Summary
Die meisten Studien über Herpes Hornhauterkrankung verwenden Primärinfektion Modell. Allerdings bedeutet primäre Infektion mit HSV-1 in der Regel nicht für die menschliche Erkrankung führen. Hier beschreiben wir ein wiederkehrendes Muster von herpetischer korneale Erkrankung, die näher Verhalten menschlicher Erkrankung.
Abstract
Herpetic Augenkrankheit, genannt Herpes Stromakeratitis (HSK), ist ein potentiell blendenden Infektion der Hornhaut, die zu über 300.000 klinische Besuche pro Jahr für die Behandlung. Zwischen 1 und 2 Prozent der Patienten mit klinischer Erkrankung erleben Verlust des Sehvermögens der infizierten Hornhaut. Die überwiegende Mehrheit dieser Fälle sind die Folge der Reaktivierung einer latenten Infektion durch Herpes simplex-Virus Typ I und nicht aufgrund einer akuten Erkrankung. Interessanterweise ist die akute Infektion das Modell häufig verwendet, um diese Krankheit zu studieren. Es wurde jedoch das Gefühl, dass ein immer wiederkehrendes Modell HSK wäre reflektiert, was geschieht, während der klinischen Erkrankung. Die wiederkehrenden Tiermodelle für HSK haben beide Kaninchen und Mäuse eingesetzt. Der Vorteil von Kaninchen ist, dass sie erleben Reaktivierung aus der Latenz abwesend alle bekannten Reiz. Das heißt, es ist schwierig, die Rolle, die viele immunologische Faktoren bei rezidivierendem HSK spielen zu erforschen, weil die Kaninchen-Modell nicht die immungische und genetische Ressourcen, die Maus hat. Wir wählten das Mausmodell für wiederkehrende HSK verwenden, weil es den Vorteil davon, dass es viele Ressourcen zur Verfügung hat und auch wir wissen, wann die Reaktivierung wird auftreten, da die Reaktivierung durch Bestrahlung mit UV-B-Licht induziert wird. Bisher hat dieses Modell der Laboratorien verwenden darf es zu mehreren immunologischen Faktoren, die wichtig für diese Erkrankung sind zu definieren. Es hat uns auch die Möglichkeit, sowohl therapeutische und Wirksamkeit des Impfstoffes zu testen.
Protocol
Animal Care Hinweis: Analgetika werden in diesem Modell nicht verwendet, da sie entzündungshemmend und sind somit würde das Modell ungültig.
Ein. Herstellung von Virus
- Wachsen HSV-1 in Vero-Zellen (80% konfluent) mit einem ausgehend von 0,01 Verdünnung Infektionsmultiplizität (in T-150-Kolben, etwa 5 x 10 5 Plaque-bildende Einheiten) für 3-4 Tage, bis alle Zellen abgerundet-up und sind leicht durch das Drücken der Flasche verdrängt.
- Entfernen Sie das Medium in sterile Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge Sorvall Legend RT bei 4 ° C und 3.500 rpm für 15 min. Nach dem Entfernen Überstand (siehe 1.3), resuspendieren großen Pellets aus je 50 ml Röhrchen mit 5 ml Medium total. Beschallen für 1 min in zwei 30 sec platzt.
- Überstand abnehmen und in 50 ml steriler Oak Ridge Rohren und Zentrifuge bei 9000 rpm, 1 Stunde lang bei 4 ° C in einer Beckman J2-21 Zentrifuge. Dies ist, um eine kleine virale Pellet herzustellen. Überstand verwerfen.
- Kombinieren Sie beschallen von 1,2 with Pellet aus 1,3 und beschallen wieder für 45 Sekunden. Zentrifuge Sorvall RT Legende bei 1.500 UpM für 5 min bei 4 ° C. Speichern Sie den Überstand. Dies stellt das Virus Lager, die aliquotiert und bei -70 ° C gelagert
- Titer Virus auf Vero-Zellen. Ich in der Regel Platte 10 0 bis 10 -8 Verdünnung (jeweils eine 10-fache Verdünnung) 2x aus 2 separate Verdünnung Sets. Titration des Virus auf 12-Well-sterile Platten durchgeführt.
