Fibroblasten van patiënten die mutaties in Parkinson's ziekte-veroorzakende genen vormen een gemakkelijk toegankelijke<em> Ex vivo</em> Model om de ziekte-geassocieerde fenotypes bestuderen. Live cell imaging biedt de mogelijkheid om morfologische en functionele parameters te bestuderen in levende cellen. Hier beschrijven we de bereiding van humane fibroblasten en opvolging van mitochondriale fenotypen.
De ziekte van Parkinson (PD) is de tweede meest voorkomende bewegingsstoornis en komt voor bij 1% van de mensen boven de leeftijd van 60 1. Omdat de vergrijzing is de belangrijkste risicofactor, zullen gevallen van PD te verhogen tijdens de komende decennia 2. Naast pathologische vouwing van eiwitten en een verminderde afbraak van eiwitten paden, werden veranderingen van mitochondriale functie en morfologie gewezen als verdere kenmerk van neurodegeneratie bij PD 3-11.
Na jaren van onderzoek in muizen en menselijke kankercellen in vitro modellen voor moleculaire wegen van Parkinson ontleden, is het gebruik van humane fibroblasten van patiënten en geschikte controles ex vivo modellen een waardevol hulpmiddel voor onderzoek als mogelijke restricties worden beschouwd. Anders dan vereeuwigd, in plaats van kunstmatige cel modellen, primaire fibroblasten van patiënten die ziekte-geassocieerde mutaties blijkbaar weerspiegelen belangrijke pathologische kenmerken of de menselijke ziekte.
Hier hebben we af te bakenen van de procedure van het nemen van de huid biopten, kweken menselijke fibroblasten en met behulp van gedetailleerde protocollen voor essentiële microscopische technieken om mitochondriale fenotypes te definiëren. Deze werden gebruikt om verschillende functies die samenhangen met PD die relevant zijn voor mitochondriale functie en dynamiek onderzoeken. Ex vivo kan mitochondria worden geanalyseerd op hun functie, morfologie, colokalisatie met lysosomen (organellen de afbrekende disfunctionele mitochondria) en afbraak via de lysosomale pathway . Deze fenotypes zijn zeer relevant voor de identificatie van vroege tekenen van PD en kan voorafgaan aan de klinische motorische symptomen bij de mens de ziekte-gen dragers. Derhalve kan de hier gepresenteerde assays worden gebruikt als waardevolle tools pathologische kenmerken van neurodegeneratie te identificeren en nieuwe therapeutische strategieën definiëren PD helpen.
Huid van de patiënt fibroblasten als ex vivo modellen vormen een belangrijk instrument om de ziekte-geassocieerde genetische defecten te karakteriseren. Daarnaast, huid-afgeleide fibroblasten zijn gemakkelijk toegankelijk en kan worden uitgebreid op het kweken. Daarom primaire cellen verkregen van patiënten die PD-gerelateerde genetische mutaties de voorkeur boven het gebruik van tumor cellijnen zoals ze niet alleen de endogene otosclerosegen, maar de volledige genetische achtergrond van het aangetaste indivi…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Fritz Thyssen Foundation (10.11.2.153 te RK), de Duitse Raad voor Onderzoek (DFG, KR2119/3-2 en KR2119/8-1 te RK), het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 te RK) en door een doctoraatsbeurs van het charitatieve Hertie Foundation [naar LFB]. Wij danken Carolin Obermaier en Julia Westermeier voor hun steun tijdens de video shoot.
Name of reagent | Company | Catalogue no. |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.