マウスにおけるモデリング脳出血：自己血または細菌性コラゲナーゼの注入

Summary

脳内出血（ICH）の臨床的に関連する動物モデルは、出血性脳卒中の知識を拡張し、新たな治療戦略を検討するために必要とされる。そこで本研究では、記述し、マウスの大脳基底核（線条体）に自家全血または細菌コラゲナーゼのどちらかの一方的な注射を実装した2つのICHのモデルを比較検討する。

Abstract

自発脳内出血（ICH）はすべての脳卒中関連入院の10-15％を占めており、そのための効果的な治療法は^1,2を最新に利用できない生命を脅かす可能性の神経学的な病気を定義します。なぜなら、ヒトにおけるICHの異質性は、様々な前臨床モデルを³前向きな治療戦略を徹底的に探求するために必要とされる。実験的な無形文化遺産は、一般的に自己血または細菌コラゲナーゼ⁴のいずれかの実質内注射することにより、げっ歯類で誘導される。適切なモデルは、出血の誘導と傷害の進行の病態生理に基づいて選択されます。血液注入モデルが急速に進んで出血を模倣しています。あるいは、細菌コラゲナーゼは、酵素的に、一般的に数時間かけて^5を進化させ、アクティブな出血を引き起こし、脳の毛細血管の基底膜を破壊する。結果perihematomal浮腫とneurofunctional赤字はあちこちに定量化することができるメートルの両モデル。そこで本研究では、説明と自己全血⁶の修正されたダブルインジェクションモデルと同様に細菌性コラゲナーゼ⁷のICHのインジェクションモデル、どちらもターゲットの雄CD-1マウスの大脳基底核（線条体）を評価我々は24でneurofunctional赤字と脳浮腫を評価したICH誘導後72時間。自己血の線条体注入量（μl30）または細菌コラゲナーゼ（0.075U）は、24および72手術後の時間（P <0.05）で、マウスで再現neurofunctional赤字と大幅に増加した脳浮腫を引き起こした。結論としては、両方のモデルは、一貫性の出血性梗塞を生じ、前臨床ICHの研究のための基本的な方法を表しています。

Protocol

すべての手順は、 実験動物の管理と使用のためのNIHのガイドに準拠して実施し、ロマリンダ大学での動物実験委員会によって承認された。

1。術前準備

無菌技術は、すべての外科的処置のために推薦されます。定位装置を消毒し、手術前に無菌の手術器具を準備する。すべての動物の取扱い中に個人用保護具（P​​PE）を着用してください。動物の生理的な体温を維持するために、手術中に加熱パッドを使用しています。

1. トリプルビーム動物のスケールを使用して、8〜12週齢のマウスの重量を量る。
2. 共同注入ケタミン（100 mg / kg）およびキシラジン（10 mg / kg）を腹腔内投与した後、麻酔のための7-10分は（適切な鎮静のためのモニタ）を有効にすることができます。
3. サーマルブランケットの上にマウスを置き、頭皮を剃る。
4. 両眼に眼軟膏を適用します。
5. 確保する気道は、優しく丁寧に横方向に舌を動かすと、によって定位装置の上にマウスの頭部を固定します。注：頭部は定位フレームの基礎に水平に固定しなければなりません。
6. ベタジンで手術領域を消毒し、70％エタノールですすぎます。 3回の合計ベタジンと70％エタノールのアプリケーションを交互に繰り返します。綿棒のアプリケーターは、この目的のために使用することができます。