2. Maus Infektion
- Injizieren jede Maus mit 0,1 ml des Narkosemittels cocktail/20 g Maus Körpergewicht (Ketamin 60 mg / kg Xylazin + 5 mg / kg, die in HBSS verdünnt wird). Dieser Cocktail verwendet wird, weil es eines der sichersten Mittel der Narkose, wenn eine ordnungsgemäße Dosierungen verwendet werden, und die Auswirkungen dieser Droge sind sehr kurzlebig ist.
- Wenn Mäuse anästhesiert sind Kratzer auf der Hornhaut des rechten Auges mit einer 30-Gauge-Nadel mit einem Präpariermikroskop um sicherzustellen, dass die Hornhaut nicht perforiert ist.
- Jede Maus receIved eine intraperitoneale Injektion von 1 ml gepooltes humanes Serum (Sigma, Temecula, CA; Anti-HSV Reaktivität mit einer wirksamen Dosis für 50% Neutralisation der viralen 1:800), um vor einer Beschädigung während Hornhäute primären Infektion zu schützen.
- Anzahl der Mäuse entweder mit Ohrbügel oder nach Gehör Punsch.
- Nach all der Mäuse wurden nummeriert; mit einem 20 ul Pipette, infizieren wir jedes Auge mit 10 6 PFU (5 ul). Wir infizieren nur ein Auge und in der Regel das rechte Auge. Wir legen auch 5 ul HBSS auf das andere Auge zu feucht halten, während sie betäubt sind. 5 ul ausreicht, um die Hydratisierung der Augen zu halten, da die Verfahren in weniger als 10 min durchgeführt, und die Tiere werden mit Anästhetikum dosiert entsprechend. Infektion wird durch Abtupfen Mäuse 3 Tage nach der Infektion mit einer sterilen hydratisierten Baumwolle Applikator, in 1 ml Vero Medien wurde bestätigt. Dann wurden 100 ul wird Vero-Zellen in 48-well Platten kultiviert zugegeben. Diese Platten werden täglich überwacht für zytopathischen Effekte (Cpe).
3. Reaktivierung der Mäuse aus Latency
- Mäuse sind betäubt mindestens 5 Wochen nach der primären Infektion. Es sei angemerkt, dass wir Mäuse reaktiviert bis zu einem Jahr nach Primärinfektion und haben keinen signifikanten Unterschiede in Reaktion beobachtet werden.
- Sobald sie anästhesiert TM20 Chromato-Vu Transilluminator, der UV-B emittiert bei einer Spitzenwellenlänge von 302 nm, so dass nur ein einzelnes Auge auf die UV-B-Licht ausgesetzt ist, platziert. Jede Maus auf 250 mJ von UV-B-Licht cm 2 belichtet.
- Reaktivierung durch Abtupfen Augen mit einer sterilen Watteträger, die zuerst in 1 ml Vero Medien am Tag 0 gesetzt (vor UV-B-Exposition für spontane Ausscheider kontrollieren) und dann an den Tagen 1 bis 7 post-UV-B-Bestrahlung bestimmt. Der Tupfer Material wird bewertet, wie in 2.5 beschrieben). Für die Abstriche, die infektiöse Virus haben die Virusmenge wird durch ein Standard-Plaque-Assay mit 12-Well-Platten kicherten.
- Mäuse werden zur klinischen Augenerkrankung durch einen maskierten Beobachter unter Verwendung einer binokularen Präpariermikroskop ausgewertet.
- Hornhauttrübung auf einer Skala von 0 bis 4, wobei 0 bedeutet, klare Stroma bewertet, ein mildes Stromazellen Trübung zeigt, 2 mäßig Opazität zeigt mit erkennbaren Merkmalen Iris, zeigt 3 dichte Opazität unter Verlust von Iris definiert Detail außer Pupille Ränder, und 4 zeigt Insgesamt Deckkraft ohne Ansicht von dorsal.
