Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-til-struktur Fastsettelse av Influensa Polymerase PB2 underenhet

Summary

Struktur-basert drug design spiller en viktig rolle i utvikling av legemidler. Forfølge flere mål parallelt i stor grad øker sjansen for suksess for bly oppdagelse. Den følgende artikkelen belyser hvordan Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease benytter en multi-target tilnærming for gen-til-struktur fastsettelse av PB2 influensa A underenhet.

Abstract

Pandemi utbrudd av svært virulente influensa stammer kan føre til omfattende sykelighet og dødelighet i menneskelige befolkninger over hele verden. I USA alene, er et gjennomsnitt på 41 400 dødsfall og 1,86 millioner sykehusinnleggelser forårsaket av influensavirus infeksjon hvert år ^en. Punktmutasjoner i polymerase basisk protein 2 subenhet (PB2) har vært knyttet til tilpasning av den virale infeksjon hos mennesker ^2. Funn fra slike studier har avdekket den biologiske betydningen av PB2 som en virulens faktor, og dermed fremheve sitt potensial som en antiviral medikament målet.

Den strukturelle genomikk programmet lagt frem av National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) gir støtte til Emerald Bio og tre andre Pacific Northwest institusjoner som til sammen utgjør Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). Den SSGCID er opptatt av å gi det vitenskapelige miljøet med three-dimensjonale protein strukturer av NIAID kategorien AC patogener. Å gjøre en slik strukturell informasjon tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet tjener til å akselerere struktur-basert drug design.

Struktur-basert drug design spiller en viktig rolle i utvikling av legemidler. Forfølge flere mål parallelt i stor grad øker sjansen for suksess for ny leder oppdagelsen ved å målrette en sti eller et helt protein familien. Emerald Bio har utviklet en høy gjennomstrømning, multi-target parallell prosessering rørledning (MTPP) for gen-til-struktur vilje til å støtte konsortiet. Her beskriver vi protokollene som brukes for å bestemme strukturen av PB2 subenheten fra fire forskjellige influensa A stammer.

Protocol

En oversikt over den protokoll er presentert i figur 1..

Molecular Biology

En. Konstruer Design

Bruk Gene Komponist programvare for å designe protein konstruere og kodon utviklet syntetiske gensekvenser. Bruken av Gene Komponist programvare har blitt tilbudt i detalj andre steder ^tre.

1. Bruk Justering Viewer Module og Konstruer Design Module å sammenligne protein sekvens justeringer og definere protein konstruksjon. Juster målaminosyresekvensen for både den primære og 3D strukturelle elementer fra homologer i Protein Data-banken (PDB), hvis tilgjengelig (figur 2).
2. Bruk justering informasjon for å ta struktur-guidede konstruere design ved å velge nye termini basert på bevaring av den primære struktur og 3D strukturer av homologene.
3. Design insert PCR (IPCR) og vektor PCR (vPCR) amplimers (terminal primere).
4. Ved hjelp av Gene Composer er protein-til-DNA-algoritmen, tilbake-oversette konstruktet aminosyresekvens inn i kodon konstruert nukleinsyresekvens.
5. Bruk riktig kodon bruk tabellen (CUT) for å optimalisere sekvens for uttrykk i E. coli.
6. Nesten klone setter inn pET28 vektor endret for å innlemme en N-terminal 6x Histidine tag og Smt3/SUMO fusion protein som gir enkel rensing.
7. Plasser syntetisk gen orden med DNA 2,0 og bestille primere fra Integrated DNA Technologies.

2. Polymerase Ufullstendig Primer Extension (PIPE) Cloning

1. Forbered Grunning og Genes
   1. Sentrifuger levert av leverandør plater som inneholder primere på 1000 rpm i 1 min.
   2. Bring primer konsentrasjonen til 100 mM og tilsett 50 pl TE-buffer.
   3. Fortynn primere til 10 uM med deionisert (DI) vann i en 96-brønn v-bunn-plate.
   4. Sentrifuger leverandørverktøy genet i en 1,5 ml tube på 1300 rpm i 1 min.
   5. I 1,5 ml rør, gjør fortynninger av hver primer til 10 ng / mL.
   6. Oppbevar primere og gener ved -20 ° C når den ikke er i bruk.
2. Forbered Sett PCR (IPCR)
   1. Tine en ampulle med PFU Master Mix på is, hold gener og primere ved romtemperatur.
   2. Lag en plate map overdragende brønner til et sett med primere og konstruere.
   3. Legg 13 mL DI vann inn i hver brønn i en 96-brønners PCR-plate.
   4. Tilsett 5 ul av forover og 5 ul av revers primer for hver reaksjon i 96-brønns plate i henhold til platen kartet, og sikrer til å endre tips mellom hver brønn.
   5. Tilsett 2 mL av hver fulle lengde gen til dens passende vel i henhold til platen kartet.
   6. Tilsett 25 pl av PFU konsentrat-blanding til hver brønn, og sikrer til å endre tips mellom hver brønn.
   7. Syklus reaksjonene ved hjelp av følgende PCR-forhold:
      1. 95 ° C 2 min 95 ° C 30 sek
      2. 50 ° C 45 sek
      3. 68 ° C 3 min
      4. 4 ° C ∞
   8. Gjenta trinn bd i 25 sykluser.
   9. Overfør 10 ul av hver IPCR reaksjon på en ny 96-brønners PCR-plate.
   10. Tilsett 3 mL av 6X belastning fargestoff til hver prøve.
   11. Separer hver prøve på en 1% TAE EtBr agarose gel ved 110 V ved siden av en 100-500 bps DNA stigen for å bekrefte fragment forsterkning.
   12. Butikken IPCR produkt ved -20 ° C når den ikke er i bruk (unngå fryse tine så mye som mulig).

