Summary
Klinisch relevante Tiermodelle Hirnblutung (ICH) sind notwendig, um unser Wissen über hämorrhagischen Schlaganfall zu erweitern und neue therapeutische Strategien zu untersuchen. In dieser Studie beschreiben wir und auswerten beiden ICH Modelle einseitige Injektionen von entweder autologe Vollblut oder bakteriellen Collagenase in den Basalganglien (Corpus striatum) von Mäusen implementieren.
Abstract
Spontane Hirnblutung (ICH) definiert eine potenziell lebensbedrohliche neurologische Krankheit, die für 10-15% aller Schlaganfall-bedingten Hospitalisierungen und für die keine wirksame Behandlungen stehen zur Verfügung, um 1,2 date ausmacht. Aufgrund der Heterogenität der ICH beim Menschen, werden verschiedene präklinische Modelle benötigt, um gründlich zu erforschen Interessenten therapeutische Strategien 3. Experimentelle ICH wird häufig in Nagetieren durch intraparenchymal Injektion von Eigenblut oder bakterielle Kollagenase 4 induziert. Die entsprechenden Muster auf der Basis der Pathophysiologie von Hämorrhagie Induktion und Verletzungen Progression besteht. Das Blut Injektion Modell imitiert eine rasch voranschreitende Blutungen. Alternativ bakterieller Kollagenase enzymatisch stört die Basallamina des Gehirns Kapillaren, wodurch eine aktive Blutung, die in der Regel entwickelt sich über mehrere Stunden 5. Resultierenden perihematomal Ödeme und neurofunktionalen Defizite her quantifiziert werdenm beide Modelle. In dieser Studie haben wir beschrieben, ausgewertet und ein modifiziertes Doppeleinspritzung Modell der autologen Vollblut 6 sowie eine ICH Injektionsmodell bakterieller Kollagenase 7, welche beide Target die Basalganglien (Corpus striatum) von männlichen CD-1-Mäusen. Wir untersuchten neurofunktionalen Defizite und Hirnödem bei 24 und 72 Stunden nach ICH Induktion. Intrastriatalen Injektion von Eigenblut (30 ul) oder bakterieller Kollagenase (0.075U) verursacht reproduzierbare neurofunktionalen Defizite bei Mäusen und signifikant erhöhte Hirnödem bei 24 und 72 h nach der Operation (p <0,05). Zusammenfassend liefern beide Modelle konsequente hämorrhagischen Infarkte und stellen grundlegende Methoden für die präklinische ICH Forschung.
Protocol
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der Animal Care und Use Committee an der Loma Linda University.
Ein. Präoperative Vorbereitungen
Aseptische Techniken sind für alle chirurgischen Eingriffe empfohlen. Desinfizieren Sie die stereotaktischen Apparat und bereiten sterile chirurgische Instrumente vor der Operation. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) bei allen tierischen Handhabung. Verwenden Sie ein Heizkissen während der Operation des Tieres physiologischen Körpertemperatur aufrecht zu erhalten.
- Wiegen Sie die 8-12 Wochen alten Maus mit einem Triple-Beam Tierwaage.
- Co-Injektion Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) intraperitoneal dann erlauben Sie 7-10 min für die Anästhesie wirksam (Monitor für eine ausreichende Sedierung).
- Platzieren Sie die Maus auf eine Wärmedecke und rasieren die Kopfhaut.
- Bewerben Augensalbe in beide Augen.
- Sichern Sie dieAtemwege, durch leichtes Bewegen der Zunge seitlich und sorgfältig sichern die Maus den Kopf auf den stereotaktischen Apparat. Hinweis: Der Kopf muss horizontal an der Basis des stereotaktischen Rahmens befestigt werden.
- Desinfizieren Sie die OP-Bereich mit Betadine, und spülen Sie mit 70% Ethanol. Wiederholen alternierenden Anwendungen Betadine und 70% Ethanol für insgesamt dreimal. Wattestäbchen kann für diesen Zweck verwendet werden.
2. Blut Injection Modell
- Machen Sie eine 1 cm lange Inzision der Kopfhaut mit einem # 10 Skalpell.
- Verwenden Sie Wattestäbchen wegzuräumen das weiche Gewebe für den Schädel, um die senkrechte Schnittpunkt der koronalen und sagittalen Naht (bregma) freizulegen.