- Neovaskularisation wird auf einer Skala von 1 bis 8 durch Teilen der Hornhaut in 4 gleiche Quadranten und Bestimmen des Ausmaßes der Vaskularisierung in jedem dieser Quadranten bewertet.
- Blepharitis wird wie folgt gemessen: 0, keine Läsionen, 1, minimal Augenlid Schwellung; 2, mäßige Schwellung und knusprigem Augenausfluss, 3, starke Schwellung, mäßige periokuläre Haarausfall und Hautveränderungen und 4, starke Schwellung mit den Augen verkrusteten geschlossen, schwere periokuläre Haarverlust und Hautläsionen.
- Der Nachweis der Enzephalitis Inclusionded zurück, gebeugt zerzausten Haaren und offensichtliche neurologische Anomalien. Mäuse sind eingeschläfert, wenn sie deutliche Anzeichen von Encephalitis anzuzeigen.
5. Repräsentative Ergebnisse
Das Modell, das wiederkehrende oben beschrieben wurde zuerst von Shimeld, et al. 1-3. Sie getestet und unserem Labor wurde mit einer modifizierten Version dieses Modells auf viele Manuskripte über die Jahre 4-15 veröffentlichen. Das Modell wurde verwendet, um die Rolle zu definieren, dass das Zytokin Interferon-γ spielt bei rezidivierenden HSV-1 Krankheit 10. Wie in Abbildung 3 gezeigt, hat Mäusen IFNgamma angezeigt schlimmer Hornhauterkrankung als Wildtyp-Mäusen 14. Es wurde auch erfolgreich auf den therapeutischen Wert von mehreren unterschiedlichen Vakzin-Konstrukte 6,10,11 definieren. Beachten Sie, dass in einem Fall der Impfstoff getestet gut funktioniert aber nicht prophylaktisch erweisen therapeutisch wirksame 6. Jedochwenn ein Replikations-inkompetent viraler Impfstoff getestet wurde, war es nicht nur wirksam, prophylaktisch, war aber auch sehr effektiv therapeutisch 10,11, siehe Abbildung 5 in Referenz 10. Vor kurzem haben wir dieses Modell verwendet werden, um festzustellen, ob Unterschiede zwischen den Geschlechtern bei Mäusen unterzogen wiederkehrende HSK nachweisbar waren. Wie Abbildung 1 zeigt, zeigen männliche C57BL / 6 Mäuse deutlich weniger Hornhauttrübung als weibliche C57BL / 6 Mäusen. Ebenso, wenn cornealer Neovaskularisierung wurde ausgewertet, nachgewiesen männlichen Mäusen signifikant weniger neue Gefäßwachstum in der Hornhaut als tat weiblichen Mäusen (Abbildung 2). Wir testen derzeit, ob dieser Phänotyp stammspezifische indem ähnliche Analyse in anderen Stämmen von Mäusen ist. Wir werden auch bestimmen, ob der Unterschied aufgrund des Fehlens von Testosteron oder der Gegenwart von Östrogen ist.
Abbildung 1. Corneal Krankheit in männliche und weibliche C57BL / 6 Maus-Stämme nach der UV-B induzierte Reaktivierung. Latent infizierten Mäusen induziert wurden mit UV-B-Bestrahlung und Mäuse wurden für Hornhauttrübung für 35 Tage überwacht reaktivieren. Die Zahl der Mäuse für diese Studien verwendet wurden, waren wie folgt: Männchen, n = 15; Weibchen n = 15. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert ± SEM. * Es war signifikant größer Virus-induzierte Erkrankung weibliche C57BL / 6 Mäuse für Tage 14-35 (P = 0,001 bis 0,01).
