Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-til-struktur Bestemmelse af Influenza Polymerase PB2 Subunit

Summary

Struktur-baserede drug design spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​lægemidler. Fortsat flere mål parallelt øger chancen for succes for bly opdagelse. Følgende artikel belyser, hvordan Seattle Strukturel Genomics Center for smitsomme sygdomme benytter en multi-target metode til gen-til-struktur bestemmelse af PB2 influenza A underenhed.

Abstract

Pandemic udbrud af stærkt virulente influenzastammer kan forårsage omfattende sygelighed og dødelighed i befolkningsgrupper over hele verden. I USA alene, er et gennemsnit af 41.400 dødsfald og 1.860.000 indlæggelser forårsaget af influenza-virus-infektion hvert år ^1. Punktmutationer i polymerase basisk protein 2 underenhed (PB2) har været knyttet til tilpasningen af virusinfektion hos mennesker ^2. Resultaterne fra sådanne undersøgelser har afsløret den biologiske betydning PB2 som en virulensfaktor, hvilket understreger dens potentiale som et antiviralt lægemiddel mål.

Den strukturelle genomforskning program lagt frem af Det Nationale Institut for Allergi og Smitsomme Sygdomme (NIAID) yder støtte til Emerald Bio og tre andre Pacific Northwest institutioner, der tilsammen udgør Seattle Strukturel Genomics Center for smitsomme sygdomme (SSGCID). Den SSGCID er dedikeret til at levere det videnskabelige samfund med three-dimensionelle proteinstrukturer NIAID kategori AC patogener. Realiseringen strukturel information til rådighed for det videnskabelige samfund tjener til at accelerere struktur-baserede drug design.

Struktur-baserede drug design spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​lægemidler. Fortsat flere mål parallelt øger chancen for succes for nye lead opdagelse ved at målrette en sti eller en hel protein familien. Emerald Bio har udviklet en high-throughput, multi-target parallel behandling rørledning (MTPP) for gen-til-strukturen besluttet på at støtte konsortiet. Her beskriver vi de protokoller, der anvendes til at bestemme strukturen af ​​PB2 underenheden fra fire forskellige influenza A stammer.

Protocol

En oversigt af protokollen er vist i Figur 1..

Molekylær Biologi

1.. Construct Design

Brug Gene Composer software til at designe protein konstruere og codon manipuleret syntetiske gensekvenser. Brugen af Gene Composer software er blevet tilbudt i detaljer andetsteds ^3..

1. Brug Justering Viewer modulet og Construct design Modul at sammenligne protein alignments og definere protein konstruktion. Juster mål aminosyresekvens til både den primære og 3D strukturelle elementer fra homologer i protein data bank (PDB), hvis den er tilgængelig (figur 2).
2. Brug tilpasningen oplysninger til at foretage struktur-styrede konstruere designs ved at vælge nye termini baseret på bevarelse af den primære struktur og 3D strukturer homologer.
3. Design insert PCR (IPCR) og vektor-PCR (vPCR) amplimere (klemme primere).
4. Brug Gene Composer s protein-til-DNA-algoritme, back-oversætte konstruktionen aminosyresekvens i codon manipuleret nukleinsyresekvens.
5. Brug den korrekte kodonanvendelse tabel (CUT) for at optimere sekvens til ekspression i E. coli.
6. Stort set klone insertet i pET28 vektor modificeret til at inkorporere en N-terminal 6x histidinmærke og Smt3/SUMO fusionsprotein der giver mulighed for nem oprensning.
7. Placer syntetisk gen ordre med DNA 2.0 og bestille primere fra integrerede DNA Technologies.

2.. Polymerase Ufuldstændig primerforlængelse (PIPE) Kloning

1. Forbered Primere og gener
   1. Centrifuger producents plader indeholdende primere ved 1.000 rpm i 1 min.
   2. Bring primerkoncentration til 100 uM og der tilsættes 50 ul TE buffer.
   3. Fortynd primere til 10 uM med deioniseret (DI) vand i en 96-brønds V-bundplade.
   4. Centrifuger producents gen i en 1,5 ml rør ved 1.300 rpm i 1 min.
   5. I 1,5 ml rør, gør fortyndinger af hver primer til 10 ng / ul.
   6. Store primere og gener ved -20 ° C, når de ikke er i brug.
2. Forbered Indsæt PCR (IPCR)
   1. Optø et hætteglas Pfu Master Mix på is, holde gener og grundere ved stuetemperatur.
   2. Opret en pladediagram tildele brønde til et sæt primere og konstruere.
   3. Tilføj 13 pi af DI vand i hver brønd af en 96-brønds PCR-plade.
   4. Tilsættes 5 ul fremad og 5 pi af revers primer til hver reaktion i 96-brønds plade ifølge pladediagram, sikrer at ændre tip mellem hver brønd.
   5. Tilsæt 2 ul af hver fuld længde genet til dens korrekte godt efter pladen kortet.
   6. Tilsæt 25 gl Pfu masterblandingen hver brønd, sikrer at ændre tip mellem hver brønd.
   7. Cycle reaktionerne ved hjælp af følgende PCR-forhold:
      1. 95 ° C 2 min 95 ° C 30 sek
      2. 50 ° C 45 sek
      3. 68 ° C 3 min
      4. 4 ° C ∞
   8. Gentag trin bd i 25 cyklusser.
   9. Overfør 10 ul af hver IPCR reaktion på en ny 96-brønds PCR-plade.
   10. Tilføj 3 ul 6X belastning farvestof til hver prøve.
   11. Adskil hver prøve på en 1% TAE EtBr agarosegel ved 110 V ved siden af ​​en 100-500 bps DNA stigen at bekræfte fragment forstærkning.
   12. Opbevar IPCR produkt ved -20 ° C, når de ikke er i brug (undgå fryse tø så meget som muligt).