3. Forbered Vector PCR (vPCR)

1. Begynn natten kultur av transformert E. coli med pET28 vektor plasmid.
   1. Vaksinere to 5 ml rør med to-YT kokes med 50 mikrogram / ml kanamycin.
   2. Grow kulturer over natten ved 37 ° C i shaker på 220 rpm.
2. Spinn ned kulturer etter vekst over natten ved sentrifugering ved 3000 rpm i 15 min.
3. Bruk en Qiagen Qiaprep Spin Miniprep Kit for å trekke pET28 vektor fra bakterie pellets i henhold til produsentens instruksjoner.
4. Oppsett restriksjonsenzymseter digestions av utvunnet pET28 plasmid.
   1. Legg 2,2 mL av 10X BamHI-buffer og 1 ul av BamHI og Hindlll for å 20fil pET28 vektor.
   2. Inkuber reaksjon i 1 time ved 37 ° C.
5. Separat fordøyelsen produktet på en gel.
   1. Se trinn 2.2.10.
   2. Skjær vektor band fra gel og rense den ved hjelp av QIAquick Gel Extraction Kit i henhold til produsentens instruksjoner.
6. Ved hjelp av en NanoDrop, kvantifisere DNA konsentrasjon.
7. Fortynne kutte vektor til 10 ng / mL. Oppbevares ved -20 ° C når den ikke er i bruk.
8. Forbered vPCR primere.
   1. Sentrifuger IDT levert oligonucliotides i 1 min ved 1300 rpm.
   2. Bringe konsentrasjonen til 100 mM med DI vann.
   3. Forbered 10 mikrometer fortynning av både forover og bakover primere i en 1,5 ml tube.
   4. Oppbevar primere og primer fortynninger ved -20 ° C.
9. Tine PFU Master Mix på is og tine mal og primere ved romtemperatur.
10. Oppsett vPCR reaksjoner i en 96-brønners PCR plate:
    1. I den første raden i en 96-brønners plate kombinere 60 pl av både forover og bakover vPCR primere og 24 ul av fordøyd pET28 mal (10 ng / mL).
    2. Ved hjelp av en 12-tip flerkanalspipette, overføre 12 ul av tennsatsen og malen konsentrat-blanding, til de gjenværende brønn av platen. Dette skal resultere i 12 pl primer og mal konsentrat-blanding i hver brønn på platen.
    3. Legg 13 mL DI vann til hver brønn.
    4. Tilsett 25 mL av PFU Master Mix til hver brønn.
11. Syklus reaksjonene gjennom PCR betingelser brukes i trinn 2.2.7.
12. Pool alle de vPCR reaksjoner i en 15 ml Falcon rør.
13. Bekreft fragment forsterkning ved å skille 10 ul samlet PCR produktet på en gel (forventet lengde på fordøyd pET28 vektorer ca 6 kb).
    1. Se trinn 2.2.10.
14. Forbered fusjonere plater.
    1. Delmengde 3 mL av vPCR produkt i hver brønn av en 96-brønn v-bunn-plate.
    2. Oppbevar plater ved -20 ° C inntil fusjonerer med IPCR produktet.

4. Flett IPCR og vPCR Products

1. Tine IPCR produkter og pre-alikvoteres vPCR 96-vel flette plate ved romtemperatur.
2. Tilsett 3 mL av hver IPCR produkt til dets respektive brønn av flettingen plate.
3. Transformere fusjonere plate i Top Ten kjemisk kompetente celler.
4. Tilsett 2 mL av hver flette reaksjon i en enkelt 50 mL rør fra leverandøren kjemisk kompetente celler og fortsette med produsentens følger protokoll.
5. Forbered overnattingsturer kulturer for hver konstruksjon fra transformasjon plate.
6. Delmengde 5 ml TB-buljong (med 50 pg / ml kanamycin) fra et 25 ml sterilt reservoar inn i hver brønn i en dyp brønn-blokken.
7. Ved hjelp av sterilele teknikk, plukke en isolert koloni fra hver transformasjon plate og inokuler passende brønnen av dyp brønn blokken.
8. Dekk blokken med en Airpore dekselet.
9. Rist blokk ved 220 rpm ved 37 ° C over natten.
10. Pellet cellene ved sentrifugering av blokken i 30 min ved 4000 rpm.
11. Hell av supernatanten og pat toppen av blokken tørt med et papirhåndkle.
12. Mini-prep ved hjelp av en Qiagen 96-brønns vakuum anordningen i samsvar med produsentens instruksjoner.

