L'uso di fibroblasti umani primari per il monitoraggio fenotipi mitocondriali nel campo della malattia di Parkinson

Summary

I fibroblasti di pazienti portatori di mutazioni nel Parkinson geni che causano malattie rappresentano un facile accesso

Abstract

Morbo di Parkinson (PD) è il secondo disturbo movimento più comune e colpisce l'1% delle persone di età superiore ai 60 ^1. Poiché l'invecchiamento è il fattore di rischio più importante, i casi di PD aumenterà nei prossimi decenni ^2. Accanto al ripiegamento delle proteine ​​patologiche e deteriorate vie di degradazione delle proteine, alterazioni della funzione mitocondriale e la morfologia sono stati additati come segno distintivo ulteriore della neurodegenerazione nella malattia di Parkinson ^3-11.

Dopo anni di ricerca in cellule tumorali murine ed umane come modelli in vitro per analizzare vie molecolari di parkinsonismo, l'uso di fibroblasti umani da pazienti e controlli appropriati come modelli ex vivo è diventato un valido strumento di ricerca, se caveat potenziali sono considerati. Oltre immortalizzate, modelli cellulari piuttosto artificiali, fibroblasti primari di pazienti portatori di malattie associate a mutazioni apparentemente riflettere importanti caratteristiche patologiche of la malattia umana.

Qui delineare la procedura di presa di biopsie cutanee, la coltura fibroblasti umani e l'utilizzo di protocolli di modalità di tecniche microscopiche essenziali per definire fenotipi mitocondriali. Questi sono stati utilizzati per studiare diverse caratteristiche associate a PD che sono rilevanti per la funzione mitocondriale e la dinamica. Ex vivo, mitocondri può essere analizzato in termini di funzione, morfologia, colocalizzazione con i lisosomi (organelli mitocondri degradanti disfunzionale) e la degradazione attraverso la via lisosomiale . Questi fenotipi sono molto importanti per l'identificazione di segni precoci di PD e possono precedere i sintomi motori clinici umani malattia gene-vettori. Quindi, i saggi qui presentati possono essere utilizzati come strumenti preziosi per identificare le caratteristiche patologiche di neurodegenerazione e contribuiscono a definire nuove strategie terapeutiche in PD.

Protocol

1. Biopsia della pelle e la coltura di fibroblasti umani

1. La biopsia della pelle deve essere presa da un medico esperto. La procedura si svolge in condizioni di sterilità e non richiede anestesia locale. Siti tipici utilizzati per biopsia sono il lato interno del braccio, alla spalla o inferiore della schiena.
2. Si può prendere campione diametro 4x4mm o 6x6mm da biopsia per ottenere tessuto sufficiente per la coltura fibroblasti umani.
3. Tagliare la biopsia cutanea in piccoli pezzi uguali in condizioni sterili per separarli in 2-4 T25 fiaschi. Ogni pallone dovrebbe contenere 2-3 pezzi di epidermide. I terreni di coltura contenente 15% FCS, piruvato di sodio 1,1% e 1% di penicillina / streptomicina in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
4. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO _2. Il tempo di propagazione previsto fino fibroblasti primo crescere del campione epidermica è di 1-2 settimane. Se i problemi di crescita sono incontrati, si può fare uso di fa di crescita dei fibroblastictor (5-10 ng / ml FGF2) per stimolare la crescita delle cellule.
5. Una volta che una cellula confluenza del 50-70% viene raggiunto, i fibroblasti umani primari possono essere congelati. Il tempo di 50-70% di confluenza viene raggiunta, differisce tra linee cellulari. Congelare i fibroblasti nel 90% FCS solfossido maggiorato del 10% dimetil (DMSO).

2. Preparazione di fibroblasti umani per la microscopia diretta Cell Imaging

In generale, gli esperimenti con fibroblasti umani deve essere effettuata con passaggi al di sotto di 10, come senescenza-associate alterazioni possibile modificare le proprietà delle cellule dopo più di un passaggio. In caso di dubbio, beta-galattosidasi saggi possono essere utilizzati per valutare l'induzione di processi di invecchiamento nelle rispettive celle. In generale, non utilizzare fibroblasti invecchiati (vedi sopra). Inoltre, per confrontare diverse linee cellulari, funzionano con il numero stesso passaggio di ciascuna linea cellulare. Confronto di diversi pazienti geneticamente omogenee rispetto ai controlli sani è raccomandata. Tuttavia, come talvoltapazienti portatori di mutazioni specifiche possono essere rare, questo può significare che biopsie cutanee da solo un paziente con un numero certo passaggio e linee di controllo differenti devono essere inclusi - qui è essenziale garantire lo stesso numero passaggio di tutte le linee incluse. Se una cella confluenza del 50-70% è raggiunto, ma nessun esperimento programmato, fibroblasti devono essere congelati.