3.. Forbered Vector PCR (vPCR)

1. Start overnight kultur af transformeret E. coli med pET28 vektorplasmid.
   1. Podes to 5 ml rør af 2-YT bouillon med 50 ug / ml kanamycin.
   2. Grow kulturer natten over ved 37 ° C i ryster ved 220 rpm.
2. Spin ned kulturer efter vækst natten ved centrifugering ved 3.000 rpm i 15 min.
3. Brug en Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit at udvinde pET28 vektor fra bakterielle pellets i henhold til producentens anvisninger.
4. Setup restriktionsenzymfordøjelser af ekstraheret pET28 plasmid.
   1. Tilføj 2.2 pi 10X BamHI-buffer og 1 pi BamHI og HindIII til 20 ul pET28 vektor.
   2. Inkuber reaktion i 1 time ved 37 ° C.
5. Separat fordøjelse produkt på en gel.
   1. Der henvises til trin 2.2.10.
   2. Skær vektor band fra gel og rense det ved hjælp af QIAquick gelekstraktionskit henhold til producentens anvisninger.
6. Ved hjælp af en NanoDrop, kvantificere DNA koncentration.
7. Fortynd skåret vektor og 10 ng / ul. Opbevar ved -20 ° C, når den ikke er i brug.
8. Forbered vPCR primere.
   1. Centrifuge IDT leverede oligonucliotides i 1 min ved 1.300 rpm.
   2. Bring koncentrationen til 100 uM med DI vand.
   3. Forbered 10 uM fortynding af både frem og bak primere i en 1,5 ml rør.
   4. Store primere og primer fortyndinger ved -20 ° C.
9. Tø Pfu Master Mix på is og tø skabelon og primere ved stuetemperatur.
10. Setup vPCR reaktioner i en 96-brønds PCR-plade:
    1. I første række på en 96-brønds plade kombinerer 60 ul af både frem og bak vPCR primere og 24 pi fordøjet pET28 skabelon (10 ng / ul).
    2. Med en 12-spids multikanalpipette, 12 ul af primer og template masterblandingen overføre til hver resterende godt af pladen. Dette burde resultere i 12 pi af primer og template stamblandingen i hver brønd i pladen.
    3. Tilføj 13 pi af DI vand til hver brønd.
    4. Tilsæt 25 gl Pfu Master Mix til hver brønd.
11. Cycle reaktionerne gennem PCR betingelser, der anvendes i trin 2.2.7.
12. Pool alle de vPCR reaktioner i en 15 ml Falcon rør.
13. Kontroller fragment forstærkning ved at adskille 10 pi pooled PCR-produkt på en gel (forventet længde spaltet pET28 vektorer cirka 6 kb).
    1. Der henvises til trin 2.2.10.
14. Forbered fusionere plader.
    1. Alikvot 3 pi vPCR produkt i hver brønd i en 96-brønds V-bundplade.
    2. Opbevar plader på -20 ° C, indtil fusionerer med IPCR produkt.

4.. Flet IPCR og vPCR Products

1. Tø IPCR produkter og præ-alikvoter vPCR 96-brønds fusionere plade ved stuetemperatur.
2. Tilføj 3 ul af hvert IPCR produkt til sin respektive brønd sammenfletningen pladen.
3. Omdan fusionere plade i Top Ti kemisk kompetente celler.
4. Tilsæt 2 ul af hver merge reaktion i en enkelt 50 gl tube producents kemisk kompetente celler og fortsætte med producentens medfølgende protokol.
5. Forbered overnatskulturer for hver konstruktion fra transformation plade.
6. Alikvot 5 ml TB bouillon (med 50 ug / ml kanamycin) fra en 25 ml steril beholder i hver brønd i en dyb brønd blok.
7. Brug Sterile teknik, vælge en isoleret koloni fra hver transformation plade og pode den relevante brønd i dybe brønd blok.
8. Dæk blokken med en Airpore dæksel.
9. Ryst blok ved 220 rpm ved 37 ° C natten over.
10. Pellet celler ved centrifugering blokken i 30 minutter ved 4.000 omdrejninger pr.
11. Hæld supernatanten og dup toppen af ​​blokken tørt med en papirserviet.
12. Mini-prep anvendelse af en Qiagen 96-brønds vakuum apparatet ifølge producentens anvisninger.