5. Forbereder glyserol aksjer av klonet konstruerer

1. Transform klonet sekvens validert DNA i BL21 (DE3) kjemisk kompetente celler i henhold til produsentens instruksjoner.
2. For hvert konstrukt, velg en enkelt isolert koloni fra BL21 (DE3) transformasjon og inokulere inn i 1 ml av 2-YT-buljong (med 50 pg / ml kanamycin).
3. Rist kulturer ved 220 rpm i 3-4 timer ved 37 ° C.
4. Merke en 1,5 mlskruehette tube med den unike konstruksjonen identifikasjonsnummer, cellestamme, og dato. Tilsett 500 ul av 50% glycerol og 500 ul celle-kultur og invertere flere ganger. Umiddelbart glyserol lagre lager på tørris eller i en -80 ° C fryser.

6. Expression Testing

Lysis Buffe r	Vask Buffer	Elueringsbuffer
50 mM NaH 2 4 PO, 8,0 pH 300 mM NaCl 10 mM Imidazole 1% Tween 20. 2 mM MgCl2 0,1 mL / ml Benzonase 1 mg / ml Lysozym	50 mM NaH 2 4 PO, 8,0 pH 300 mM NaCl 20 mM Imidazole 0,05% Tween 20	25 mM Tris, 8,0 pH 300 mM NaCl 250 mM Imidazole 0,05% Tween 20

* Legg Benzonase, lysozym,og proteasehemmer umiddelbart før lysis.

1. Streak en prøve fra glyserol lager på kanamycin selektiv agar og inkuberes over natten ved 37 ° C.
2. Start en ikke-induserende pre-kultur i en 96-brønns rundbunnet blokk; inokulere 1,2 ml TB-buljong (med 50 mg / ml kanamycin) supplementert med 0,5% glukose med en fersk vokst E. coli isolere. Vokse over natten rysting ved 220 rpm ved 37 ° C.
3. Etter overnatter vekst, starte induksjon kulturer ved inoculating 1,2 ml TB kjøttkraft (med 50 mg / ml kanamycin) supplert med Novagen Overnight Express System 1 (i henhold til produsentens protokoll) med 40 pl av den pre-kulturen.
4. Vokse småskala induksjon kulturer ved 20 ° C i 48 timer, rist ved 220 rpm.
5. Høst celler ved sentrifugering ved 4000 rpm i 15 minutter, hell av supernatanten og lagres ved -20 ° C i minst 1 time før behandling.
6. I den 96-brønns blokk, resuspender cellen pellets i 300 pl lysebuffer. Inkuber cellene i lysis buffer ved romtemperatur i 30 min etterfulgt av mekanisk lysis ved kraftig risting i 30 min ved romtemperatur.
7. Tydeliggjøre det rå lysatet ved sentrifugering i 30 min ved 4000 rpm ved 4 ° C.
8. Bruke en flerkanals pipette for å overføre 200 ul av det klarede lysat (løselig fraksjon) til en 96-brønns flatbunnet skuff (Qiagen). For hver brønn inneholder en prøve, legger 40 mL Ni-NTA magnetiske kuler (Qiagen).
9. Beveg lett platen på en vippe i 1 time ved 16 ° C.
10. Sett platen på en magnetisk innlegg plate (Qiagen) og fjern ubundet fraksjon. Vær nøye med å ikke pipetteres ut noen av Ni-NTA perler.
11. Fjern platen fra stillingen plate og forsiktig resuspendert perlene i 200 ul vaskebuffer. Pipette opp og ned i 30 sek og deretter plassere platen tilbake på innlegget plate.
12. Fjern vaskebufferen og gjentar trinn 6.12.
13. Fjern plate fra post plate og Eluer Ni-NTA bundet target protein ved å vaske med 50 ul elueringsbuffer i 5 min.
14. Returner flat bunnplate for å magnetiske stolpe plate og overføre elueringen til en frisk 96-brønners V-bunn-plate.
15. Overfør 20 ul av eluering til en frisk 96-brønners V-bunn-plate og reagere med 1 ul ULP1 protease.
16. Ifølge produsentens protokoll, analysere eluerte og eluerte + Ulp1 brøkdel av kapillær elektroforese med en LabChip 90.
17. Alternativt kan alle fraksjoner fra uttrykket testing bli analysert via SDS-PAGE.

7. Large Scale gjæring

1. Bruk av en steril pipette til å skaffe en skrape fra et lager glyserol, inokulere 100 ml TB-buljong (med 50 mg / ml kanamycin) og vokse over natten. Rist ved 220 rpm og 37 ° C.
2. Etter overnatter vekst, utvide pre-kultur ved inoculating en L av TB kjøttkraft med EMD autoinduksjonen løsninger (se produsentens protokoll) (med 50 mg / ml kanamycin) i en 2 L forbløffet kolbe med 10 ml avpre-kultur (1:100 fortynning).
3. Rist de utvidede en L kulturer ved 37 ° C, forandre temperaturen på rysteinkubator til 20 ° C ved en optisk densitet på 0,6 (OD ₆₀₀₎ er nådd.
4. Etter overnatter vekst, ta en representant 10 ml mengde fra hver konstruksjon for uttrykk testing.
5. Innhøsting celle lim ved sentrifugering ved 5000 rpm i 15 min og kast supernatanten.
6. Freeze celle lim ved -80 ° C.