1. Il primo giorno dell'esperimento, lavare i fibroblasti allegate una volta con PBS. Quindi rilasciare dal pallone utilizzando una soluzione distacco delle cellule di enzimi proteolitici DNasi (cioè ACCUMAX).
2. Contare le cellule e le sementi 50.000-70.000 cellule in ciascun pozzetto di una 4 camere coprioggetti (1,8 cm ² area culturale per pozzetto). Pertanto, per gli 8-camere coverglas, metà del numero di cellule o poco meno è appropriato (0,8 cm ² coltura per pozzetto). È importante seme piuttosto un piccolo numero di cellule per effettuare reale cella singola analisi. Nessun rivestimento specifico per le camere is necessario.
3. Dopo 24-48 ore, il live esperimento di imaging cellulare può essere effettuata. Assicurarsi che il live microscopio imaging cellulare è dotato di un incubatore che controlla temperatura e _livelli di CO2. Durante l'acquisizione dell'immagine, un'atmosfera di 37 ° C e 5% di CO ₂ dovrebbe essere mantenuta.
4. Ogni misura vivo imaging cellulare dovrebbe essere effettuata in almeno tre esperimenti indipendenti. In totale, un minimo di 50 cellule per ogni linea cellulare deve essere ripreso. Gli esperimenti di imaging dal vivo delle cellule così come le analisi off-line devono essere eseguite in condizioni di cieco per garantire i dati imparziali raccolta.

3. Misurazione della funzione mitocondriale in Living fibroblasti umani

Per la misurazione convenzionale di funzione mitocondriale via potenziale di membrana mitocondriale (MMP)-dipendente coloranti fluorescenti selezione cellulare attivata (FACS) è il metodo principale. Nel caso di fibroblasti umani, cellulare autofluorescence è frequente e può causare risultati falsi positivi per interferenza con il segnale colorazione vera e propria. Autofluorescenza diventa in genere più pronunciato con numeri più alti passaggio di fibroblasti. Pertanto, si preferisce valutare la funzione mitocondriale di fibroblasti umani mediante microscopia vivo imaging cellulare.

1. 24-48 ore dopo la semina, incubare i fibroblasti in 50 nM del MMP-dipendente tetramethylrodamine colorante etil estere (TMRE) in terreno RPMI. Questo mezzo RPMI manchi rosso fenolo come questo può influire negativamente sulla qualità dell'immagine. 1,6 pM di colorazione Hoechst dovrebbe essere aggiunto per visualizzare nuclei.
2. Incubare le cellule in soluzione colorante preparata riparo dalla luce per 15 minuti a 37 ° C e 5% di CO _2.
3. Sostituire la soluzione di colorazione con il mezzo RPMI (senza rosso fenolo). Procedere senza una fase di lavaggio e subito celle di immagine. Utilizzare ingrandimento 63x e confocale a scansione laser tecnica di microscopia (microscopia a fluorescenza utilizzando in alternativaTecnica Apotome) per definire i singoli strati di cellule. Applicare 37 ° C e 5% di CO ₂ a cellule durante il processo di imaging.
4. Quando l'imaging i fibroblasti, prestare la massima attenzione al tempo di esposizione di luce fluorescente applicato come colorazione TMRE può candeggina in fretta. Definire il momento opportuno di esposizione tra 200 e 300 ms e di non superare questo intervallo. L'acquisizione delle immagini con le impostazioni standard è molto importante, come si sarebbe in grado di fare confronti in base all'intensità se le impostazioni sono diverse tra le linee cellulari.
5. Come un raggio definito attorno alle cellule sotto forma di immagini è sbiancato dopo l'esposizione alla luce, tenere il campo successivo visivo adeguatamente lontano dalla sezione photobleached.
6. Off-line analisi vengono effettuate utilizzando il software ImageJ (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA).
7. Selezionare la cella di interesse, utilizzando uno strumento di selezione.
8. Convertire immagini a 8-bit (Foto <Tipo <8-bit).
9. Ridurre il rumore b aspecificay con la funzione "Antipolvere" (Process <rumore <Smacchia).
10. Scegliere le "tabelle di ricerca - Fire" condizione (Foto <tabelle di ricerca Fuoco <).
11. Passare nella funzione soglia per la "Over / Under" e regolare la funzione soglia (Foto <Regolazione Soglia <).
12. Selezionare l'opzione "analizzare particelle", che vi darà il valore medio grigio per ogni particella mitocondriale rilevabile (Analizza <analizzare particelle). Salvare la lista dei risultati dato come un foglio di calcolo di Excel.
13. Risultato Apri il file nel programma Excel e calcolare la media del valore medio grigio delle strutture mitocondriali (indicato come 'media' in data excel lista dei risultati).
14. Per creare un grafico di superficie, selezionare il plugin "Interactive trama di superficie 3D" nella sezione "3D" plugin. Qui, è possibile regolare ulteriormente la trama con diverse opzioni di visualizzazione. "Modifica dei colori originali" a "Spectrum LUT" dà la barra della scala di intensità per la trama del caso.
15. In alternativaall'utilizzo TMRE per analizzare la funzione mitocondriale di fibroblasti umani tramite imaging cellulare vivo, una combinazione di MMP-indipendente colorante verde Mitotracker FM e la MMP-dipendente Mitotracker colorante CM-H ₂ Xros può essere utilizzato. Ancora, per fibroblasti umani vivono immagini di microscopia cella è preferito, ma in generale questa alternativa è stato utilizzato anche mediante analisi FACS in altri tipi di cellule ^12. Quando si utilizza questo approccio alternativo per misurare la funzione mitocondriale in fibroblasti umani, passo 3-7 di sezione del protocollo 5 "Misura del mitochondrio-lisosomiale colocalizzazione nel vivere fibroblasti umani" deve essere applicato. Essa, la sovrapposizione dei segnali, sia dal positivo mitocondri per Mitotracker verde FM e Mitotracker CM-H ₂ Xros viene calcolata e indica la quantità di mitocondri come rapporto funzionale a tutti i presenti mitocondri.