5.. Forberedelse Glycerol Lagre af succesfuldt Klonede Constructs

1. Transformering held klonede sekvens valideret DNA i BL21 (DE3) kemisk kompetente celler ifølge producentens anvisninger.
2. For hver konstruktion, vælge en enkelt isoleret koloni fra BL21 (DE3) transformation og podes i 1 ml 2-YT-bouillon (med 50 ug / ml kanamycin).
3. Ryste kulturer ved 220 rpm i 3-4 timer ved 37 ° C.
4. Mærke et 1,5 mlrør med skruelåg med den unikke konstruktion identifikationsnummer, cellestamme og dato. Tilsæt 500 ml 50% glycerol og 500 pi af cellekultur og vend adskillige gange. Øjeblikkelig lagring glycerol lager på tøris eller i en -80 ° C fryser.

6.. Expression Testing

Lysis Buffe r	Wash Buffer	Elution Buffer
50 mM NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM NaCI 10 mM Imidazol 1% Tween 20 2 mM MgCl2 0,1 gl / ml Benzonase 1 mg / ml lysozym	50 mM NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM NaCI 20 mM Imidazol 0,05% Tween 20	25 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCI 250 mM Imidazol 0,05% Tween 20

* Add Benzonase, lysozym,og proteaseinhibitor umiddelbart før lysering.

1. Streak en prøve fra glycerol lager på kanamycin selektiv agar og inkuberes natten over ved 37 ° C.
2. Start et ikke-inducerende præ-kultur i en 96-brønds rundbundet blok, podes 1,2 ml TB bouillon (med 50 mg / ml kanamycin) suppleret med 0,5% glucose med en frisk dyrket E. coli isolere. Grow overnight ryster ved 220 rpm ved 37 ° C.
3. Efter vækst natten, begynde induktion kulturer ved at pode 1,2 ml TB bouillon (med 50 mg / ml kanamycin) suppleret med Novagen Natekspressen System 1 (ifølge producentens protokol) med 40 ul af præ-kultur.
4. Grow de små induktion kulturer ved 20 ° C i 48 timer, ryster ved 220 rpm.
5. Harvest celler ved centrifugering ved 4.000 rpm i 15 min, hæld supernatanten og opbevares ved -20 ° C i mindst 1 time inden behandling.
6. I 96-brønds blok, resuspender cellepellets i 300 pi lysisbuffer. Cellerne inkuberes i lysepuffer ved stuetemperatur i 30 min efterfulgt af mekanisk lysering ved kraftig rystning i 30 minutter ved stuetemperatur.
7. Præcisere rålysat ved centrifugering i 30 minutter ved 4.000 rpm ved 4 ° C.
8. Brug en multikanals pipette til at overføre 200 pi af den klarede lysat (opløselig fraktion) til en 96-brønds fladbundet bakke (Qiagen). For hver brønd indeholdende en prøven, tilsættes 40 ul Ni-NTA magnetiske perler (Qiagen).
9. Ryst forsigtigt pladen på en rocker i 1 time ved 16 ° C.
10. Placer pladen på et magnetisk indlæg plade (Qiagen) og fjern ubundne fraktion. Pas på ikke pipetteres nogen af ​​de Ni-NTA-perler.
11. Tag pladen fra posten pladen og forsigtigt resuspenderet perlerne i 200 pi vaskebuffer. Pipetteres op og ned i 30 sekunder og derefter placere pladen tilbage på posten plade.
12. Fjern vaskebufferen og gentag trin 6.12.
13. Fjern pladen fra post plade og elueres Ni-NTA bundet target protein ved vask med 50 ul elueringspuffer i 5 min.
14. Returnere flad bundplade til magnetisk indlæg plade og overføre elueringen til en frisk 96-brønds V-bundplade.
15. Overfør 20 ul af elueringen til en frisk 96-brønds V-bundplade og reagere med 1 pi ULP1 protease.
16. Ifølge producentens protokol, det eluerede og elueret + Ulp1 fraktionen analysere ved kapillarelektroforese hjælp af en LabChip 90.
17. Alternativt kan alle fraktioner fra udtrykket test analyseres via SDS-PAGE.

7.. Large Scale Fermentering

1. Brug en steril pipettespids at opnå en skraber fra et glycerol-bestand, pode 100 ml TB bouillon (med 50 mg / ml kanamycin) og vokse natten over. Ryst ved 220 rpm og 37 ° C.
2. Efter vækst natten, udvide præ-kultur ved inokulering 1 L TB bouillon med EMD autoinduktionen opløsninger (se producentens protokol) (med 50 mg / ml kanamycin) i en 2 L forvirret kolbe med 10 ml afpræ-kultur (1:100 fortynding).
3. Ryst de udvidede 1 L kulturer ved 37 ° C, ændre temperaturen af rysteinkubator til 20 ° C, når en optisk densitet på 0,6 _(OD600) er nået.
4. Efter vækst natten, tage en repræsentativ 10 ml alikvot fra hver konstruktion til ekspression test.
5. Høst cellepasta ved centrifugering ved 5.000 rpm i 15 min og kassér supernatanten.
6. Freeze cellepasta ved -80 ° C.