Proteinrensing

Buffere:

Lysebuffer	Buffer A (Ekvilibrering)	Buffer B (Elueringen)	Dimensjonering kolonne Buffer
25 mM Tris, 8,0 pH 200 mM NaCl 0,5% Glycerol 0,02% CHAPS 10 mM Imidazole 1 mM TCEP 50 mM Arginin 5 ul Benzonase 100 mg Lysozyme 3 proteaseinhibitor tabletter (EDTA-free)	25 mM Tris, 8,0 pH 200 mM NaCl 10 mM Imidazole 1 mM TCEP 50 mM Arginin 0,25% Glyserol	25 mM Tris, 8,0 pH 200 mM NaCl 200 mM Imidazole 1 mM TCEP	25 mM Tris, 8,0 pH 200 mM NaCl 1% glycerol 1 mM TCEP

* Legg Benzonase, lysozym, og proteasehemmer tabletter til hver 150 ml prøve umiddelbart før lysis.

8. Cellelysis

1. Gjør 2 l lysis buffer, ikke tilsett lysozym, proteasehemmer tabletter eller benzonase (hver prøve vil bli lysert separat i 150 ml lysis buffer).
2. Tine og resuspender celle lim i lysis buffer på en 1:05 masse: volum ratio med kraftig omrøring i 30 min ved 4 ° C. Bryt biter løs fra sidene av beger med en ren spatel. I løpet av denne tidsperioden forberede Ni og dialysis buffere
3. På is, lysere cellene ved hjelp av en Misonix sonicator (70% effekt, 2 sek på / 1 sekund av pulser for 3 min) og forsiktig virvel container for å hindre overoppheting. Lagre en liten (200 ul) aliquot av rått lysat for fremtidig analyse.
4. Tydeliggjøre det rå lysatet ved sentrifugering ved 18.000 xg i 35 min ved 4 ° C, samle supernatanten og lagre et lite (200 ul) alikvot for fremtidig analyse. Lagres pellet ved 4 ° C inntil det er bekreftet at proteinet har blitt lysert i den oppløselige fraksjonen.

9. Pre-run Protein Maker Setup

1. Med protein maker slått på og programvaren åpne, initialisere instrumentet.
2. Når initialisert, og fest én 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF Nikkel-chelate kolonne (Ni kolonne) på en egen linje i gantry for hver av prøvene.
3. Løpe 3-4 kolonnevolumer (CV) av likevektsbufferen gjennom hver kolonne.
4. Prime likevekt og elueringsbuffer linjer.
5. Equilibrspiste kolonnene ved å aspirere buffer A gjennom kolonnen gang.

10. Nikkel 1 (Ni1) Column

1. Vask hver kolonne med 20 ml Milli-Q vann for å fjerne lagring buffer. Løpe 5 ml buffer B og 25 ml buffer A for ekvilibrering.
2. Laste det klarede lysat inneholdende solubilisert protein i kolonnene med en hastighet på 2 ml / min og deretter følge av en 15 ml vask med buffer A.
3. Eluere det bundne protein i en trinn-gradient med buffere A og B ved følgende forholdstall med respekt: ​​5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Samle hver eluering brøkdel separat.
4. Analyser: eluerte fraksjoner, råolje lysate, avklart lysate og gjennomstrømning av SDS-PAGE. Pool fraksjonene inneholdende proteinet og bruke en NanoDrop å måle en ₂₈₀ til omtrent bestemme mengden av protein til stede.

11. ULP1 Kløv

1. Hold en liten porsjon (250 ul) av Ni1 kolonne bassenget for påfølgende gel analyse. Ta med restenav Ni1 basseng til 10 ml og tilsett ubiquitin-lignende protease 1 (ULP1) på en ul / 5 mg total protein for å fjerne Hans-SMT affinitet tag.
2. Dialyser den Ni1 basseng + ULP1 mot 2 l buffer A i 4 timer ved 4 ° C i 10 kDa molekylvekt cutoff (MWCO) på en røre plate ved 4 ° C.
3. Etter dialyse, kjøre SDS-PAGE av Ni1 basseng og Ni1 pool + ULP1 å avgjøre om ULP1 cleavage var vellykket.

12. Nikkel 2 (Ni2) Column

1. Load kløyvde proteinet over samme Ni-kolonnen og gjenta trinn 9.3 ved en redusert strømningshastighet på 1 ml / min. Den kløyvde off tag vil binde seg til kolonnen og tagless målprotein vil nå strømme gjennom. Samle gjennomstrømning i en fersk container.
2. Vask Ni kolonne med 3 ml buffer A, etterfulgt av 5 ml buffer B for å eluere alt His-merkede og ikke-spesifikt bundet protein. Samle hver fraksjon for seg.
3. Kjør SDS-PAGE av Ni2 gjennomstrømning, vaske og Ni2 eluering fraksjoner å verifisere ULP1 cleavage og at protein er til stede i gjennomstrømning. Bruk en NanoDrop å måle A ₂₈₀ til omtrent bestemme tilstedeværelsen av protein.

