Fibroblaster fra pasienter bærer mutasjoner i Parkinsons sykdom-forårsaker gener representerer en lett tilgjengelig<em> Ex vivo</em> Modell for å studere sykdomsassosierte fenotyper. Levende celle bildebehandling gir mulighet til å studere morfologiske og funksjonelle parametre i levende celler. Her beskriver vi utarbeidelse av humane fibroblaster og påfølgende oppfølging av mitokondrie fenotyper.
Parkinsons sykdom (PD) er den nest vanligste bevegelse lidelse og rammer 1% av personer over 60 år en. Fordi aldring er den viktigste risikofaktor, vil tilfeller av PD øke i løpet av de neste tiårene 2. Ved siden av patologisk protein folding og nedsatt protein degradering pathways, ble endringer i mitokondrienes funksjon og morfologi påpekt som ytterligere kjennetegn på neurodegeneration i PD 3-11.
Etter års forskning i murine og humane kreftceller som in vitro modeller for å dissekere molekylære mekanismene i parkinsonisme, har bruken av menneskelige fibroblaster fra pasienter og hensiktsmessige kontroller som ex vivo-modeller blitt et verdifullt verktøy for forskning, hvis potensielle begrensningene er vurdert. Annet enn udødeliggjort, heller kunstige celle-modeller, primære fibroblaster fra pasienter bærer sykdom mutasjoner tilsynelatende reflekterer viktige patologiske funksjoner of sykdom hos mennesker.
Her har vi avgrense prosedyren for å ta hud biopsier, dyrking humane fibroblaster og ved hjelp av detaljerte protokoller for viktige mikroskopiske teknikker for å definere mitokondrie fenotyper. Disse ble brukt til å undersøke ulike funksjoner knyttet til PD som er relevante for mitokondrie funksjon og dynamikk. Ex vivo, kan mitokondrier bli analysert i forhold til sin funksjon, morfologi, colocalization med lysosomer (organelles nedverdigende dysfunksjonelle mitokondrier) og nedbrytning via lysosomal vei . Disse fenotyper er svært relevant for identifisering av tidlige tegn på PD og kan gå forut kliniske motoriske symptomer i menneskelig sykdom-genet. Derfor kan analysene som presenteres her brukes som verdifulle verktøy for å identifisere patologiske trekk ved neurodegeneration og bidra til å definere nye terapeutiske strategier i PD.
Pasient hudfibroblaster som ex vivo-modeller representerer et viktig verktøy for å karakterisere sykdomsassosierte genetiske defekter. I tillegg, hud-avledede fibroblaster er lett tilgjengelige og kan utvides ved dyrkning. Derfor, primære celler oppnådd fra pasienter som frakter PD-assosierte genetiske mutasjoner er å foretrekke fremfor bruk av tumorcellelinjer som de inneholder ikke bare den endogene sykdomsfremkallende genet, men hele genetiske bakgrunnen for berørte enkelte. Videre har de vist seg å f…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Fritz Thyssen Foundation (10.11.2.153 til RK), den tyske Research Council (DFG, KR2119/3-2 og KR2119/8-1 til RK), den føderale departementet for utdanning og forskning (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 til RK) og av en doktor stipend fra den veldedige Hertie Foundation [til LFB]. Vi takker Carolin Obermaier og Julia Westermeier for deres støtte under videoen skyte.
Name of reagent | Company | Catalogue no. |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.