Abbildung 2. Corneal Krankheit in männliche und weibliche C57BL / 6 Maus-Stämme nach der UV-B induzierte Reaktivierung. Latent infizierten Mäusen induziert wurden mit UV-B-Bestrahlung und Mäuse wurden für korneale Neovaskularisierung für 35 Tage überwacht reaktivieren. Die Zahl der Mäuse für diese Studien verwendet wurden, waren wie folgt: Männchen, n= 15; Frauen, n = 15. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert ± SEM. * Es war signifikant größer Virus-induzierte Erkrankung weibliche C57BL / 6 Mäuse für Tage 14-28 (P = 0,001 bis 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die wiederkehrende Modell Herpes Stromakeratitis (HSK) hier beschrieben ermöglicht die Ermittler auf die menschliche HSK in einem Modell, das mehr im Einklang mit dem, was während der Krankheit beim Menschen beobachtet wird, zu studieren. Somit sind das Modell der Stärken, die Krankheit im Zusammenhang mit einer Immunsystem, das bereits durch stimulierte während primäre Erkrankung auftritt. Da diese Mäuse bereits eine Immunantwort gegen HSV-1 hat, sind die Faktoren, die diese Immunantwort zu reaktivieren wahrscheinlich verschieden von denen, die es ursprünglich erzeugt. Daher wird eine therapeutische Intervention zur primären HSK verhindern nicht immer, um eine Besserung der wiederkehrenden HSK führen, die wir in verschiedenen Publikationen dargestellt bei der Auswertung Unterschiede zwischen primären und rezidivierenden HSK 6,8,10-13,15. Wie zuvor angedeutet, ist dies insbesondere dann der Fall, wenn die Entwicklung von Impfstoffen für die menschliche HSK verhindern. Die meisten Impfstoffe werden an der Entwicklung einer primären HSK aber sehr wenige erwiesen sich als wirksam bei der Verringerung recurrent HSK 6,10,11.
Die Schwächen dieses Modells ist, dass es viel länger dauert, bis ein Experiment durchzuführen. Es ist ein fast 6 Wochen nach Erstinfektion während die Mäuse latent infiziert und die verabreichte Humanserum metabolisiert wird. Darüber hinaus werden nicht alle Mäuse, die latent infiziert sind nachweisbare Virus in den Tränenfilm des infizierten Auge werfen. Dies bedeutet nicht, dass sie nicht zu reaktivieren, nur, dass wir nicht erkennen kann ihre Reaktivierung durch Kultivierung Virus. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die meisten, wenn nicht alle Mäuse nicht reaktivieren sondern dass sie produzieren keine ausreichende Zahl von Virus durch Plaque-Assay nachgewiesen werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Jay Pepose zu helfen lehrt das Modell bei uns zu bedanken. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) und einer uneingeschränkten Finanzhilfe aus Forschung zur Blindheit zu Department of Ophthalmology Prevent unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Human Serum | Sigma | S7023 | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-C1 | |
| Pen/ Strep | Sigma | P4333 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Centrifuge | Beckman | 52-21 | |
| Transilluminatior | UVP | 95-0452-02 | |
| Sonicatior | Branson | Sonifier 450 | |
| Oak Ridge Tubes | Nalgene | Z 720410 | |
| Flasks- 7150 | Corning | 430823 | |
| Plates- 12 well | Corning | CLS 3513 | |
| Plates- 48 well | Corning | CLS 3548 | |
| Sterile Conical Tubes- 30 ml | Corning | CLS 430828 | |
| Sterile Cotton-tipped Applicators | Fisher | 23-400-125 | |
| 30G Needles | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 25G Needles | BD | 305122 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 |
References
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice. Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice. J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system. J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).
- Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).
- Keadle, T. L., Stuart, P. M. IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis. Microbial Path. 38, 13-21 (2005).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice. J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice. Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).
- Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis. Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. Microbial Path. 32, 255-262 (2002).
- Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection. J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection. Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).
- Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection. Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).
- Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis. Virology. 380, 46-51 (2008).
- Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways. J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).
