Summary
Biz embriyonik zebrafish beyin geçirgenliği için canlı bir bütün hayvan kantitatif ölçümü tarif. Tekniği nöral tüp lümeninde farklı molekül ağırlıklarında beyin omurilik sıvısı ve molekülleri korumak için yeteneği analiz ve ventriküllerin kendi hareketini rakamlarla. Bu yöntem, gelişme esnasında ve hastalık epitel geçirgenlik ve olgunlaşma farklılıkları belirlemek için yararlıdır.
Abstract
Beyin ventriküler sistemi omurgalılar arasında muhafaza edilir ve beyin gelişiminin erken aşamalarında oluşturmak ve hayvanın hayatı boyunca korunur beynin ventrikül adı birbirine boşlukları bir dizi oluşur. Beyin ventriküler sistemi omurgalılarda bulunan ve karıncıklar merkez lümen beyin omurilik sıvısı (BOS) 1,2 ile dolduğunda, nöral tüp oluşumu sonra geliştirmektir. BOS normal beyin gelişimi ve işlevi için gerekli olan 3-6 ve proteinden zengin bir sıvıdır.
Nöral tüp kapandıktan sonra zebrafish, beyin ventrikül enflasyon, yaklaşık 18 saat sonrası fertilizasyon (HPF) başlar. Birden süreçler nöroepitelyumda oluşumu, geçirgenlik ve BOS üretimini düzenleyen sıkı kavşak oluşumu dahil beynin ventrikül oluşumu ile ilişkilidir. Bütün bu işlem etkileyen, Na, K-ATPaz beyin ventrikül şişirme için gerekli olduğunu göstermiştirClaudin 5a sıkı birleşim oluşum 9 için gerekli olan süre ES 7,8,. Ayrıca, en miyozin inhibisyonu yoluyla, embriyonik epitele bu "gevşeme" gösterdi beyin karıncık şişirme ile ilişkilidir.
Zebrafish beynin ventrikül şişirme sırasında geçirgenliği düzenlendiğini incelemek için, bir ventriküler boya tutma testi geliştirdi. Bu yöntem, floresan beyin omurilik sıvısı etiketlemek için, oturma zebrafish embriyo, önceden laboratuarımızda 10 yılında geliştirilen bir teknikle beyin ventrikül enjeksiyon kullanır. Embriyolar sonra beyin ventriküller ve nöroepitelyumda aracılığıyla floresan boya hamle olarak zamanla görüntülü. Mesafe boya ön ölçülür uzağa saat boyunca epitele ve bazal (non-luminal) tarafından taşınır ve nöroepitelyal geçirgenlik bir ölçüsüdür (Şekil 1). Biz boyalar 70 kDa ve küçük nöroepitelyumda hareket edeceğini gözlemlemek ve detecte olabilir24 hpf (Şekil 2) embriyonik zebrafish beyin dışında d.
Bu boya tutma analiz gelişimi esnasında farklı zamanlarda, farklı genetik yapısının çeşitli nöroepitelyal geçirgenlik analiz etmek için kullanılır, ve çevresel düzensizliklerin sonrasında olabilir. Aynı zamanda, CSF patolojik birikim incelenmesinde yararlı olabilir. Genel olarak, bu teknik araştırmacılar, gelişme esnasında ve hastalık geçirgenlik rolü ve düzenleme analiz etmeyi sağlar.
Protocol
1. Mikroenjeksiyon için hazırlık
- Sutter araçlar iğne çektirmenin kullanarak kılcal tüpler çekerek mikroenjeksiyon iğneler hazırlayın.
- Floresan boya ile Yük mikroenjeksiyon iğnesi (FITC-Dekstran).
- Mikromanipülatör ve mikroenjeksiyon aparat üzerine iğne takın.
- Dikkatlice genişliği yaklaşık 2 mikron için forseps kullanarak mikroenjeksiyon iğne kırmak, ancak bu sizin mikroenjektör kurulum bağlı olarak değişecektir. Bizim mikroenjeksiyon iğneler için, bu Bükmez ucundan iğnenin birinci bölgeye karşılık gelir.