4. Misurazione della morfologia mitocondriale in Living fibroblasti umani

1. 24-48hr dopo la semina, le cellule incubare a 200 nM Mitotracker verde FM in mezzo RPMI (senza rosso fenolo) riparo dalla luce per 15 minuti a 37 ° C e 5% di CO _2. 1,6 pM di colorazione Hoechst dovrebbe essere utilizzato per evidenziare nuclei. Mitotracker verde FM è una MMP-indipendente colorante, macchie che tutte le strutture mitocondriali presenti.
2. Lavare delicatamente le cellule una volta con PBS.
3. Aggiungere mezzo RPMI fresco (senza rosso fenolo) alle cellule e immediatamente celle di immagini. Utilizzare ingrandimento 63x e confocale a scansione laser tecnica di microscopia (microscopia a fluorescenza in alternativa con la tecnica Apotome) per definire i singoli strati di cellule.
4. Off-line le analisi vengono estratti mediante l'uso di software ImageJ.
5. Selezionare la cella di interesse, utilizzando uno strumento di selezione.
6. Convertire immagini a 8-bit (Foto <Tipo <8-bit).
7. Riduzione del rumore non specifico utilizzando la funzione "Antipolvere" (Process <rumore <Smacchia).
8. Utilizzare il filtro di convoluzione per evidenziare mitocondristrutture mitocondriale (Processo <Filtri <Convolve).
9. Regolare la soglia in modo che il rapporto segnale-rumore è opportuno (Foto <Regolazione Soglia <).
10. Utilizzando l'opzione "analizzare particelle", l'identificazione automatica delle strutture mitocondriali è avviata sulla base di una dimensione del pixel scelto (Analizza <analizzare particelle). Diversi parametri mitocondriali sono successivamente calcolati come area, perimetro, gli assi maggiori e minori o di circolarità. Queste misure possono essere impostati singolarmente (Analizza <Misure Set). Salvare la lista dei risultati dato come un foglio di calcolo di Excel.
11. Aprire il file risultato nel programma Excel. Con l'uso di tali parametri, analisi della morfologia mitocondriale può essere effettuata. Ciò comprende la definizione del fattore di forma che indica il grado di ramificazione di una rete mitocondriale [formula: (perimetrale ²⁾ / (4 * PI () * area)], nonché il rapporto di formato che definisce la lunghezza dei mitocondri (formula: maggiore assi / assi minori).