- Montieren Sie den Hamilton-Spritze (250 ul) auf der Einspritzpumpe und stereotaktisch leiten die Nadel (26 Gauge) über bregma.
- Weiter, stellen Sie die stereotaktische Manipulatorarme um die Nadel 0,2 mm positionieren vorderen und 2mm seitlich nach rechts. Auf diese Koordinaten einen kleinen Schädel Bohrloch, mit einer variablen Geschwindigkeit Bohrer mit einem 1 mm Bohrer.
- Suspend des Tieres Schwanz und desinfizieren seiner unteren Fläche mit 70% Ethanol.
- Punktion der zentrale Schwanzarterie mit einer sterilen Nadel (zB 26 Gauge) und sammelt das arterielle Blut in eine unheparinized Kapillarrohr.
- Übertragen Sie das Blut schnell aus der Kapillare in das Glas Lauf der Hamilton-Spritze, dann legen Sie den Kolben.
- Bringen Sie die jetzt 30 ul oder mehr des arteriellen Blutes, die Hamilton-Spritze auf die Einspritzpumpe und die Nadel (mit seinen abgeschrägten Kante zur Pfeilnaht) durch das Bohrloch nur bis zu seiner Fase ist nicht mehr sichtbar.
- Von diesem Punkt Voraus die Nadel 3 mm ventral und injizieren 5 ul autologen Blut bei einer Geschwindigkeit von 2 pl / min.
- Nach Beendigung der ersten Injektion die Nadel Voraus 0,7 mm weiter in die Tiefe.
- Warten5 min dann spritzen 25 ul Blut in das rechte Striatum.
- Nach Abschluss der zweiten Injektion nun die Nadel in Position für weitere 10 min, Vor dem Abziehen mit einer Geschwindigkeit von 1 mm / min.
- Verschließen Sie die Bohrloch mit Knochenwachs und vernähen die Haut.
- Für postoperative Analgesie injizieren 0,05 mg / kg subkutan an Buprenorphin in vorgewärmter Fluide (normale Kochsalzlösung).
3. Kollagenase Injection Modell
- Nach den präoperativen Vorbereitung, wiederholen Sie die Schritte 1-4 für die Blutinjektion Modell beschrieben.
- Füllen Sie den Hamilton-Spritze (10 ul) mit 0.075U der bakteriellen (Clostridien) Kollagenase VII-S in 0,5 ul Kochsalzlösung gelöst. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.
- Bringen Sie die Hamilton-Spritze auf die Einspritzpumpe und die Nadel (26 Gauge), durch das Bohrloch nur bis zu seiner Fase ist nicht mehr sichtbar.
- Die Kanüle 3,7 mm ventral und spritzen den 0.075U von Kollagenase into das rechte Striatum bei einer Rate von 2 pl / min.
- Nach Abschluss der Injektion, nun die Nadel in Position für weitere 10 min, Vor dem Abziehen mit einer Geschwindigkeit von 1 mm / min.
- Verschließen Sie die Bohrloch mit Knochenwachs und vernähen die Haut.
- Inject 0,05 mg / kg Buprenorphin subkutan in vorgewärmten post-operative Flüssigkeiten.
4. Sham Betrieb
- Nach den präoperativen Vorbereitung, wiederholen Sie die Schritte 1-4 für die Blutinjektion Modell beschrieben.
- Legen Sie die Nadel (26 Gauge) 3,7 mm ventral durch das Bohrloch. Die Nadel sollte in ihrer Position bleiben für 10 Minuten, bevor es bei einer Geschwindigkeit von 1 mm / min abgezogen.
- Verschließen Sie die Bohrloch mit Knochenwachs und vernähen die Haut.
- Inject 0,05 mg / kg Buprenorphin subkutan in vorgewärmten post-operative Flüssigkeiten.