Proteinoprensning

Buffere:

Lysis Buffer	Buffer A (Ligevægtsindstilling)	Buffer B (eluering)	Dimensionering Column Buffer
25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCI 0,5% glycerol 0,02% CHAPS 10 mM Imidazol 1 mM TCEP 50 mM arginin 5 pi Benzonase 100 mg Lysozym 3 proteasehæmmer Tabletter (EDTA-fri)	25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCI 10 mM Imidazol 1 mM TCEP 50 mM arginin 0,25% glycerol	25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCI 200 mM Imidazol 1 mM TCEP	25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCI 1% glycerol 1 mM TCEP

* Tilføj Benzonase, lysozym og proteasehæmmere tabletter til hver 150 ml prøve umiddelbart før lysering.

8.. Cellelyse

1. Gør 2 L lysisbuffer, ikke tilføje lysozym, proteasehæmmere tabletter eller benzonase (hver prøve vil blive lyseret separat i 150 ml lysisbuffer).
2. Thaw og resuspender celle indsætte lysis buffer ved en 1:5 masse: volumen-forholdet ved kraftig omrøring i 30 min ved 4 ° C. Break bidder løs fra siderne af bægerglasset med en ren spatel. I løbet af denne periode forberede Ni og dialysis Buffere
3. På is, lysere cellerne ved hjælp af en Misonix sonikator (70% effekt, 2 sek on / 1 sek off pulser for 3 min), og hvirvl forsigtigt container for at undgå overophedning. Gem et lille (200 ul) portion af rålysat til fremtidig analyse.
4. Tydeliggøre rålysat ved centrifugering ved 18.000 xg i 35 min ved 4 ° C, indsamle supernatanten og gemme en lille (200 ul) portion til fremtidig analyse. Opbevares pellet ved 4 ° C, indtil det bekræftes proteinet er blevet lyseret i den opløselige fraktion.

9.. Pre-run Protein Maker Setup

1. Med proteinet maker tændt og softwaren åbne initialisere instrumentet.
2. Når initialiseret, vedhæfte et 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF Nikkel-chelat søjle (Ni søjle) på en separat linje i gantry for hver af prøverne.
3. Kør 3-4 søjlevolumener (CV) ækvilibreringspuffer gennem hver kolonne.
4. Prime ækvilibrering og elueringspuffer linjer.
5. Equilibrspiste kolonnerne ved sugning buffer A gennem kolonnen gang.

10.. Nikkel 1 (NI1) Kolonne

1. Vask hver kolonne med 20 ml Milli-Q vand for at fjerne storage buffer. Løb 5 ml buffer B og 25 ml buffer A for ligevægt.
2. Læg den klaret lysat indeholdende opløst protein i kolonnerne med en hastighed på 2 ml / min følg derefter med en 15 ml vask med buffer A.
3. Eluere bundne protein i en trinvis gradient med buffere A og B ved følgende forhold ærbødigt: 5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Saml hver elueringsfraktion separat.
4. Analyser: eluerede fraktioner, rålysat, afklaret lysate og gennemstrømning ved SDS-PAGE. Pool fraktioner indeholdende protein og bruge en NanoDrop at måle _A280 til omtrent bestemme mængden af protein til stede.

11.. ULP1 Spaltning

1. Hold en lille portion (250 ul) af NI1 kolonne pulje til efterfølgende gelanalyse. Bringe restenaf NI1 pulje til 10 ml og tilsættes ubiquitin-lignende protease 1 (ULP1) ved 1 gl / 5 mg totalt protein for at fjerne His-SMT affinitetsmærke.
2. Dialysere NI1 pool + ULP1 mod 2 liter puffer A i 4 timer ved 4 ° C i en 10 kDa molekylvægt (MWCO) på en røre plade ved 4 ° C.
3. Efter dialyse kørt SDS-PAGE af NI1 pool og NI1 pool + ULP1 at afgøre, om ULP1 spaltning var vellykket.

12.. Nikkel 2 (Ni2) Kolonne

1. Load kløvet protein i samme Ni kolonnen og gentag trin 9.3 på en reduceret strømningshastighed på 1 ml / min. Det spaltede off tag vil binde til søjlen, og Tagless målprotein vil nu strømme-igennem. Saml gennemstrømningen i en frisk beholder.
2. Vask Ni kolonne med 3 ml buffer A efterfulgt af 5 ml buffer B til eluering al Hans-mærket og uspecifikt bundet protein. Saml hver fraktion separat.
3. Kør SDS-PAGE af Ni2 gennemstrømning, vaske og Ni2 elueringsfraktionerne at verificere ULP1 spaltning og at PRotein er til stede i gennemløbet. Brug en NanoDrop at måle _A280 til groft bestemme tilstedeværelsen af protein.

13.. Koncentrerer

1. Koncentrer Ni2 gennemstrømning (og Ni2 eluering hvis proteinet er til stede) til 5 ml med en Amicon Ultra 10 kDa MWCO centrifugerør. Spin i 10 minutters intervaller ved 4.000 rpm ved 4 ° C. Bland med en pipette mellem hver tur til at forhindre protein fra over-koncentrere langs membranen.