5. Misurazione della Mitochondrio-lisosomiale Colocalizzazione in Living fibroblasti umani

1. 24-48 ore dopo la semina, le cellule incubare a 200 nM Mitotracker verde FM e 100 nM Lyostracker Red DND-99 in medium RPMI (senza rosso fenolo) riparo dalla luce per 15 minuti a 37 ° C e 5% di CO _2. 1,6 pM di colorazione Hoechst viene utilizzato per evidenziare i nuclei.
2. Sostituire il terreno con mezzo fresco RMPI (senza rosso fenolo) contenente 100 nM Lyostracker Red ND-99. Questo colorante deve essere presente durante l'intera sessione di imaging. Non lavare le cellule dopo il periodo di incubazione. Immediatamente immagine le cellule. Utilizzare ingrandimento 63x e tecnica confocale (tecnica alternativa Apotome) per definire i singoli strati di cellule.
3. Off-line le analisi vengono estratti mediante l'uso di software ImageJ.
4. Aprire le due rispettive immagini che si desidera analizzare in termini di status colocalizzazione.
5. Convertire immagini a 8-bit (Foto <Tipo <8-bit). Riduzione del rumore non specifico utilizzando la funzione "Antipolvere" in entrambe le immagini (Process <rumore <Smacchia).
6. Scegliere il plugin "Jacopo", come strumento di analisi di colocalizzazione, che fornisce i valori per i rispettivi canali e calcola il coefficiente di Pearson, si sovrappongono e coefficiente coefficiente di Manders '(Plugin <Jacop).

6. Risultati rappresentativi

Funzione mitocondriale nel vivere fibroblasti umani può essere valutata tramite tecnica di imaging cellulare dal vivo. Per saggi funzionali, il segnale di fluorescenza TMRE correla con il potenziale di membrana mitocondriale (MMP). In condizioni normali di MMP, la fluorescenza TMRE è notevolmente superiore (Figura 1A, riga superiore) che in condizioni patologiche caratterizzate da una ridotta MMP (Figura 1A, riga inferiore). Questa fluorescenza viene misurata calcolando la media del valore medio grigio di ogni struttura mitocondriale ( (Figura 1A, lato destro).

Accanto alla valutazione della funzione mitocondriale in fibroblasti umani, vivo microscopia imaging cellulare può essere utilizzato per definire diversi parametri di morfologia mitocondriale. Usando il Mitotracker verdi FM strutture mitocondriali tinture sono visualizzati indipendente dalla loro rispettiva MMP (Figura 2). Questo è importante per garantire l'inclusione di tutte le strutture mitocondriali presenti nelle analisi. Utilizzando il software ImageJ, la morfologia viene analizzato sulla base dei dati binari, come solo i parametri qui morfologia mitocondriale può essere valutata (Figura 2, "binario"). Esempi di analisi della morfologia mitocondriale in termini di fattore di forma e proporzioni sono stati recentemente pubblicati ^{6, 1}3. Un'altra importante caratteristica che può essere misurata in living fibroblasti umani è la degradazione delle strutture mitocondriali. Il primo passo di questo cammino può essere valutata mitochondrio-lisosomiale colocalizzazione in microscopia vivo imaging cellulare. Alcune condizioni patologiche provocano un aumento di mitocondri colocalizzazione con i lisosomi (Figura 3A). Ancora una volta, Mitotracker verde FM viene utilizzato per colorare strutture mitocondriali indipendenti della loro rispettiva MMP. Inoltre, la colorazione con Lysotracker Red DND-99 consente di visualizzare strutture lisosomiali. È fondamentale che il colorante Lysotracker Red è presente durante il processo di imaging, come fasi di lavaggio ridurre il segnale che è troppo basso per la visualizzazione. Colocalizzazione è rappresentato da chiari segnali di fluorescenza giallo a causa della sovrapposizione del verde (verde Mitotracker FM) e rosso (Red Lysotracker ND-99) colorazione (frecce bianche, Figura 3A) e sono determinati dal calcolo del coe Pearsonfficiente (Figura 3B).

In generale, per analisi off-line con ImageJ software, è utile visualizzare una cella per immagine, in modo che la definizione di una regione di interesse (ROI) può essere evitato.

Figura 1. Misurazione del segnale TMRE fluorescenza indica il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) nel soggiorno fibroblasti umani mediante tecnica vivo imaging cellulare. (A) è un TMRE fluorescente MMP-dipendente colorante, la cui intensità di fluorescenza è correlata con la MMP. Hoechst colorante è stato utilizzato per colorare nuclei (blu). In condizioni normali di MMP (riga superiore), la fluorescenza TMRE è significativamente superiore in condizioni patologiche caratterizzate da una ridotta MMP (fila inferiore). Intensità di fluorescenza è inoltre mostratocome grafico dell'intensità superficiale. Bar Scala indica 10 micron. (B) L'analisi statistica dei fibroblasti esemplificativa mostrata in (A). In condizioni patologiche, una fluorescenza TMRE diminuzione dei mitocondri è misurato rispetto alla normale condizione di MMP. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Misura della morfologia mitocondriale in fibroblasti umani che vivono con la tecnica dal vivo imaging cellulare. Mitotracker Verde FM (verde) viene utilizzato per visualizzare le strutture mitocondriali, per questo è indipendente dalla MMP. Hoechst colorante è stato utilizzato per colorare nuclei (blu). Uso ImageJ Software, la morfologia può essere analizzata su cifre binarie. Bar Scala indica 10 micron. clic qui per ingrandire la figura.