5. Repräsentative Ergebnisse
Experimentelle intrastriatal Blutungen hervorruft morphologischensowie Veränderungen im Verhalten von Nagetieren. Diese Veränderungen können ausgewertet werden, um eine adäquate Durchführung des Verfahrens zu gewährleisten, oder um die Auswirkungen von potentiellen Anwendungen zu untersuchen. Generierung der Anschnitt gezielt Hirnareal (zB Basalganglien) ist sehr wesentlich für eine reproduzierbare Methode, und kann auf Brutto-oder histologisch gefärbten Hirnschnitten (Abbildung 1-2) überprüft werden. Verletzungen der Basalganglien Ergebnisse in sensomotorischen Defiziten, die über verschiedene Verhaltens Einschätzungen quantifiziert werden können. Ergebnisse der Ecke wiederum Test zeigte, dass nach experimenteller rechtsseitigen ICH, Mäusen signifikant häufiger eingeschaltet ipsilateral und weg von dem beeinträchtigten kontralateralen Seite (links), (Abbildung 3 A) als Schein Tieren betrieben bei 24 und 72 Stunden nach der Operation. Ferner die Fähigkeit, angemessen zu platzieren die beeinträchtigte (links) Vordergliedmaße auf einer Oberfläche, nach Vibrissen Stimulation wurde über das Vorderbein Anordnen Test beurteilt. Nach 24 und 72 Stunden nach der Operation, Mäuse subprojiziert nach rechts einseitige ICH zeigten deutlich weniger Platzierungen als sham operierten Tieren. Messung von Hirnödem wird häufig verwendet, um das Ausmaß der Hirnschädigung nach experimenteller ICH quantifizieren. Intrazerebralen Injektionen von Eigenblut (30 ul) oder bakterielle Collagenase (0,075 U) zu einer signifikanten Erhöhung des Gehirns Wassergehalt im ipsilateralen Cortex und Basalganglien bei 24 (Fig. 4 A) und 72 h (Figur 4 B) nach der Operation geführt ( Vergleich zu sham). Das Ergebnis der Verhaltenstests (Abbildung 3) und das Ausmaß der Hirnödem (Abbildung 4) zeigten keinen Unterschied zwischen dem Blut und Kollagenase Einspritzer-Modelle in bestimmten Mengen.
Abbildung 1. Modellierung ICH bei Mäusen. (A) Das vereinfachte Schema eines koronalen Hirnschnitts 0,2 mm anterior von Bregma veranschaulicht die proposed Lage Eigenblut oder Kollagenase Injektion. Die laterale Ventrikel LV markiert. CPU steht für caudatus-Putamen, ein Teil des Striatum und GP kennzeichnet die Globus pallidus. Sowohl das Striatum sowie der Globus pallidus an eine Gruppe von Sub-Zellkernen, die auch als Basalganglien bekannt angehören. (B) Repräsentative Mikrophotographie eines koronalen Hirnschnitts 0.2mm anterior Bregma, bei 24 Stunden nach intrastriatal Injektion von autologen Vollblut gewonnen.
Abbildung 2. Histologische Manifestation des Hämatoms. Vertreter Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt koronalen Kryoschnitt (10 um) einer Maus Gehirn, welches Hämatom Größe bei 24 Stunden nach intrastriatal Injektion von bakteriellen Collagenase (0,075 U). LH = linke Hemisphäre, RH = rechte Hemisphäre.
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Abbildung 3. Neurofunktionalen Einschätzungen nach experimenteller ICH bei Mäusen. Intrastriataler Injektion von Eigenblut (30 ul) oder bakterieller Kollagenase (0,075 U) verursacht reproduzierbare neurofunktionalen Defizite. (A) Mäuse nach experimenteller ICH zeigten signifikant mehr nach rechts abzubiegen, als sham operierten Tieren bei 24 und 72 Stunden nach der Operation. (B) Vorderpfote Platzierung Kapazität der linken Extremität wurde nach ICH bei 24 und 72 Stunden nach der Operation beeinträchtigt. Die Werte wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt und analysiert Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance auf den Rängen, von der Student-Newman-Keuls-Methode gefolgt. AP-Wert von <0,05 wurde als statistisch signifikant; n = 6-12 pro Gruppe, * P <0,05 im Vergleich zur Farce. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Abbildung 4. Auswertung Gehirn Wassergehalt nach experimenteller ICH bei Mäusen. Intrazerebrale Injektion von Eigenblut (30 ul) oder bakterielle Collagenase (0,075 U) führte zu einer signifikanten Zunahme des Gehirns Wassergehalt im ipsilateralen Cortex und Basalganglien bei 24 (A) und 72 Std. (B) nach ICH-Induktion. Die Werte wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt und analysiert One Way Analysis of Variance von Tukey post hoc Test. AP-Wert von <0,05 wurde als statistisch signifikant; n = 6-10 pro Gruppe, * P <0,05 im Vergleich zur Farce. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Tiermodelle der intrazerebralen Blutung (ICH) tragen in hohem Maße zu einer höheren Verständnis der Krankheit Pathophysiologie und werden häufig verwendet, zu entwickeln und zu evaluieren neue therapeutische Strategien in einer präklinischen Einstellung. Intraparenchymalen Injektionen von Eigenblut oder bakterielle Kollagenase sind gut etablierte Methoden zur ICH bei Nagetieren zu generieren. Beide Methoden wurden in der Ratte entwickelt, jedoch aufgrund der rasch zunehmende Verfügbarkeit von transgenen und Knockout-Stämme wurde Mäusen unverzichtbar weiter aufzuklären von hämorrhagischem Hirnverletzung 8.