13. Konsentrerer

1. Konsentrer den Ni2 gjennomstrømning (og Ni2 eluering hvis proteinet er til stede) til 5 ml med en Amicon ultra 10 kDa MWCO sentrifugerør. Spinn i 10 min intervaller på 4000 rpm ved 4 ° C. Bland med en pipette mellom hvert spinn for å hindre protein fra over-konsentrere seg langs membranen.

14. Størrelse-utelukkelse kromatografi (SEC)

1. Sett opp en Sephacryl ® S-100 10/30 GL-kolonne (GE Healthcare) ved ekvilibrering med 200 ml SEC-buffer ved en strømningshastighet på 0,5 ml / min på en AKTApurifier system (GE Healthcare).
2. Forbered 10 ml superloops for bruk på SEC kolonne i henhold til produsentens instruksjoner.
3. Ved hjelp av en 5 ml sprøyte, legger prøvene på superloops og begynne SEC løp.
4. Overvåke UV-absorbans spor på 280 nm mens samle lite volum frhandlinger.
5. Kjør SEC fraksjoner via SDS-PAGE.
6. Pool SEC fraksjoner som viser de høyeste intensitet band.
7. Konsentrer sammenslåtte SEC fraksjoner. Se trinn 13.1.
8. Delmengde protein i 100 ul prøver, flash fryse i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C.

KRYSTALLISASJON

15. Protein Krystalliseringstetting

1. Pre-fylle hver reservoar av en 96-brønn Compact Jr krystallisering plate (Emerald Bio) med 80 pl av krystallisering skjermen (Emerald Bio) av valget.
2. Fortynn protein med dimensjonering buffer til 2-20 mg / ml og oppbevares på is.
3. Tilsett 0,4 mL av protein og 0,4 mL av krystallisering skjermen i hver av 96-brønner og dekk med krystallklar forsegling tape (Manco).
4. Oppbevar platen ved 16 ° C mens du sjekker for protein krystallisering jevne mellomrom i løpet av de neste ukene under en dissekere mikroskop.

16. Crystal Harvesting </ P>

1. Opprett en kryobeskytter fra moderluten og etylenglykol. Skjær klar tape som dekker brønnen med målproteinet krystall. Til en tom brønn, tilsett 1,6 pl av den tilsvarende krystallinske tilstand og kombinere med 0,4 pl av etylenglykol som gir en endelig konsentrasjon på 20% etylenglykol og 80% krystalliserende tilstand. Merk: For å optimalisere krystall diffraksjon prøve forskjellige cryoprotectants som: glyserol, oljer, lav MW polyetylenglykoler, og / eller med varierende prosentandeler av kryobeskyttende.
2. Før høsting kjøle ned en ALS-stil pucken i en dewar fylt med flytende nitrogen og dekk med lokk.
3. Høste krystall ved å plassere en CryoLoop med indre diameter som passer til størrelsen på krystall på en Magnetic Crystal Wand (Hampton Research) og kaprer den direkte fra brønnen løsning.
4. Umiddelbart dyppe CryoLoop med høstes krystall i den cryoprotectant deretter senk i ALS-stil puck å blinke fryse crystal. Gjenta for et ønsket antall krystaller.

17. Crystal Screening / datainnsamling

1. Når høsting er ferdig bruke en puck tryllestaven for å plassere den magnetiske cryo pucken lokket på ALS pucken. Med bøyde tang, vipper pucken opp ned.
2. Overfør pucken til en Rigaku ACTOR dewar, skru en Puck Pusher på pucken, og punch av lokket forlate det i dewar med pinner med forsiden opp.
3. Ved hjelp JDirector programvare, skjermen hver krystall under følgende parametere: bjelke slit satt til 0,5 grader, detektor avstand satt til 50 mm, bilde steg til 70 grader, og eksponering lengde satt til 30 sek.
4. Kjør Mosflm på test bildene du har tatt med JDirector å finne ut hva den beste krystall og strategi er for datainnsamling.
5. Samle en komplett datasett basert på resultatene fra Mosflm.

18. Data Processing / Struktur Fastsettelse

1. Kjør XDS / XScale ⁴ å behandle datasettet.
2. Åpne CCP4 suite programvare.
   1. Kjør Phaser ⁵ for å beregne en molekylær erstatning løsning ved hjelp av en høy homologi søk modell, når det er tilgjengelig. I dette tilfellet brukte vi PDBID 3CW4 som et søk modell ^seks.
   2. Kjør Refmac ⁷ for å avgrense molekylær modell mot den observerte refleksjon samles i datasettet. Endelig vedtak bør være basert off av den høyeste skall og bestemmes ut fra følgende parametere: R faktor> 50%, I / sigma> 2, og fullstendighet> 90%.
3. Bygge en 3-dimensjonal elektrontetthet modellen med molekylær grafikk programvare Kvakk ^åtte.
4. Før deponering strukturen i PDB validere den med MolProbity ⁹ programvare for å kontrollere at kvaliteten på struktur er egnet for deponering.

Representative Results

De følgende resultater illustrerer de forventede resultatene av den beskrevne protokoll, og i tilfelle av PB2, de observerte resultater.