2。血液インジェクションモデル

1. 第10位メスの刃で頭皮から1cm長い正中切開を行います。
2. 冠状および矢状縫合（ブレグマ）の垂直交点を露出させるために、頭蓋骨を覆う軟組織を一掃するために綿棒のアプリケーターを使用しています。
3. 噴射ポンプにハミルトンシリンジ（250μl）をマウントして、定位ブレグマ上針（26ゲージ）に指示。
4. 次に、針0.2ミリメートル前部と2位に定位マニピュレータアームを調整横方向に右にミリメートル。これらの座標に1 mmのドリルビットで速度可変ドリルを使用して、小さな頭蓋穿頭孔を作る。
5. 動物の尾を一時停止し、70％エタノールで、その下面を消毒。
6. 穿刺滅菌針を持つ中央尾動脈（ 例えば 26ゲージ）とunheparinizedキャピラリーチューブに動脈血を採取。
7. ハミルトンシリンジのガラスバレルに毛細管から迅速に血液を移し、その後、プランジャーを挿入します。
8. 噴射ポンプにハミルトンシリンジを含む動脈血の今を30μl以上を取り付け、そのベベルが見えなくなる直前まで削り穴を通して針を（矢状縫合に面し​​た斜めのエッジを持つ）を挿入します。
9. この時点で、事前から腹側に針3ミリメートルと2μl/分の速度で、自己血5μlを注入します。
10. 第1噴射あらかじめ深さで、針0.7ミリメートルの完了後。
11. 待つ5分、右線条体への血液25μlを注入します。
12. 二回目の注射が完了した時点で、1ミリメートル/分の速度でそれを撤回する前に、追加の10分の位置に針を残す。
13. 骨ワックスで削り穴を密封し、皮膚を縫合する。
14. 術後鎮痛のためにあらかじめ温めておいた液（生理食塩水）の皮下にブプレノルフィンの0.05 mg / kgを注入します。

3。コラゲナーゼインジェクションモデル

1. 血液注入モデルで説明したように術前の準備の後、繰り返して手順1〜4を繰り返します。
2. 生理食塩水0.5μlに溶解し、細菌（クロストリジウム）コラゲナーゼVII-Sの0.075Uでハミルトンシリンジ（10μl）を記入してください。気泡の生成を避けること。
3. 噴射ポンプにハミルトンシリンジを取り付け、そのベベルが見えなくなる直前まで削り穴を通して針（26ゲージ）を挿入します。
4. 腹針3.7ミリメートルを進め、コラゲナーゼiの0.075Uを注入NTO2μl/分の速度で右線条体。
5. 注入が完了した時点で、1ミリメートル/分の速度でそれを撤回する前に、追加の10分の位置に針を残す。
6. 骨ワックスで削り穴を密封し、皮膚を縫合する。
7. 予め温めておいた術後流体の皮下にブプレノルフィンの0.05 mg / kgを注入します。

4。偽手術

1. 血液注入モデルで説明したように術前の準備の後、繰り返して手順1〜4を繰り返します。
2. バリ穴から3.7ミリメートル腹針（26ゲージ）を挿入します。針は1mm /分の速度で引き抜かれる前に、10分間の位置のままにする必要があります。
3. 骨ワックスで削り穴を密封し、皮膚を縫合する。
4. 予め温めておいた術後流体の皮下にブプレノルフィンの0.05 mg / kgを注入します。

5。代表的な結果

実験的な線条体出血は、形態学的連想させるげっ歯類ではなく、行動の変化。これらの変更は、手続きの適正な執行を確保するために、あるいは潜在的な治療法の効果を調べるために評価することができます。ターゲットを絞った脳の領域（ 例えば 、大脳基底核）にブリードを生成すると、再現性のあるアプローチのために最も必要不可欠であり、肉眼的あるいは組織学的に染色された脳切片（ 図1-2）で確認することができます。様々な行動の評価を介して定量化することができる感覚障害、大脳基底核での結果への傷害。コーナーのターンテストの結果は、実験的な右サイドのICHの後、マウスが（ 図3）偽手術後24および72時間後に動物を操作するのではなく、障害の反対側（左側）から同側と離れて有意に多くなったことを示した。さらに、十分に鼻毛刺激後、表面に障害（左）前肢を配置する機能は、前肢置き試験により評価した。 24および72時間で手術後、マウスのサブ右サイドICHにjectedと偽手術動物よりも有意に少なかっメントを示した。脳浮腫の測定は頻繁に実験的なICHの後の脳損傷の程度を定量化するために採用されている。自己血（30μl）を、または最下位24（ 図4）で同側の大脳皮質と大脳基底核の脳含水量の増加、手術後72時間（ 図4B）につながった細菌性コラゲナーゼ（0.075 U）（脳内に注射）偽と比較されます。動作テストの結果（ 図3）、脳浮腫の程度（ 図4）指定されたボリュームで、血液やコラゲナーゼ注射モデル間の差はみられなかった。