Beim Menschen ausmacht Basalganglien Blutung für ca. 50% aller hämorrhagischen Schlaganfällen und Patienten überleben das erste Ereignis entwickeln häufig schädliche neurofunktionalen Defizite 1. Dementsprechend erinnert experimentellen ICH bei Nagetieren, an denen die Basalganglien, sensomotorische Defizite des Tieres kontralateralen Extremitäten. AufBisher wurden mehrere Verhalten Einschätzungen entwickelt worden, um diese Beeinträchtigungen bei Mäusen und Ratten 9,10 charakterisieren.
In der vorliegenden Studie haben wir beschrieben, ausgewertet und ein modifiziertes Doppeleinspritzung Modell der autologen Vollblut 6 sowie eine ICH Injektionsmodell bakterieller Kollagenase 7, sowohl gezielt den Basalganglien (Corpus striatum) bei Mäusen. Wir evaluierten Verhaltensdefiziten über die Ecke biegen und forelimb Platzierung Test 9,11 und beobachtete erhöhte sensomotorischen Beeinträchtigungen in beiden Modellen 24 und 72 Stunden nach der Operation (Abbildung 3). Zu diesen Zeitpunkten keine signifikanten Unterschiede zwischen den ICH Gruppen wurden gefunden, jedoch schlug früheren Studien eine längere Verletzungen Progression nach Kollagenase Injektion, so dass es eine geeignete Modell für langfristige Outcome-Studien 5. Hirnödem (Gehirn Wassergehalt) wurde unter Verwendung des Verfahrens wet-weight/dry-weight wie zuvor berichtet 12,13.Unsere Ergebnisse zeigten eine signifikante Erhöhung der perihematomal Hirnödem bei 24 und 72 h nach Induktion ICH (Abbildung 4). Alle Mäuse ausgesetzt zu experimentellen ICH oder Schein-Operation überlebt bis zum Tag des Opfers (Mortalität = 0%).
Die beiden beschriebenen ICH Modellen beschäftigen stereotaktisch-assistierte Chirurgie, um genaue und reproduzierbare Injektionen von entweder Blut oder Kollagenase in die gezielte Hirnareal zu gewährleisten. Eine kleine Kraniotomie (1 mm Bohrloch) ist für diesen Zweck erforderlich ist. Es ist wesentlich, um eine Perforation der Dura von der Bohrkrone zu vermeiden, da diese Ungenauigkeit der Schädigung führen und Rückfluss von Blut oder Kollagenase bei der Injektion zu erschweren.