14.. Gelpermeationskromatografi (SEC)

1. Opsætning af en Sephacryl S-100 10/30 GL kolonne (GE Healthcare) ved ækvilibrering med 200 ml SEC puffer ved en strømningshastighed på 0,5 ml / min på en AKTApurifier systemet (GE Healthcare).
2. Forbered 10 ml superloops til brug på SEC kolonnen i henhold til producentens anvisninger.
3. Ved hjælp af en 5 ml sprøjte, indlæse prøver på superloops og begynde SEC løb.
4. Overvåg UV-absorbans trace ved 280 nm, mens indsamling lille volumen frhandlinger.
5. Kør SEC fraktioner via SDS-PAGE.
6. Pool SEC fraktioner viser de højeste intensitet bands.
7. Koncentrer pooled SEC fraktioner. Der henvises til trin 13.1.
8. Alikvot protein i 100 ul prøver flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.

Krystallisering

15.. Proteinkrystallisation

1. Pre-fylde hvert reservoir af en 96-brønds Kompakt Jr krystallisering plade (Emerald Bio) med 80 pi krystallisering skærm (Emerald Bio) valg.
2. Fortynd protein med dimensionering puffer til 2-20 mg / ml og opbevares på is.
3. Dispensér 0,4 pi af protein og 0,4 ul af krystallisering skærmen i hver af de 96 brønde og dække med krystalklart fugebånd (Manco).
4. Opbevar pladen ved 16 ° C, mens kontrol for proteinkrystallisation periodisk i løbet af de næste par uger under et dissektionsmikroskop.

16.. Crystal Høst </ P>

1. Skabe et kryobeskyttelsesmiddel fra moderluden og ethylenglycol. Skær klar tape dækker godt med målproteinet krystal. Til en tom brønd, 1,6 ul af tilsvarende krystalliserende tilstand tilføje og kombinere med 0,4 pi ethylenglycol gav en slutkoncentration på 20% ethylenglycol og 80% krystallisering tilstand. Bemærk: at optimere krystal diffraktion prøve forskellige kryobeskyttelsesmidler såsom glycerol, olier, lav MW polyethylenglycoler, og / eller ved varierende procentdele af kryobeskyttelsesmiddel.
2. Før høst afkøle en ALS-style pucken i en Dewar fyldt med flydende nitrogen og dæk med låg.
3. Harvest krystal ved at placere en CryoLoop med den indre diameter matcher størrelsen af ​​krystal på en magnetisk Crystal Wand (Hampton Research) og øse det direkte fra brønden løsning.
4. Umiddelbart dyppe CryoLoop med den høstede krystal i kryoprotektant derefter nedsænkes i ALS-style pucken at blinke fryse crystal. Gentag for et ønsket antal krystaller.

17.. Crystal Screening / Dataindsamling

1. Når høsten er færdig bruge en puck tryllestav at placere magnetiske cryo pucken låg på ALS pucken. Med bøjede tang, vend pucken på hovedet.
2. Overfør pucken til en Rigaku ACTOR Dewar, skrue en Puck Pusher på pucken, og punch låget forlader det i Dewar med knappenåle opad.
3. Brug JDirector software skærm hver krystal under følgende parametre: stråle slids indstillet til 0,5 grader, detektor afstand indstillet til 50 mm, billede trin til 70 grader, og eksponering længde indstillet til 30 sek.
4. Kør Mosflm på test billeder, du har optaget med JDirector at bestemme, hvad den bedste krystal og strategi er for dataindsamling.
5. Saml et komplet datasæt baseret på dine resultater fra Mosflm.

18.. Databehandling / Structure Bestemmelse

1. Kør XDS / XScale ⁴ for at behandle datasættet.
2. Åbn CCP4 suite software.
   1. Kør Phaser ⁵ til at beregne en molekylær erstatning løsning med en høj homologi søgemodel, når de foreligger. I dette tilfælde brugte vi PDBID 3CW4 som en søgning model ^6..
   2. Kør Refmac ⁷ at forfine din molekylære model mod den observerede refleksion indsamlet i datasættet. Endelig resolution bør baseres off af den højeste skallen og bestemmes af følgende parametre: R faktor> 50%, I / sigma> 2, og fuldstændighed> 90%.
3. Byg en 3-dimensionel elektrontæthed model med den molekylære grafik software blishøne ^8..
4. Før deponering af strukturen i FBF validere det med MolProbity ^9-software til at kontrollere, at kvaliteten af strukturen er egnet til deponering.

Representative Results

De følgende resultater illustrerer de forventede resultater af den beskrevne protokol, og i tilfælde af PB2, de observerede resultater.

Brug Gene Composer fem fuld længde mål aminosyresekvenser af influenzavirus polymerase subunit PB2 blev udformet (figur 2). De PB2 sekvenser blev tilbage oversat og udsat for mange tekniske trin ^3, hvilket resulterer i codon harmoniserede sekvenser optimeret til ekspression i E. coli. From the IPCR produkter (figur 3b), i alt fire og tredive konstruktioner blev succesfuldt klonet ind i en modificeret pET28 vektor-system ¹⁰ med et N-terminalt 6x His-SMT fusion tag ved hjælp PIPE kloning ³ som vist i figur 3a. Et sammendrag af kloning arbejdsprocessen er præsenteret i figur 4..