- Her enjeksiyondan 1 nl sunar, böylece enjeksiyon zamanı ve basınç ayarlama, yağ damlacık çapı ölçün. Harvard Apparatus mikroenjektör için örnek ayarlar şunlardır: P dengesi = 1.4 psi, p = 1.4 psi üzerinden, P 0,4-0,7 sn bir enjeksiyon süresi ile = 22.9 psi, p net = 67,8 psi enjekte. Bu ayarları kullanarak bizim iğne çapı yaklaşık 2 mikron. Bununla birlikte, belirli ayarlar mikroenjektör olabilir, ve bir değişiklik gösterecektiriğne çapı ccording.
2. Embriyolar hazırlanması
- Coat 2, her durum için su içinde% 1 agaroz ile yemekler, 1-200 ul pipet ucu ile agaroz içine gedikler açar ve agaroz tıpaları çıkarın. Embriyo medya ile yemekler doldurun.
- Kullanma forseps, bir stereomikroskop altında 18 hpf veya yaşlı dechorionate embriyolar. Embriyolar Kimmel ve diğerleri göre sahnelenir. 11.
- İlk agaroz kaplı çanak içine dechorionated embriyolar transfer.
- Embriyolar (12 Westerfield göre yapılmıştır) hareketli bırakana kadar embriyo uyuşturmak için, çanak tricaine (0.1 mg / ml) ilave edilir.
3. Beyin Ventrikül enjekte
- Orient embriyolar böylece deliğe embriyonun kuyruk koyarak onların dorsal tarafına bakıyorsun. Mikromanipülatör da sağ tarafta ise ön beyin sağa sola ve arka beyin için olacak şekilde, daha sonra embriyo hareket eder.
- Wi Pozisyon iğnearka beyin ventrikül dest noktası.
- Sarısı (Şekil 1A) içine beynin derinliği boyunca gitmek emin olmak arka beyin ventrikül dikkatlice pierce tavan plakası.
- Boya beynin ventriküllerin bütün uzunluğu doldurur emin ventriküllerin içine floresan boya 1-2 nl enjekte edilir.
- Embriyo medya ile dolu ikinci agaroz kaplı çanak embriyo transferi ve yeniden uyutmak gibi 2.4 nitelendirdi.
- HEMEN gibi bir zaman sıfır görüntü elde etmek için 4. bölümde açıklanan görüntüleme başlatmak.
4. Görüntüleme
- Delikte kendi kuyruğu ile Orient embriyolar gibi 3.1 'de açıklanan.
- Bir aydınlık dorsal görüntü çekmek için gönderilen ve floresan hem ışık ile bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Farklı embriyoların görüntüleme arasındaki büyütme sabit tutun. Bu görüntü J (5,2-6) kullanılarak yapılan analizler, doğrudan karşılaştırma için olanak sağlar.
- Embriyo mikroskop veya çanak HAREKETLİ OLMAKSIZIN, bir alilgili floresan görüntü.
- İstediğiniz zaman noktalarında her bir embriyo için yineleyin.
5. Boya Hareketi Kantitasyonu
- Önceden Gutzman ve Sive 10 tarafından açıklandığı gibi Photoshop aydınlık ve floresan görüntüler Birleştirme.
- Mesafe mevcuttur Image J yazılımı boya ön hamle ölçün http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
- Görüntü J ve nöroepitelyumda bir 10-20 ° açı (Şekil 1A) de ön boyatmak önbeyin menteşe noktasından bir çizgi çizmek için satırı aracını kullanabilirsiniz Aç birleştirilmiş dosya. Bu vahşi tip epitele dışarı çıkması boyanın ilk ve en göze çarpan yer olduğu için bu bölge seçildi.
- Hat uzunluğunu hesaplamak için ölçüm aracı seçin.
- Her zaman noktası için yineleyin.
- Boya ön diğer zaman noktalarından t = 0 anında mesafe çıkarılarak zamanla taşındı net mesafe hesaplayın.
- Üzerinde Çizgrafiği.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Yabani tip embriyoları kullanılarak bir nöroepitelyal geçirgenlik deneyinde elde edilen sonuçlar arasında bir örneği Şekil 1B-B 'de gösterilmiştir. Doğru geçirgenliği ayırt etmek için, bu vahşi tip veya kontrol embriyolar (Şekil 2) sadece biraz sızdıran bir boyut tanımlamak farklı moleküler weightsto ile boyalar sınamak yararlıdır. Bu genetik mutantlar veya çevre koşullarının belirlenmesi için izin verdiği ya da artış veya azalma geçirgenliği (Şekil 1D, yeşil ve kırmızı çizgiler sırasıyla). 24 hpf zebrafish nöroepitelyumda için, 70 kDa FITC Dekstran sızıntıları yavaş 2 saat boyunca, 2.000 kDa yapmaz ve hemen 10 kDa sızıntıları dışarı oysa. Bu nedenle 70 kDa iki artış ve nöroepitelyal geçirgenliğini azaltmak olduğunu koşulları tanımlamak için ideal bir moleküler ağırlığı.