図1。マウスでのモデリングのICH（A）ブレグマの前方冠状脳切片0.2ミリメートルの簡略図がPRを示し自己血またはコラゲナーゼ注入の場所をoposed。側脳室は、LVのマークが付けられます。 CPUは、尾状核被殻、線条体の一部の略で、GPは淡蒼球を識別します。両方、線条体だけでなく、淡蒼球はまた、大脳基底核として知られる皮質下核のグループに属します。 （B）は自己全血の線条体注射後24時間後に得られたブレグマの冠状脳切片0.2ミリメートルの前部、の代表顕微鏡写真。

図2。血腫の組織学的症状。代表ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）マウス脳のステンド冠状凍結切片（10μm）を、細菌性コラゲナーゼの注入線条（0.075 U）は24時間後に血腫の大きさを示す。 LH =左半球は、RH =右半球。

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図3。マウスでの実験的な無形文化遺産。自己血の線条体注入（30μl）を、または細菌コラゲナーゼ（0.075 U）は次のNeurofunctional評価は再現neurofunctional赤字が発生していました。 （A）は実験のICHの後のマウスは、手術後24および72時間後に偽手術動物よりもはるかに多くの右ターンを示した。左下肢の（B）は前足置く能力は、手術後24および72時間後に、ICHの後に障害されていた。値は平均±SEMとして表され、スチューデント·ニューマン·クールズ法に続いてランク上の分散のクラスカル·ウォリス片道分析を用いて分析した。 <0.05のp値は、統計的に有意であると考えられた; N = 6月12日あたりのグループ、* P <0.05は偽に比べて大きい図を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図4。マウスでの実験的な無形文化遺産を後の脳含水量の評価。自己血の脳内注入（30μl）を、または最下位24（A）で同側の大脳皮質と大脳基底核の脳含水量の増加および72時間につながった細菌性コラゲナーゼ（0.075 U） （B）はICH-誘導後。値は平均±SEMとして表さおよびTukey事後検定に続く分散の一方向分析を用いて分析した。 <0.05のp値は統計的に有意であると考えていたし、n = 6月10日あたりのグループ、* P <0.05は偽に比べて大きい図を表示するには、ここをクリックしてください 。

Discussion

脳内出血（ICH）の動物モデルは、疾患の病態生理学の高度な理解に大きく貢献する、と一般的に前臨床設定において新たな治療戦略を開発し、評価するために使用されます。自家血液または細菌コラゲナーゼの実質内注射は、げっ歯類におけるICHを生成するために十分に確立されたメソッドです。どちらの方法も、当初はラットで開発されたが、トランスジェニックマウスおよびノックアウト株の急速に増加して在庫状況により、マウスはさらに出血性脳損傷⁸のメカニズムを解明することが不可欠となりました。

ヒトでは、大脳基底核出血はすべての出血性脳卒中の約50％を占め、初期イベントを生存患者は頻繁に有害neurofunctional赤字^1を開発しています。したがって、大脳基底核を含む齧歯類における実験的なICHは、動物の対側四肢の感覚障害を呼び起こす。へ日付は、いくつかの行動評価は、マウスおよびラットの^9,10でこれらの障害を特徴づけるために開発されてきた。

本研究では、我々が説明され、自己全血⁶の修正されたダブルインジェクションモデルと同様に細菌性コラゲナーゼ⁷のICHのインジェクションモデルを評価し、マウスの大脳基底核を（線条体）を標的とする両方。我々はテスト^9,11を配置^するコーナーターンや前肢を介して行動障害を評価し、手術後24および72時間（ 図3）で、両モデルともに増加し、感覚障害を観察した。これらの時点で有意な差は、ICHグループ間で見つかりませんでした指摘であるが、以前の研究では、それ長期的アウトカム研究⁵のためのより適切なモデル作り、コラゲナーゼ注射後長引くけがの進行を示唆した。脳浮腫（脳含水量）が以前に報告された^12,13としてwet-weight/dry-weight法を用いて測定した。我々の結果は、重要な24でperihematomal脳浮腫の増加やICHの誘導後72時間（ 図4）を示した。実験ICHまたは偽手術を受けたすべてのマウスは犠牲の日（死亡率= 0％）まで存続した。