Efter vellykket kloning, blev mikro-skala protein ekspression af hver konstruktion testet i BL21 (DE3) E.coli-celler. Celler blev dyrket i TB-medium suppleret med Novagen Natekspressen 1 medium (ifølge producentens protokol) i 48 timer ved 20 ° C i en rysteinkubator sæt ved 220 rpm. Efter vækst blev celler høstet og testet for opløseligt protein ekspression ved hjælp kapillære elektroforese med en Caliper LabChip 90. Fjorten af ​​de fireogtredive PB2 konstruktioner førte til opløseligt målprotein og trådte storskalafermentering. Stor-skala kulturer af hver konstruktion blev dyrket i TB-medium suppleret med Novagen s Natekspressen 1 medium ifølge producentens protokol. Efter vækst blev celler høstet via centrifugering og opbevaret ved -80 ° C. Proteinproduktion i stor skala ekspression af hver kultur blev bekræftet via SDS-PAGE-analyse (figur 5), før der fortsættes med stor skala oprensning.

Protein Maker blev anvendt til at udføre parallelle oprensning af de fjorten PB2 konstruktioner. Den klarede lysater af all fjorten konstruktioner blev kørt gennem en nikkel-chelat-søjle. Efter bestemmelse hvilke fraktioner indeholdt målproteinet ved SDS-PAGE, blev de tilsvarende fraktioner puljet for hver prøve, og koncentrationen af hver blev bestemt ved en _A280 læsning. Fjernelse af 6x His-SMT-tag blev udført ved tilsætning af ULP1 efterfulgt af dialyse natten og en anden nikkel kolonne. Bekræftelse af His-SMT tag fjernelse blev udført ved SDS-PAGE (figur 6), og hver prøve blev koncentreret med en 10 kDa Amicon Ultra centrifugerør. Efter koncentrering ved hjælp af Amicon Ultra centrifugerør blev hver prøve kørt over en dimensionering kolonne at opnå krystallografisk renhed. En anden koncentration blev udført for at øge proteinkoncentrationen til et niveau nødvendig til krystallisation. Alle fjorten konstruktioner lykkedes renset og trådte i krystallisering forsøg.

Krystallisation blev initieret ved at optø tidligere frozen protein. Krystallisation blev udført i et klima kontrolleret rum ved 16 ° C med specielt designede plader (Emerald Bio) til at sidde drop dampdiffusion (figur 7). Indledende screening blev udført med fire sparsomme matrix-skærme, JCSG +, pagten, Wizard Fuld, og CryoFull (Emerald Bio), efter en længere Newman-strategi. 0,4 pi af protein Opløsningen blev derefter blandet med 0,4 pi crystallant (eller reservoir opløsning) fra det tilsvarende reservoir med 96-brønds Compact Jr krystallisering plader (Emerald Bio). Af de fjorten oprensede prøver ni af dem gav krystaller egnede til diffraktion undersøgelser (figur 8). Et in-house diffraktion datasæt blev indsamlet på fem af de ni konstruktioner krystalliserede ved Cu Ka frekvensbånd med en Rigaku SuperBright FR-E + roterende-anode X-ray generator forsynet med Osmic Varimax HF optik og en Saturn 944 + CCD-detektor (figur 9 ). Hvert datasæt blev behandlet med XDS / XScale ^{4 <} / Sup> og skaleres til en endelig løsning. Forsøg på at løse de strukturer ved molekylær erstatning blev udført med Phaser ⁵ fra CCP4 suite ^7.. De endelige modeller blev opnået efter raffinement i REFMAC ⁷ og manuel ombygning med Coot ^11.. Strukturerne blev vurderet og korrigeret for geometri og fitness med MolProbity ^9.. I alt fire strukturer PB2 underenheden blev bestemt (figur 10), og deponeret i det foreløbige budgetforslag. Figur 11 illustrerer det samlede resultat på hvert trin i MTPP pipeline.

Figur 1. Oversigt over SSGCID gen-til-strukturen vej for Multi-target parallel behandling på Emerald Bio.

indhold "fo: keep-together.within-page =" altid ">
Figur 2. Justering Viewer og Protein Construct Design Modul i Gene Composer software. Amino-syre base, konstruere af target er vist med grønt (midterste vindue) og strukturen guidede trunkeringer af alternative konstruktioner er vist i guld (nederste vindue). En tilpasning af flere Flu virale PB2 sekvenser er vist i forhold til sekvensen og sekundær strukturelementer af det C-terminale domæne fra PDBID 3CW4. Kendskab til det domæne struktur og sekundære strukturelementer tillader N-terminale trunkeringer at blive valgt i Gene Composer Design Module ved at højreklikke på det ønskede aminosyrerest. Klik her for at se større figur .

