El uso de fibroblastos humanos primarios para la Supervisión de fenotipos mitocondriales en el campo de la enfermedad de Parkinson
Summary
Los fibroblastos de pacientes portadores de mutaciones causantes de la enfermedad en el Parkinson genes representan un fácil acceso<em> Ex vivo</emModelo> para estudiar las enfermedades asociadas a fenotipos. Imágenes de células vivas da la oportunidad de estudiar los parámetros morfológicos y funcionales en las células vivas. Aquí se describe la preparación de fibroblastos humanos y posterior seguimiento de fenotipos mitocondriales.
Abstract
Enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno del movimiento más común y afecta a 1% de las personas mayores de 60 1. Debido a que el envejecimiento es el factor de riesgo más importante, los casos de PD aumentará durante las próximas décadas 2. Al lado de plegamiento de proteínas patológicas y deteriorados vías de degradación de proteínas, alteraciones de la función mitocondrial y la morfología fueron señalados como sello distintivo adicional de la neurodegeneración en la EP 3-11.
Después de años de investigación en células de cáncer murino y humano como en modelos in vitro para diseccionar las vías moleculares de parkinsonismo, el uso de fibroblastos humanos de pacientes y controles apropiados como modelos ex vivo se ha convertido en una valiosa herramienta de investigación, si se consideran posibles salvedades. Aparte de modelos celulares inmortalizadas, más bien artificiales, fibroblastos primarios de los pacientes portadores de enfermedades asociadas a mutaciones aparentemente reflejan importantes características patológicas of la enfermedad humana.
Aquí delinear el procedimiento de toma de biopsias de piel, los fibroblastos humanos cultivo y el uso de protocolos detallados para esenciales técnicas microscópicas para definir los fenotipos mitocondriales. Estos fueron usados para investigar las características diferentes asociados con la EP que son relevantes para la función mitocondrial y la dinámica. Ex vivo, las mitocondrias pueden ser analizadas en términos de su función, la morfología, la colocalización con lisosomas (los orgánulos degradantes mitocondrias disfuncionales) y la degradación a través de la vía lisosomal . Estos fenotipos son altamente relevantes para la identificación de los signos iniciales de la EP y puede preceder a los síntomas clínicos de motor en genes humanos portadores de enfermedades. Por lo tanto, los ensayos presentados aquí pueden ser utilizados como herramientas valiosas para identificar las características patológicas de la neurodegeneración y ayudar a definir nuevas estrategias terapéuticas en la EP.
Protocol
Discussion
Fibroblastos de la piel del paciente como modelos ex vivo representan una herramienta importante para caracterizar la enfermedad asociada a defectos genéticos. Además, la piel derivados de fibroblastos son fácilmente accesibles y se pueden expandir en cultivo. Por lo tanto, las células primarios obtenidos de pacientes portadores de PD asociadas a mutaciones genéticas son preferibles a la utilización de líneas de células tumorales, ya que contienen no sólo el endógeno gen causante de enfermedad, pero t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Fritz Thyssen (10.11.2.153 a RK), el Consejo Alemán de Investigación (DFG, KR2119/3-2 y KR2119/8-1 a RK), el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 a RK) y por una beca doctoral de la Fundación Hertie caridad [a LFB]. Damos las gracias a Carolin Obermaier y Westermeier Julia por su apoyo durante la filmación del video.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue no. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
| RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
| AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
| Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
| Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
| Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
| Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
| Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
References
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