2説明ICHのモデルは、ターゲット脳領域への血液またはコラゲナーゼのいずれかの正確で再現性のある注射を確実にするために定位的に支援手術を採用しています。小開頭術（1ミリメートル穿頭孔）は、この目的のために必要とされる。この不正確さは、注入中に血液またはコラゲナーゼの逆流で負傷し、その結果を悪化させるので、それはドリルビットで硬膜の穿孔を避けるために不可欠です。

当初、血液注入モデルは、単一の脳内接種¹⁴として開発されましたが、それは多くの場合、針管^15に沿って血液の逆流に起因する矛盾した結果を生み出した。この合併症を最小限に抑えるために、二重注入法が開発されました、ここで少量の血液が大脳基底核への血液の⁶回目の注射に続いて、右のターゲットを絞った脳領域の上に注入される。最初の注射の凝固した血液は、針管に沿って逆流を防ぎます。このモデルでは、急速に発展して血腫を模倣しますが、脳血管の実際の破裂を誘発しない。自家血注入モデルの主な利点は、このような外因性のタンパク質などない交絡因子は、ICHを誘導するために使用されていないということです。すべてのICH患者⁵の約30％に展示としてあるいは、細菌コラゲナーゼモデルは、数時間かけて開発して自発的な脳内出血を模倣しています。細菌性コラゲナーゼは、脳毛細血管の周りの細胞外基質を溶解し、容器が破裂し、その結果として溢血^16を引き起こし、それらを弱めプロテアーゼである。このモデルは、一般的に見込み客を開発するだけでなく、血腫の拡大のメカニズムを調べるために利用されている恒常性に影響を与えるアイブトリートメント。ただし、細菌性コラゲナーゼは、炎症反応を増幅し、高用量の³で神経毒性を提示することができる。さらに、脳内コラゲナーゼ注射後の広範な出血が生じること - 人間のICH病理性虚血性脳損傷とは対照的である。

興味深いことに、実験的な無形文化遺産を受ける雌マウスは雄の動物⁸よりneurofunctional赤字を大幅に高速回復を示した。同様の知見は、このように男性のげっ歯類がより一般的に脳卒中病態と治療評価¹⁷の研究のために実装されており、虚血性脳梗塞モデルで行われている。

これらの実験では、ICHのモデルの両方のために麻酔薬ケタミン（100 mg / kg）およびキシラジン（10 mg / kg）の腹腔内共同注射を利用していますが、以前の研究では、20の内部での起動、麻酔げっ歯類の急性高血糖の発生率を報告しているK分後エタミンおよびキシラジンの注入^18。さらに、ケタミン、N-メチルD-アスパラギン酸（NMDA）受容体拮抗薬は、おそらくNMDA受容体依存性の興奮毒性を減らすため、脳損傷モデルで成果を改善するかもしれません。そのようなイソフルランのような揮発性麻酔薬は、代わりに前臨床ICHの研究で使用され、麻酔の深さと短い回復時間の¹⁹の簡単な変更を含む注射剤以上のユニークな利点を保持しています。ガス麻酔の主な欠点は、精巧な機器を必要として（気化器、流量計、マスク呼吸回路）だけでなく、人間のガス曝露の可能性である。また、イソフルランは、マウス²⁰の出血性脳卒中後のアポトーシス細胞死を減少させることが報告されています。最適な麻酔は、関心のあるアウトカム測定にと、手術の長さは、動物種や菌株によ​​って適合させる必要がある。

我々はuniquを持つ2つのICHのモデルを説明し、実証電子の強みと弱み、特定のICHのプロパティを表すながら。前臨床ICHの調査で使用した場合、各モデルの代表的な特性は、考慮する必要があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Head Frame	Stoelting Co.	51600
Nanomite Syringe Pump	Harvard Apparatus	PY2 70-2217
Hamilton Syringe	Hamilton Company	1725RN (250 μl) 1701 RN (10 μl)	26 Gauge needle for 250 μl and 10 μl syringes.
Microdrill	Fine Science Tools	18000-17
Microdrill burr	Fine Science Tools	19007-09	0.9 mm diameter
Collagenase Type VII-S	Sigma-Aldrich	C2399
Microhematocrit Capillary Tubes	Fisher Scientific	22-362-574	unheparinized
Bone Wax	Ethicon	W31
Suture	Ethicon	1676G
Ketamine	JHP Pharmaceuticals	42023-115-10	Ketalar
Xylazine	LLOYD Laboratories	139-236	AnaSed