Figur 3a. PIPE kloning er illustreret, hvor det syntetiske gen indsatsen (orange) forstærkes af designet frem (rød-orange linjer) og reverse (orange-blå linjer) primere til at generere indsætte PCR materiale. Ekspressionsvektoren forstærkes med reverse (rød-sorte streger ) og frem (blå-sorte linjer) primere til at generere vektor PCR materiale. Terminalen sekvenser IPCR produkter er komplementære til de terminale sekvenser af vPCR produkter (red af IPCR supplerer rødt for vPCR og blå IPCR supplerer blå vPCR). Tillader dette IPCR og vPCR produkter at anneale at danne plasmider, der replikeres ved transformation til værten BL21 (DE3) kemisk kompetente E. coli-celler.

Figur 3b. Agarosegelanalyse af IPCR produk ts fra PB2 underenhed. IPCR fejl kan ses som svage eller smeary bands, mens succesfulde IPCR produkter er repræsenteret ved robuste bands. IPCR produktkvalitet kan generelt korreleret med kloning succes. Molekylvægtmarkører er i kilodalton. Figur er gengivet fra Raymond et al. 2011 ^12..

Figur 4.. Genteknologiske trin mål PB2 proteiner blev udført ved anvendelse af Gene Composer software. Efter manipuleret nucleinsyresekvens blev fastlagt for hvert mål blev 6-7 alternative proteinkilder konstruktioner designet til hver. Multi-target parallel behandling i de indledende trin af gen-design og kloning resulterede i 34 konstruktioner, hvoraf 14 var levedygtige mål, der producerede opløselige proteiner i E. coli.

re 5 "src =" / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg "/>
Figur 5. Repræsentative SDS-PAGE analyse af omfattende fermentering viser robust proteinekspression (forventet størrelse på 25,76 kDa), omkring 50% opløseligt (bane 4) og omkring 50% spaltning af 6x His-SMT tag fra eluerede protein (bane 7).

Figur 6.. SDS-PAGE resultater for tre konstruktioner af polymerasen PB2 underenheden Lane 1, molekylvægt-markører (mærket til venstre i kDa),. Bane 2, 6 og 10, samlet protein fra Nikkel 1 kolonne, bane 3, 7 og 11, gennemstrømning af spaltet protein i buffer A fra Nickel 2, banerne 4, 8 og 12, fjernelse af 6x His-Smt tag i buffer B fra Nickel 2.

d/4225/4225fig7.jpg "/>
Figur 7. En skematisk af dampdiffusion ved siddende slip-metoden. Mødet drop metode til proteinkrystallisation falder ind under kategorien af dampe diffusion. Denne metode indebærer en oprenset prøve af protein og fældningsmiddel i ligevægt med et større reservoir med samme forhold i en højere koncentration. Da vand fordamper fra proteinet prøven og overførsler til reservoiret, den fældningsmiddel koncentrationen stiger til et optimalt niveau for protein krystallisering.

Figur 8. Protein krystal af polymerase PB2 underenhed fra en stamme af influenzavirus.

Figur 9. Røntgendiffraktion billede af polymerasen PB2 underenheden fra enstamme af influenzavirus.

Figur 10.. Ribbon diagrammer af molekylerne i den krystallografiske asymmetriske enhed af 4 PB2 strukturer. Sekundære strukturer farvet i regnbue mønster med tilsvarende PDB koder. (A) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Mexico / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1).

Figur 11. Outcome analyse for influenza PB2 mål ved de beskrevne metoder. Den struktue beslutsomhed pipeline er illustreret i fem trin: Kloning, opløselighed, rensning, krystallisering og struktur beslutsomhed.

Discussion

Multi-Target Parallel Processing

Struktur-baserede drug design spiller en vigtig rolle inden for lægemiddelforskning. Den SSGCID er dedikeret til at levere det videnskabelige samfund med tre-dimension protein strukturer fra NIAID kategori AC patogener. Making strukturel information bredt tilgængelige i sidste ende vil tjene til at fremskynde struktur-baseret design af lægemidler.

Det første kritiske trin i MTPP tilgang er konstrukt design. Flere konstruktioner af hvert mål protein øger sandsynligheden for vellykket struktur beslutsomhed og øger turnaround. Det er uundgåeligt, at nogle protein konstruktioner vil mislykkes under stadier af rørledningen. Gennemførelse PIPE kloning metode understøtter MTPP metode ved at tillade generering af mange konstruktioner i 96-brønds format uden arbejdsintensive oprensningstrin. Parring PIPE kloning med evnen til at analysere proteinekspression i den samme 96-brønds format (Caliper LabChip 90) yderligere fremskynder den samlede strøm. Parring af disse metoder giver mulighed for hurtig identifikation af konstruktioner, der producerer opløseligt protein, som sørger for succesen af ​​proteinproduktion i stor skala produktion og oprensning.