Iğne ventriküler lümen, floresans w kaçırırsahasta t beyin dışında görünür = 0 (örneğin Gutzman ve Sive, 2009 10 bakınız). Enjekte boya başlangıçta beynin içindeki değildi ve neuropeithelium ve boya ve permeabilite dolaşımına ilişkin net bir sonuca yapılamaz çünkü bu embriyoların atılmalıdır.
Nihayet, embriyolar önceden floresan boya enjeksiyonu yapılabilir küçük ventriküller veya un-şişirilmiş beyin ventriküller, bir tuz çözeltisi ile ventriküllerin ön enjeksiyon varsa. Bu floresan boya ile enjekte ederken kolay ventriküllerin sonraki görselleştirme yapmak ventriküller şişirir. Uygun kontroller salin enjeksiyonu, normal nöral tüp gelişimi bozar olup olmadığını belirlemek için yapılmalıdır.
Şekil 1. Farklı molekül ağırlığı boyalar zamanla seyri. (A) Deneysel Diyagramı. Ilk, Floresan boya ventriküller içine enjekte edilir. X enjeksiyon için iğne = pozisyonu. Sonraki dorsal görüntüler zamanla yakalanır. Sonunda, mesafe menteşe noktası (bir kırmızı çizgi ile temsil edilir) ölçülür önbeyin gelen boya ön tarafından taşındı. (BC) 22 HPF (t = 0 dakika, B) ve HPF 24 (t = 120 dak, C) Aydınlık ve floresan dorsal görüntü birleştirilmiştir. Beyaz çizgi önbeyin ventrikülden boya ön mesafeyi gösterir. (D) Varsayımsal örnek geçirgenliği veri. Mavi = vahşi tip veya denetimleri, kontrol grubuna göre artmış geçirgenlik azalmıştır kontrol göreli geçirgenlik ve yeşil = örneği ile kırmızı = örnek.
Şekil 2. Farklı molekül ağırlığı boyalarını nöroepitelyal geçirgenliği ölçümü. (AE) Dorsal Birleştirilmiş aydınlık ve t 22 hpf vahşi tip embriyo floresan görüntüler = 0 dak FITC-d ile enjeksiyon sonrası10 kDa (A), 40 kDa (B), 70 kDa (C), 500 kDa (D) ve 2,000 kDa (E): aşağıdaki molekül ağırlıklarında Extran. T = 24 hpf az 120 dak olarak (A'-E ') aynı embriyo (AE). Sola Anterior. F = önbeyin, M = orta beyin, H = arka beyin. Asterisk = kulak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu, belirli bir moleküler ağırlığa sahip bir enjekte boya için kararlı olarak bir oturma embriyonik zebrafish beyin geçirgenliğini ölçmek için yeteneğini gösterir. Embriyonik zebrafish nöroepitelyumda molekül ağırlıkları farklı boyalar değişik şekillerde geçirgen olduğunu Bizim gözlem boya paracellular geçirgenliği ile hareket ettiğini göstermektedir. Ancak, gözlenen geçirgenliği bir transsellüler katkı olasılığını ekarte edemez. Bu teknik, tüpün iç ve dış hem de görülebilir ve lümen enjekte edilebilir olduğu sürece herhangi bir başka tüp şekilli yapı ile uygulanabilir. Ancak, diğer organlar için ideal molekül ağırlığı belirlenmesi bu dokular ve gelişim aşamaları arasında değişebilir olarak tespit edilmesi gerekir.
Bu testte lümen enflasyon ve lümen boyutu düzenlenmesi sırasında epitelyal permeabilite rolünü içine daha fazla araştırma sağlayacaktır. Buna ek olarak, bu yöntem o olacaklp tür hidrosefali ve polikistik böbrek hastalığı gibi hastalıklarla ilişkili epitelyal permeabilite değişimleri karakterize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Uzman balık yetiştiriciliği için çok faydalı tartışmalar ve yapıcı eleştiri, ve Olivier Paugois için Sive laboratuar üyelerine özel teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
- Gutzman, J. H., Sive, H.
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).
