Fibroblaster från patienter som bär mutationer i Parkinsons sjukdom som orsakar gener utgör en lättillgänglig<em> Ex vivo</em> Modell för att studera sjukdomar associerade fenotyper. Levande cell imaging ger möjlighet att studera morfologiska och funktionella parametrar i levande celler. Här beskriver vi framställningen av mänskliga fibroblaster och efterföljande övervakning av mitokondriella fenotyper.
Parkinsons sjukdom (PS) är den näst vanligaste rörelsestörning och drabbar 1% av befolkningen äldre än 60 1. Eftersom åldrande är den viktigaste riskfaktorn, kommer fall av PD öka under de närmaste årtiondena 2. Bredvid patologisk proteinveckning och försämrade protein vägar nedbrytning har förändringar av mitokondriernas funktion och morfologi pekades ut som ytterligare kännetecken för neurodegeneration i PD 3-11.
Efter år av forskning i murina och humana cancerceller som in vitro-modeller för att dissekera molekylära vägar för parkinsonism, har användningen av humana fibroblaster från patienter och lämpliga kontroller som ex vivo-modeller blivit ett värdefullt instrument för forskning om potentiella förbehåll beaktas. Annat än odödliggjorda ganska artificiella cellmodeller, primära fibroblaster från patienter som bär sjukdom-associerade mutationer speglar uppenbarligen viktiga patologiska drag of den mänskliga sjukdomen.
Här har vi avgränsa förfarandet för att ta hudbiopsier, odling humana fibroblaster och använda detaljerade protokoll för viktiga mikroskopiska tekniker för att definiera mitokondriella fenotyper. Dessa användes för att undersöka olika funktioner i samband med PD som är relevanta för mitokondriell funktion och dynamik. Ex vivo kan mitokondrier analyseras i termer av deras funktion, morfologi, samlokalisering med lysosomer (de organeller förnedrande dysfunktionella mitokondrier) och nedbrytning via lysosomala vägen . Dessa fenotyper är högst relevanta för identifieringen av tidiga tecken på PD och kan föregå kliniska motoriska symtom i mänskliga sjukdomar genbärare. Därför kan de analyser som presenteras här kan användas som värdefulla verktyg för att identifiera patologiska funktioner i neurodegeneration och hjälper till att definiera nya terapeutiska strategier PD.
Patientens hud fibroblaster som ex vivo-modeller utgör ett viktigt verktyg för att karakterisera sjukdomsassocierade genetiska defekter. Dessutom, hud-härledda fibroblaster är lättillgängliga och kan utökas vid odling. Därför, primära celler erhållna från patienter som bär PD-associerade genetiska mutationer är att föredra jämfört med användningen av tumörcellinjer eftersom de innehåller inte bara den endogena sjukdomsorsakande genen, men hela den genetiska bakgrunden av den drabbade individ…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från Fritz Thyssen stiftelsen (10.11.2.153 till RK), den tyska forskningsrådet (DFG, KR2119/3-2 och KR2119/8-1 till RK), det federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF , NGFNplus, 01GS08134 till RK) och av en doktorand stipendium från välgörande Hertie stiftelsen [till LFB]. Vi tackar Carolin Obermaier och Julia Westermeier för deras stöd under videoinspelning.
Name of reagent | Company | Catalogue no. |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.