Ved hjelp Gene Redigering, fem full-lengde target aminosyresekvenser av influensavirus polymerase subenhet PB2 ble konstruert (figur 2). De Pb2 sekvenser ble tilbake oversatt og utsatt for mange tekniske trinn ^3, noe som resulterer i kodon-sekvenser harmoniserte optimalisert for ekspresjon i E. coli. Fra de IPCR produkter (Figur 3b), totalt trettifire konstruerer ble klonet inn i en modifisert pET28 vektor system ¹⁰ med en N-terminal 6x Hans-SMT fusjon tag bruke PIPE kloning ³ som vist i figur 3a. En oppsummering av kloning arbeidsflyten vist i figur 4..

Etter vellykket kloning, ble mikro-skala protein uttrykk for hver konstruksjon testet i BL21 (DE3) E.coli-celler. Cellene ble dyrket i TB medium supplert med Novagen Overnight Express ett medium (i henhold til produsentens protokoll) i 48 timer ved 20 ° C i en rysteinkubator sett på 220 rpm. Etter vekst, ble cellene høstet og testet for løselig protein uttrykk ved hjelp av kapillære electrophoreses med en Caliper LabChip 90. Fjorten av de trettifire Pb2 konstruerer førte til løselig mål protein og gikk storstilt gjæring. Storstilt kulturer av hver konstruksjon ble dyrket i TB medium supplert med Novagen sin Overnight Express ett medium i henhold til produsentens protokoll. Etter vekst ble celler høstet via sentrifugering og lagret ved -80 ° C. Storskala proteinekspresjon av hver kultur ble bekreftet via SDS-PAGE-analyse (figur 5) før fortsetter med storskala-rensing.

Protein Maker ble brukt til å gjennomføre parallelle rensing av de fjorten Pb2 konstruksjoner. De avklart lysater av all fjorten konstrukter ble kjørt gjennom en nikkel-chelat kolonne. Etter å bestemme hvilke fraksjoner inneholdt målprotein ved SDS-PAGE, ble de tilsvarende fraksjoner ble samlet for hver prøve og konsentrasjonen av hver ble bestemt ved en A ₂₈₀ lesing. Fjernelse av 6x His-SMT tag ble utført ved tilsetning av ULP1 etterfulgt av dialyse over natten og en andre nikkel kolonne. Bekreftelse av His-SMT tag fjerning ble utført ved hjelp av SDS-PAGE (figur 6), og hver prøve ble konsentrert med en 10 kDa Amicon ultra sentrifugerør. Etter konsentrasjon ved anvendelse av Amicon ultra-sentrifugerør, ble hver prøve kjørt over en dimensjonering kolonne for å oppnå krystallografisk renhet. En andre konsentrasjon ble utført for å øke proteinkonsentrasjonen til et nivå som er nødvendig for krystallisering. Alle fjorten konstruerer ble vellykket renset og inngått krystallisering prøvelser.

Krystallisering ble innledet ved tining den tidligere frozen protein. Krystallisering ble utført i et klima kontrollert rom ved 16 ° C med spesielt utformede plater (Emerald Bio) for sittende dråpe dampdiffusjon (figur 7). Innledende screening ble utført med fire sparsom matrise-skjermer; JCSG +, Pact, Wizard Full og CryoFull (Emerald Bio), etter en utvidet Newman strategi. 0,4 mL av protein oppløsning ble deretter blandet med 0,4 pl av crystallant (eller reservoar-løsning) fra den tilsvarende reservoar ved anvendelse av 96-brønn Kompakte Jr krystallisasjons plater (Emerald Bio). Av de fjorten rensede prøvene ni stykker ga krystaller egnete for diffraksjons-studier (figur 8). En in-house diffraksjon datasett ble samlet på fem av de ni konstruerer krystallisert på Cu Ka bølgelengde med en Rigaku SuperBright FR-E + roterende anode X-ray generator utstyrt med Osmic VariMAX HF-optikk og en Saturn 944 + CCD detektor (figur 9 ). Hvert datasett ble behandlet med XDS / XScale ^{4 <} / Sup> og skalert til endelig vedtak. Forsøk på å løse strukturene ved molekylær erstatning ble utført med Phaser ⁵ fra CCP4 suite ^7. De endelige modellene ble innhentet etter raffinement i REFMAC ⁷ og manuell ombygging med Kvakk ^11. Strukturene ble vurdert og korrigert for geometri og fitness med MolProbity ^9. Totalt fire strukturer i PB2 subenheten ble bestemt (Figur 10) og deponert i PDB. Figur 11 illustrerer den samlede resultat ved hvert stadium i MTPP rørledningen.

Figur 1. Oversikt over SSGCID gen-til-struktur vei for Multi-target parallell behandling på Emerald Bio.

innhold "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 2. Alignment Viewer og Protein Konstruer Design Module i Gene Composer. Amino-syre base konstruere av målet vises i grønt (midten vindu) og struktur guidede trunkeringer av alternative konstruksjoner er vist i gull (nederste vinduet). En justering av flere influensa viral Pb2 sekvenser er vist i forhold til sekvensen og sekundære strukturelementer av C-terminal domene fra PDBID 3CW4. Kunnskap om domenet struktur og sekundære strukturelementer gjør N-terminal trunkeringer å bli valgt innenfor Gene Komponist Design Module ved å høyreklikke på ønsket aminosyreresten. Klikk her for å se større figur .