Et væsentligt aspekt til succes MTPP high-throughput er Protein Maker (US Patent No 6.818.060, Emerald Bio) instrument. Protein Maker er en 24-kanals parallel flydende kromatografi system udviklet specielt til at øge effektiviteten af ​​high-throughput proteinproduktion og beslægtede strukturelle genomisk pipeline forskning applikationer. Brug den tidligere beskrevne protokol for Protein Maker, fordelene er indlysende i forhold til en enkelt linje FPLC-system. En enkelt person kan rense op til 48 mål parallelt inden en otte timers periode. I modsætning hertil kan en enkelt person, der bruger en enkelt linje FPLC systemet kun rense højst fire mål inden for samme tidsramme. De høje niveauer af renhed for hvert målopnås med Protein Maker er en kritisk faktor i den senere succes voksende protein krystaller til strukturanalyse.

Begrænsninger og fejlfinding

Løsning tredimensionale strukturer ved røntgenkrystallografi er en multitrins indsats med mange udfordringer, hvoraf den ene er den manglende evne til at opnå store mængder af opløseligt målprotein. Én strategi, der kan gennemføres for at overvinde opløselighed problem er brugen af en alternativ ekspressionsvært som E. coli-celler er i stand til at udføre adskillige vigtige eukaryote posttranslationelle modifikationer. Ekspression i forskellige gær-, insekt-og mammale cellelinjer, der er i stand til at udføre disse posttranslationelle modifikationer er ofte en egnet alternativ. Target-proteiner er undertiden udtrykkes men helt uopløselig i standard lysis forhold. Protein Maker kan være en værdifuld ressource for hurtig test af alternative cellelysis betingelsersom beskrevet i Smith et al. 2011 ¹³ personer. Denne strategi er ofte nødvendigt at holde målene bevæger sig gennem rørledningen. I alle strukturel genomforskning rørledninger, kan standardiserede protokoller ikke være egnet til alle mål, der kommer gennem rørledningen og mål kan have brug for individuel optimering. For eksempel har vi valgt at bruge 20% ethylenglycol til hver kryobeskyttelsesmiddel. I tilfælde, at denne betingelse ikke er egnet, kan alternative kryobeskyttelsesmidler eller koncentrationer skal testes.

På grund af den unikke natur af hvert enkelt protein-target, det hastighedsbegrænsende og uforudsigelige skridt til at afgøre en struktur er krystallisering. De MTPP pipeline opvejer den almindeligt lav succesrate af protein krystallisering med optimering fra de første sparsomme matrix skærme. Hver indledende krystal hit fra kommercielt tilgængelige sparsomme matrix skærme er yderligere optimeret med en E-Screen Builder (Emerald Bio). Optimeringen Skærmen er udformet around tilstand oprindelige krystal hit, ændring af koncentrationerne af de buffere, salte og tilsætningsstoffer. Vellykket optimering skærme giver krystaller egnede til diffraktion undersøgelser og strukturbestemmelse.

Den strukturelle genomforskning program lagt frem af Det Nationale Institut for Allergi og Smitsomme Sygdomme (NIAID) yder støtte til Emerald Bio og tre andre Pacific Northwest institutioner, som tilsammen er de SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, University of Washington og Pacific Northwest National Laboratory) . Hvert medlem af konsortiet blev valgt for deres ekspertise i at anvende state-of-the-art teknologier, der kræves for at opnå de mål NIAID strukturelle genomforskning program. Til dato har SSGCID deponeret 461 strukturer i FBF ranking det som den syvende største bidragyder i verden, og i 2011, de fleste den produktive. De protokoller og metoder for SSGCID er forsynet med den hensigt at gavnevidenskabelige samfund og forevige forskningen af ​​smitsomme sygdomme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers	IDT
Genes	DNA 2.0
TE buffer	Qiagen	provided in kit
96-well half skirt PCR plates	VWR	10011-248
PFU Master Mix
6X Orange Loading Dye	Fermentas	R0631
10X TAE	Teknova	T0280
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414-10G
pET28 vector
2-YT Broth	VWR	101446-848
Kanamycin	Teknova	K2151
Restriction Enzymes	Fermentas
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Top 10 chemically comp cells	Invitrogen	C4040-06
Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)	VWR	89094-662
Airpore covers (Rayon films for bio cultures)	VWR	60941-086
24-well blocks	VWR	13503-188
QIAvac 96	Qiagen	19504
BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)	NEB	C2527H
50% Glycerol	VWR	100217-622
TB Media	Teknova	T7060
IPTG	Sigma-Aldrich
1 M Tris pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
5 M NaCl	Teknova	S0251
Glycerol	Aldrich	G7893-4L
CHAPS	JT Baker	4145-01
Imidazole	Sigma	56749-1KG
TCEP	Amresco	K831-10G
L-arginine	Amresco	0877-500G
Benzonase	EMD	70746-3
Lysozyme	USB	1864525GM
10 kDa MWCO dialysis tubing	Thermo	68100
Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators	Millipore	UFC901024
HisTrap FF columns	GE	17-5255-01
HiTrap Chelating columns	GE	17/0408-01
Compact Jr crystallization plates	Emerald Bio	EBS-XJR
Crystalization screens	Emerald Bio
Ethylene Glycol 100%	Emerald Bio	EBS-250-EGLY
Crystal Wand Magnetic Straight	Hampton Research	HR4-729
Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm	Hampton Research	HR4-955
ALS style puck
Puck Wand
Bent Tongs
Puck Pusher