Figura 3. Misura della colocalizzazione dei mitocondri con i lisosomi nel vivere fibroblasti umani da parte di tecnica di imaging cellulare dal vivo. (A) Mitotracker Verde FM (verde) viene utilizzato per colorare le strutture mitocondriali, Lyostracker Red ND-99 (rosso) visualizza strutture lisosomiali. Hoechst colorante è stato utilizzato per colorare nuclei (blu). Colocalizzazione successo in condizioni patologiche è indicato da un segnale giallo a causa della sovrapposizione di rosso e verde Lysotracker colorazione Mitotracker (frecce bianche). Bar Scala indica 10 micron. (B) L'analisi statistica dei fibroblasti esemplificativa mostrata in (A). Un livello più elevato di mitochondrio-lisosomiali risultati colocalizzazione in un elevato valore del coefficiente di Pearson./ 4228/4228fig3large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.

Discussion

Fibroblasti cutanei dei pazienti come modelli ex vivo rappresentano un importante strumento per caratterizzare difetti genetici associata a malattia. Inoltre, la pelle derivati ​​fibroblasti sono facilmente accessibili e possono essere estesa, coltura. Pertanto, cellule primarie ottenute da pazienti portatori PD-associata mutazioni genetiche sono preferibili l'uso di linee cellulari tumorali in quanto contengono non solo la endogena causante malattia gene, ma l'intero background genetico dell'individuo interessato. Inoltre, i fibroblasti hanno dimostrato di riflettere importanti caratteristiche patologiche di disfunzione mitocondriale durante neurodegenerazione. Gli esperimenti descritti in questo protocollo sono particolarmente utili per studiare fenotipi mitocondriali inclusi funzione, morfologia e colocalizzazione valutazione dei mitocondri con lisosomi tramite tecnica vivo imaging cellulare. Essa, caratteristiche principali della malattia, cioè la disfunzione mitocondriale e degradanti successivazione di questi organelli non funzionali, possono essere visualizzati ed analizzati correttamente ^{6, 13.} Alterazioni della funzione mitocondriale e di morfologia sono spesso un primo passo di malattia patologia. Per esempio, la frammentazione della rete mitocondriale può essere un prerequisito di avanzati processi autofagici e mitophagic ^6,12. Pertanto, la colocalizzazione dei mitocondri con i lisosomi può aiutare a valutare il degrado mitocondriale (mitophagy) ^6. Una mancanza di questo colocalizzazione nonché un accumulo di mitocondri con lisosomi potrebbe riflettere difetti nella via di degradazione lisosomiale e deve essere convalidata modulando flusso autofagico ^6. In questo contesto, il software ImageJ rappresenta un importante strumento per generare set di dati validati da funzioni non-polarizzati mezzo automatici di analisi.

Un'opzione aggiuntiva che estende l'uso di fibroblasti umani a più correlati alla malattia modelli è il potenziale generatione di staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule che possono differenziarsi in tipi cellulari distinti che sono obiettivo principale del processo di malattia ^14. Nel caso della malattia di Parkinson, la differenziazione dei fibroblasti in neuroni dopaminergici rende questo modello cellulare uno strumento promettente per future ricerche in questo disturbo neurodegenerativo ^15,16. Importante, tutti i saggi descritti nel protocollo qui può essere facilmente tradotto in apparati sperimentali per indagare alterazioni mitocondriali all'interno dei neuroni dopaminergici. Naturalmente, ancora più neurone-specifici vivi esperimenti di imaging cellulare può essere applicata, anche.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Invitrogen	52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red	Invitrogen	11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Invitrogen	14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	100-18B
AccuMax (detachment solution)	PAA	L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses	Nalge Nunc International	115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE)	Invitrogen	T-669
Mitotracker Green FM	Invitrogen	M-7514
Mitotracker CM-H2XRos	Invitrogen	M-7513
Lyostracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
H–chst 33342	Invitrogen	H-3570
Table 1. Specific reagents and equipment.