Zunächst wurde das Blut Injektionsmodell als einzelne Injektion intrazerebrale 14 entwickelt, aber es oft hergestellt inkonsistenten Ergebnissen aufgrund Blutrückfluß entlang der Stichkanal 15. Um diese Komplikation zu minimieren, wurde eine doppelte Injektion Methode entwickelt, Bei dem eine kleine Menge Blut liegt direkt über dem gezielten Gehirn Bereich injiziert, gefolgt von einer zweiten Injektion von Blut in den Basalganglien 6. Geronnenes Blut aus der ersten Einspritzung, verhindert den Rückfluss entlang der Nadel Trakt. Dieses Modell ahmt eine aufstrebende Hämatom, aber nicht induziert die tatsächliche Ruptur zerebralen Blutgefäßen. Ein großer Vorteil der autologen Blutinjektion Modells ist, dass keine Störfaktoren, wie exogene Proteine verwendet werden, um ICH zu induzieren. Alternativ ahmt die bakterielle Kollagenase Modell eine spontane intrazerebrale Blutung, die über mehrere Stunden, wie in ca. 30% aller Patienten mit ICH 5 zeigte entwickelt. Bakterieller Kollagenase ist eine Protease, die extrazelluläre Matrix um die zerebralen Kapillaren lysiert und schwächt sie, verursacht Gefäßruptur und damit Blut Extravasation 16. Dieses Modell wird in der Regel genutzt, um Mechanismen der Hämatom Erweiterung zu untersuchen sowie zum Aufsuchen entwickelnive Behandlungen, die Homöostase beeinflussen. Allerdings bakterieller Kollagenase kann verstärken die Entzündungsreaktion und präsentieren neurotoxische Effekte bei hohen Dosen 3. Darüber hinaus können umfangreiche Blutungen nach der intrazerebralen Kollagenase Injektion zu produzieren - im Gegensatz zu menschlichen ICH Pathologie einer ischämischen zerebralen Verletzungen.
Interessanterweise zeigten weiblichen Mäusen unterzogen experimentellen ICH eine deutlich schnellere Erholung der neurofunktionalen Defizite als männliche Tiere 8. Ähnliche Ergebnisse wurden in ischämischem Schlaganfall-Modellen gemacht worden, damit männlichen Nagetieren häufiger werden für Studien des Schlaganfalls Pathologie und Therapie Evaluation 17 umgesetzt.
In diesen Experimenten verwendeten wir intraperitoneale Co-Injektionen der Anästhetika Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) für beide Modelle ICH, doch, frühere Studien haben die Inzidenz der akuten Hyperglykämie bei narkotisierten Nagetieren gemeldet, der innerhalb von 20 Minuten nach kEtamine und Xylazin Injektion 18. Ferner kann Ketamin, eine N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptorantagonisten, eventuell reduziert NMDA-Rezeptor-abhängigen Excitotoxizität und damit verbessern Ergebnissen im Hirnverletzung Modelle. Volatile Anästhetika, wie Isofluran, alternativ in der präklinischen ICH Forschung eingesetzt und halten einzigartige Vorteile gegenüber injizierbaren Agenten, einschließlich der schnellen Veränderung der Narkose Tiefe und kurze Erholzeiten 19. Der Hauptnachteil von Gas Anästhesie ist die Notwendigkeit von aufwendigen Anlagen (Verdampfer, Durchflussmesser, Maske Atemkreislauf) sowie die Möglichkeit der menschlichen Gasexposition. Außerdem wurde berichtet, Isofluran apoptotischen Zelltod nach hämorrhagischen Schlaganfall bei Mäusen 20 zu reduzieren. Die optimale Anästhesie muss angepasst je nach Länge der Operation, Tierarten oder Stamm, und auf den Outcome-Messungen von Interesse sein.
Wir beschrieben und demonstriert zwei ICH Modelle uniqu habene Stärken und Schwächen, während die für bestimmte ICH Eigenschaften. Jeder Modellen Vertreter Eigenschaften müssen berücksichtigt werden, wenn in der präklinischen ICH Untersuchungen verwendet.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde teilweise durch NIH RO1NS053407 JH Zhang unterstützt. Wir danken Herrn Damon Klebe für seine wertvollen Beiträge danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotactic Head Frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Nanomite Syringe Pump | Harvard Apparatus | PY2 70-2217 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton Company | 1725RN (250 μl) 1701 RN (10 μl) |
26 Gauge needle for 250 μl and 10 μl syringes. |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Microdrill burr | Fine Science Tools | 19007-09 | 0.9 mm diameter |
| Collagenase Type VII-S | Sigma-Aldrich | C2399 | |
| Microhematocrit Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | unheparinized |
| Bone Wax | Ethicon | W31 | |
| Suture | Ethicon | 1676G | |
| Ketamine | JHP Pharmaceuticals | 42023-115-10 | Ketalar |
| Xylazine | LLOYD Laboratories | 139-236 | AnaSed |
References
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