Figur 3a. PIPE kloning er illustrert hvor syntetisk gen innsats (orange) er forsterket av designet fremover (rød-oransje linjer) og revers (orange-blå linjer) primere å generere sette PCR materiale. Ekspressjonsvektor er forsterket med revers (rød-svarte linjer ) og fremover (blå-svarte linjer) primere å generere vektor PCR materiale. Terminalen sekvenser IPCR produkter er komplementære til de terminale sekvenser av vPCR produkter (rød av IPCR utfyller røde av vPCR og blå IPCR utfyller blå vPCR). Dette gjør at IPCR og vPCR produkter til anneal å danne plasmider som er kopiert på transformasjon til verten BL21 (DE3) kjemisk kompetente E. coli-celler.

Figur 3B. Agarose gel analyse av IPCR produksjon ts fra PB2 subenheten. IPCR feil kan bli sett på som svake eller smeary band, mens vellykkede IPCR produkter er representert ved robuste band. IPCR produktkvalitet kan vanligvis være korrelert med kloning suksess. Molekylvektmarkører er i kiloDaltons. Figuren er gjengitt fra Raymond et al., 2011 ^12..

Figur 4. Gene tekniske trinn på target Pb2 proteiner ble utført med Gene Composer. Etter konstruert nukleinsyre sekvens ble etablert for hvert mål, ble 6-7 alternative proteinkilder konstruerer designet for hver. Multi-target parallell behandling i de innledende trinnene av genet utforming og kloning resulterte i 34 konstruksjoner, hvorav 14 var levedyktige mål som produserte oppløselige proteiner i E. coli.

re 5 "src =" / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg "/>
Figur 5. Representant SDS-PAGE analyse av storskala fermentering viser robust protein uttrykk (forventet størrelse på 25,76 kDa), omtrent 50% løselig (lane 4) og ca 50% spalting av 6x Hans-SMT tag fra eluerte protein (lane 7).

Figur 6. SDS-PAGE resultater for tre konstruksjoner av polymerase PB2 subenhet en Lane, molekylær-vekt markører (merket til venstre i kDa),. Baner 2, 6 og 10, samlet protein fra Nickel en kolonne, baner 3, 7 og 11, gjennomstrømning av kløyvde protein i buffer A fra Nickel 2, baner 4, 8 og 12, fjerning av 6x Hans-SMT tag i buffer B fra Nickel to.

d/4225/4225fig7.jpg "/>
Figur 7. En skjematisk av dampdiffusjon av den sittende slipp-metoden. Den sittende slipp-metoden for protein krystallisering faller under kategorien dampdiffusjon. Denne metoden innebærer en renset prøve av proteinet og fellingsmidlet til likevekt med et større reservoar inneholdende lignende tilstander i en høyere konsentrasjon. Når vann fordamper fra proteinet og overfører prøven til reservoaret, øker konsentrasjonen fellingsmidlet til et optimalt nivå for protein krystallisering.

Figur 8. Protein krystall av polymerase PB2 underenhet fra en stamme av influensavirus.

Figur 9. Røntgendiffraksjon bilde av polymerase PB2 subenheten fra enstamme av influensavirus.

Figur 10. Ribbon diagrammer av molekylene i krystallografisk asymmetrisk enhet av fire PB2 strukturer. Sekundære konstruksjoner farget i regnbuens mønster med tilsvarende PDB koder. (A) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A / Mexico / InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1).

Figur 11. Utfallet analyse for influensa Pb2 mål av metodene beskrevet. Den Struktureringe bestemmelse rørledning er illustrert i fem trinn: Kloning, løselighet, rensing, krystallisering og strukturbestemmelse.

Discussion

Multi-Target Parallel Processing

Struktur-basert drug design spiller en viktig rolle i medisiner. Den SSGCID er opptatt av å gi det vitenskapelige miljøet med tre-dimensjon protein strukturer fra NIAID kategorien AC patogener. Å gjøre en slik strukturell informasjon allment tilgjengelig til slutt vil tjene til å akselerere struktur-basert drug design.

Den første kritiske trinn i MTPP tilnærming er konstruere design. Flere konstruksjoner av hvert mål protein øker sannsynligheten for vellykket struktur besluttsomhet og øker behandlingstid. Det er uunngåelig at noen protein konstruerer feiler under stadier av rørledningen. Implementere PIPE kloning metoden støtter MTPP metoden ved at den generasjonen av mange setninger i 96-brønners format uten arbeidsintensive rensing trinn. Sammenkobling PIPE kloning med evnen til å analysere protein uttrykk i det samme 96-brønnen format (Caliper LabChip 90) påskynder ytterligere den totale flyt. Sammenkoblingen av disse metodene gir mulighet for rask identifikasjon av konstruksjoner som produserer løselig protein som sikrer suksess for storskala protein produksjon og rensing.

