-20 pM. Il farmaco quarto aveva alcun effetto sulla risposta infiammatoria alle concentrazioni testate.
Figura 1. Workflow del saggio Chin. Individuale compound transgenico cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larve (3 dpf) sono distribuite manualmente in piastre da 384 pozzetti microtiter. I farmaci sono aggiunti contemporaneamente per ogni pozzetto usando un Compact Zephyr Workstation di gestione dei liquidi. Piastre di saggio vengono poi incubate per 1 ora a 29 ° C. Il trattamento con CuSO 4
Figura 2. . Panoramica foto di immagini RAW La figura mostra le immagini crude di 4 piani focali (Z = 0 - 3) a distanza di 50 pm di canali Cy3 (a sinistra) e GFP (a destra), rispettivamente. Frecce (Z = 1,2) indicano neuromasti esemplari, punte di freccia (Z = 1,2) punto a leucociti raggruppate intorno neuromasti.
Figura 3. Mappe infiammazione (imaps) Il successo degli esperimenti individuali possono essere valutati in imaps che riflettono la risposta infiammatoria (dati grezzi) in un codice colore: verde brillante riflette un iniziale elevata inflazione risposta mmatory, nero indica l'assenza di infiammazione imaps a timepoint 0 (a sinistra) e time-punto 5 (a destra) mostrano chiaramente se un esperimento dovrebbe essere inclusa nella ulteriore elaborazione dei dati.. Controlli di rame (riga 13 e 24) mostrano in diverse tonalità di verde, mentre DMSO pozzetti di controllo (riga 1 e 12) appaiono in verde scuro o nero. Al momento-punto 5, l'infiammazione è quasi risolto nei controlli di rame, ora indicata in tonalità di verde scuro o nero. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. 2-D trama caratteristica spazio 320 di composti di uno approvato dalla FDA libreria e rispettivi controlli. Tutti i pozzetti composti possono essere visualizzati in un 2-D trama funzione spazio sulla base dei parametri di uno 0 e 1, derivanti da un non-lineare regressione raccordo (d/4203/4203eq1.jpg "alt =" Equazione 1 "/>) verso l'infiammazione iniziale. Questa trama spazio caratteristica permette l'identificazione automatizzata di candidati interessanti appartenenti ad uno dei seguenti 4 immuno-modulatori categorie che possono essere indicativi dei farmaci 'modalità d'azione:. anti-infiammatorio (1), anti-risoluzione (2), pro-infiammatorie (3) e pro-risoluzione (4) Clicca qui per ingrandire la figura .
Discussion
Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethyl sulphoxide | Carl Roth GmbH Co KG | A994.2 | |
| Copper(II) sulphate anhydrous | Carl Roth GmbH Co KG | PO23.1 | |
| FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| 384 microwell plate Non-binding, μClear | Greiner | 781906 | black |
| Olympus scan^R | Olympus | ||
| Zephyr Compact Liquid Handling Workstation | Caliper |
References
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