Summary

Een bepaling voor de permeabiliteit van de zebravis embryonale neuroepitheel

Published: October 24, 2012
doi:

Summary

We beschrijven een levende hele dier kwantitatieve meting voor de permeabiliteit van de embryonale zebravis hersenen. De techniek analyseert het vermogen om cerebrospinale vloeistof en moleculen met verschillende molecuulgewichten te behouden in de neurale buis lumen en meten hun beweging van de ventrikels. Deze methode is nuttig voor het bepalen van verschillen in epitheliale permeabiliteit en rijping tijdens ontwikkeling en ziekte.

Abstract

De hersenen ventriculaire systeem geconserveerd is tussen gewervelde en bestaat uit een reeks onderling verbonden holten genaamd hersenventrikels, die bij het vroegste stadium van de ontwikkeling van de hersenen en worden gedurende het leven van het dier. De hersenen ventriculaire systeem wordt gevonden in vertebraten en de ventrikels ontwikkelen na neurale vaatvorming Wanneer de centrale lumen gevuld met cerebrospinale vloeistof (CSF) 1,2. CSF is een eiwitrijke vloeistof die essentieel is voor normale ontwikkeling van de hersenen en functie 3-6.

In zebravis, hersenventrikel inflatie begint circa 18 uur na de bevruchting (HPF) na de neurale buis is gesloten. Meerdere processen worden geassocieerd met hersenventrikel vorming, met inbegrip van de vorming van een neuro-epitheel, tight junction formatie die permeabiliteit en CSF productie reguleert. We toonden aan dat het Na, K-ATPase vereist voor hersenventrikel inflatie invloed al deze werkwijzees 7,8, terwijl claudin 5a is noodzakelijk voor tight junction vorming 9. Bovendien toonden we aan dat "relaxatie" van de embryonale neuro-epitheel, via remming van myosine, wordt geassocieerd met hersenventrikel inflatie.

Om de regeling van de permeabiliteit tijdens zebravis hersenventrikel inflatie te onderzoeken, ontwikkelden we een ventriculaire kleurstof retentie-test. Deze methode gebruikt hersenventrikel injectie in een levende zebravis embryo, een techniek eerder ontwikkeld in ons laboratorium 10 om fluorescerend label de cerebrospinale vloeistof. Embryo's worden vervolgens afgebeeld in de tijd als de fluorescente kleurstof zich door de hersenen ventrikels en neuro-epitheel. De afstand voor de kleurstof zich van de basale (niet-luminale) van de neuroepitheel tijd wordt gekwantificeerd en is een maat neuroepitheliale permeabiliteit (figuur 1). Wij merken op dat kleurstoffen 70 kDa en kleinere zal bewegen door de neuro-epitheel en kan detected buiten de embryonale zebravis hersenen op 24 hpf (figuur 2).

Deze kleurstof retentie assay kan worden gebruikt om neuro permeabiliteit analyseren in een verschillende genetische achtergronden, op verschillende momenten tijdens de ontwikkeling en na milieu verstoringen. Het kan ook nuttig zijn in de behandeling van pathologische accumulatie van CSF. Over het geheel genomen deze techniek kunnen onderzoekers de rol en regulering van permeabiliteit te analyseren tijdens de ontwikkeling en ziekte.

Protocol

1. Voorbereiding voor Micro-injectie Bereid micro-injectie naalden door te trekken capillaire buizen met behulp van Sutter instrumenten naald trekker. Load micro-injectie naald met fluorescerende kleurstof (FITC-dextran). Monteer de naald op micromanipulator en micro-injectie apparaat. Voorzichtig breken micro-injectie naald met behulp van een tang om ongeveer 2 um in breedte, zal dit echter variëren afhankelijk van uw microinjector setup. Voor onze microinjectie naalden, komt d…

Discussion

We tonen dat zij permeabiliteit van de levende embryonale zebravis hersenen kwantificeren bepaald voor een kleurstof geïnjecteerd van een bepaald molecuulgewicht. Onze observatie dat de embryonale zebravis neuroepitheel is differentieel doorlaatbaar voor kleurstoffen van verschillende moleculaire gewichten suggereert dat de kleurstof beweegt via paracellulaire permeabiliteit. We kunnen echter niet uitsluiten dat de mogelijkheid van een transcellulaire bijdrage aan de waargenomen permeabiliteit. Deze techniek kan worden…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Geestelijke Gezondheid en National Science Foundation. Speciale dank aan Sive lab leden voor vele nuttige discussies en opbouwende kritiek, en Olivier Paugois voor deskundige vis veeteelt.

Materials

Name of Reagent Company Catalogue number
Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen D7136, D7137, D1822, D1820, D1845
Tricaine powder Sigma A5040
Capillary Tubes FHC Inc. 30-30-1

References

  1. Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
  2. Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
  3. Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
  4. Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
  5. Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
  6. Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
  7. Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
  8. Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
  9. Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
  10. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. J. Vis. Exp. , (2009).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).

Play Video

Cite This Article
Chang, J. T., Sive, H. An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (68), e4242, doi:10.3791/4242 (2012).

View Video