Et viktig aspekt for å lykkes i den MTPP høy gjennomstrømming er Protein Maker (US Patent No 6.818.060, Emerald Bio) instrument. Protein Maker er en 24-kanals parallell væske-kromatografi system utviklet spesielt for å øke effektiviteten av high-throughput protein produksjon og relaterte strukturelle genomisk rørledning forskning. Ved hjelp av den tidligere beskrevne protokoll for Protein Maker, fordelene er tydelig i forhold til en enkelt linje FPLC-system. En enkelt person kan rense opp til 48 mål i parallell i løpet av en åtte timers periode. I kontrast, kan en enkelt person ved hjelp av en enkelt linje FPLC systemet bare rense maksimalt fire mål innenfor samme tidsramme. De høye nivåene av renhet på hvert måloppnådd med Protein Maker er en kritisk faktor i den senere suksess med voksende protein krystaller for struktur-analyse.

Begrensninger og feilsøking

Løse tredimensjonale strukturer ved røntgenkrystallografi er en flertrinns forsøk med en rekke utfordringer, hvorav den ene er den manglende evne til å oppnå store mengder av løselig målprotein. En strategi som kan implementeres for å overvinne løseligheten problem er bruken av en alternativ ekspresjonsvert som E. coli-celler er ikke i stand til å utføre flere viktige eukaryotiske posttranslasjonelle modifikasjoner. Ekspresjon i forskjellige gjær, insekt-og pattedyr-cellelinjer som er i stand til å utføre disse post-translasjonelle modifikasjoner er ofte et egnet alternativ. Målproteiner er noen ganger uttrykt men helt uløselig i standard lysis forhold. Protein Maker kan være en verdifull ressurs for rask testing av alternative cellelysis forholdsom beskrevet i Smith et al. 2011 ^13. Denne strategien er ofte nødvendig for å holde målene beveger seg gjennom rørledningen. I noen strukturelle genomikk rørledning, kan standardiserte protokoller ikke være egnet for hvert mål som kommer gjennom rørledningen og mål kan trenge individuell optimalisering. For eksempel har vi valgt å bruke 20% etylenglykol for hver cryoprotectant. I saker som denne tilstanden ikke er egnet, kan alternative cryoprotectants eller konsentrasjoner må testes.

På grunn av den unike natur av hver enkelt protein mål, er det hastighetsbegrensende og uforutsigbare trinn for å bestemme en struktur krystallisering. De MTPP rørledning oppveier ofte lav suksessrate på protein krystallisering med optimalisering fra de innledende sparsom matrise skjermer. Hver første krystall rammet fra kommersielt tilgjengelige sparsom matrise skjermer er ytterligere optimalisert med en E-Screen Builder (Emerald Bio). Optimalisering skjermen er utformet around tilstand av den første krystall treffet, forandre konsentrasjonene av de buffere, salter og additiver. Vellykket optimalisering skjermene gi krystaller egnet for diffraksjon studier og struktur besluttsomhet.

Den strukturelle genomikk programmet lagt frem av National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) gir støtte til Emerald Bio og tre andre Pacific Northwest institusjoner som til sammen er det SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, University of Washington og Pacific Northwest National Laboratory) . Hvert medlem av konsortiet ble valgt for sin kompetanse i å anvende state-of-the-art teknologi som kreves for å oppnå målene i NIAID strukturelle genomikk program. Til dags dato har SSGCID avsatt 461 strukturer i PDB ranking det som den syvende største bidragsyteren i verden, og i 2011, den mest produktive. Protokoller og metoder i SSGCID er utstyrt med den hensikt å gagnevitenskapelige samfunnet og vedlikeholdende forskning av smittsomme sykdommer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers	IDT
Genes	DNA 2.0
TE buffer	Qiagen	provided in kit
96-well half skirt PCR plates	VWR	10011-248
PFU Master Mix
6X Orange Loading Dye	Fermentas	R0631
10X TAE	Teknova	T0280
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414-10G
pET28 vector
2-YT Broth	VWR	101446-848
Kanamycin	Teknova	K2151
Restriction Enzymes	Fermentas
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Top 10 chemically comp cells	Invitrogen	C4040-06
Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)	VWR	89094-662
Airpore covers (Rayon films for bio cultures)	VWR	60941-086
24-well blocks	VWR	13503-188
QIAvac 96	Qiagen	19504
BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)	NEB	C2527H
50% Glycerol	VWR	100217-622
TB Media	Teknova	T7060
IPTG	Sigma-Aldrich
1 M Tris pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
5 M NaCl	Teknova	S0251
Glycerol	Aldrich	G7893-4L
CHAPS	JT Baker	4145-01
Imidazole	Sigma	56749-1KG
TCEP	Amresco	K831-10G
L-arginine	Amresco	0877-500G
Benzonase	EMD	70746-3
Lysozyme	USB	1864525GM
10 kDa MWCO dialysis tubing	Thermo	68100
Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators	Millipore	UFC901024
HisTrap FF columns	GE	17-5255-01
HiTrap Chelating columns	GE	17/0408-01
Compact Jr crystallization plates	Emerald Bio	EBS-XJR
Crystalization screens	Emerald Bio
Ethylene Glycol 100%	Emerald Bio	EBS-250-EGLY
Crystal Wand Magnetic Straight	Hampton Research	HR4-729
Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm	Hampton Research	HR4-955
ALS style puck
Puck Wand
Bent Tongs
Puck Pusher