Funktionel magnetisk resonans (fMRI) med Auditiv Stimulation i Songbirds

Summary

Denne artikel viser en optimeret procedure for billeddannelse af de neurale substrater af auditiv stimulation i sangfugl hjernen hjælp af funktionel magnetisk resonans (fMRI). Det beskriver fremstillingen af ​​de sunde stimuli, positionering af emnet og erhvervelsen og den efterfølgende analyse af de fMRI data.

Abstract

Neurobiologi af fuglesang, som en model for menneskelig tale, er en udtalt forskningsområde i adfærdsmæssige neurovidenskab. Betragtninger elektrofysiologi og molekylær tilgange tillader undersøgelse af enten forskellige stimuli om få neuroner, eller en stimulus i store dele af hjernen, blodets iltning niveau afhængig (fed) funktionel magnetisk resonans (fMRI) giver mulighed at kombinere både fordele, dvs sammenligne neurale aktivering fremkaldt af forskellige stimuli i hele hjernen på én gang. fMRI i sangfugle er udfordrende på grund af den lille størrelse af deres hjerner, og fordi deres knogler og især deres kraniet omfatter talrige lufthulrum, overtalelse vigtige modtagelighed artefakter. Gradient-ekko (GE) BOLD fMRI er blevet anvendt med succes til sangfugle ^1-5 (for en gennemgang, ^6. se). Disse undersøgelser fokuseret på de primære og sekundære auditive områder i hjernen, som er områder, fri for modtagelighed artefakter. Men fordi proccesser af interesse kan forekomme over disse regioner er hele hjernen BOLD fMRI kræves anvendelse af en MRI-sekvens mindre modtagelige for disse artefakter. Dette kan opnås ved hjælp af spin-ekko (SE) BOLD fMRI ^7,8. I denne artikel beskriver vi, hvordan du bruger denne teknik i zebrafinker (Taeniopygia guttata), som er små sangfugle med en kropsvægt på 15-25 g omfattende undersøgt i adfærdsmæssige neurovidenskab af Fuglesang. Det vigtigste emne for fMRI undersøgelser af sangfugle er sang perception og sang læring. Den auditive karakter stimuli kombineret med den svage BOLD følsomhed SE (i forhold til GE) baserede fMRI sekvenser gør implementeringen af ​​denne teknik meget udfordrende.

Protocol

1.. Forberedelse af lydstimuli

1. Første optage lyd-stimuli, mens der spilles inde i boringen i 7T MR-systemet. Boringen er et lukket rum, der kan forvride de auditive stimuli resulterer i forbedring af visse auditive frekvenser. Figur 1 viser hyppigheden forbedret og undertrykt som vist ved vores optagelser af hvid støj på placeringen af fuglens hoved i magneten boring ved hjælp af en fiberoptisk mikrofon (Optimic 1160, Optoacoustics). For at kompensere denne kunstige ekstraudstyr, er en equalizer funktion anvendes på hver stimulus hjælp WaveLab software. For vores særlige setup består funktionen af ​​en Gauss-kerne med følgende parametre: maksimal amplitude:-20dB, centreret på 3.750 Hz, bredde: 0,05 oktaver (svarende til intervallet 2,500-5,000 Hz for vores system).
2. Sangen stimuli er sammensat af flere individuelle sang motiver af hver fugl sammenflettet med perioder med stilhed. Den dguration af disse stille perioder er justeret til at holde den samlede mængde af lyd og stilhed ens for alle stimuli. Denne konstruktion sparer naturlige intra-individuelle og inter-individuel variation i sangens længde. Den samlede længde af hver stimulus er 16 sek. Intensiteten af ​​hver sang er normaliseret i forhold til matchede root-middelværdi-square og high-pass filtreret ved 400 Hz, før at blive integreret i det komplette stimulus (sang og stille perioder). Disse manipulationer er færdig med PRAAT software.
3. Forsøget består af en ON / OFF blok design vekslende auditive stimulation perioder (ON blokke) med hvileperioder (OFF blokke) (Figur 2). Hver blok (ON og OFF) varer 16 sekunder, hvilket svarer til erhvervelsen på 2 billeder (se nedenfor for erhvervelse). Hver stimulus typen præsenteres 25 gange, hvilket resulterer i erhvervelsen af ​​50 billeder pr stimulus og per emne. Præsentationen rækkefølge af betingelserne skal være randomiseret inden for og mellemfag. Dette randomiserede rækkefølge stimuli kan kodes i præsentation software.

2.. Emne Forberedelse

2.1 Emne og gruppens størrelse

Her præsenterer vi en protokol specielt tilpasset til brugen af ​​(voksen) zebrafinker. Valget af arten afhænger videnskabelige spørgsmål. Dog kan andre hensyn såsom fugl robusthed til anæstesi også tages i betragtning. Zebrafinker (Taeniopygia guttata) bør anbringes i volierer under en 12 timers lys: 12 timer mørke med lys og har adgang til mad og vand ad libitum under hele undersøgelsen. Den minimale antal individer pr eksperiment er 15.. Dette tal tager hensyn til følsomheden af ​​spin-ekko fMRI og den naturlige inter-individuel variation af biologiske fænomener målt i eksperimentet.

2.2 Installation af opsætning og forberedelse af dyret

(For specifikationaf det anvendte udstyr, henvises der til listen over specifikke reagenser og udstyr i slutningen af ​​denne artikel)

1. Installer næb maske på MRI seng af en 7T MR-system og tilslut det til gas controller-enhed med plastrør. Åbn begge ilt og kvælstof gasflasker og tænd for gas controller enhed (flow ilt: 200 cc / min; nitrogen: 400 cc / min).

Som nævnt ovenfor er et 7T MR-system, der anvendes i den præsenterede opsætningen. Andre MR-systemer med forskellige feltstyrker er også muligt, men 7T et godt kompromis er indgået mellem signal-støj-forhold og graden af ​​modtagelighed artefakter (se diskussionen). Ved højere feltstyrker signal-til-støj-forholdet øges sammen med graden af ​​modtagelighed artefakter.

2. Tænd den feedback kontrollerede system og varm luftstrøm enhed.
3. Bedøv zebra finke med 3% isofluran i en blanding af ilt og kvælstof ved at indføre næbbetind i masken og holde hovedet ned, indtil fuglen er fuldt bedøvet. Dette kan kontrolleres ved at trække foden sagte: når fuglen er fuldt bedøvet foden vil ikke blive trukket tilbage af fuglen. Desuden vil øjnene af fuglen være delvist lukket.
4. Indføre kloak temperatur probe til screening kropstemperaturen og overvåge vejrtrækning ved at placere en pneumatisk sensor under zebra finke mave. Luk kappen til at fastholde fuglens krop (figur 3).
5. Opretholde vejrtrækning inden for området 40 - 100 vejrtrækninger per minut og holde kropstemperaturen konstant inden for et snævert interval på 40 ± 0,5 ° C. Når vejrtrækning serien er for lav / høj, justere niveauet af anæstesi (% isofluran) tilsvarende. Når problemet fortsætter, skal forsøget stoppes og dyret fjernet fra setup med henblik på at komme sig.
6. Placere umagnetiske dynamiske højttalere på hver side af zebra finke hoved og konstrømtilførslen dem til forstærkeren. Sørg for, at ledningerne i højttalerne er ført bort fra temperaturføleren, fordi det kan påvirke temperaturmålingen, når for tæt.
7. Placer overfladen RF-spolen på toppen af ​​zebra finke hoved og position zebra finke i midten af ​​magneten (og automatisk midten af ​​sende spole, som er beliggende i midten af ​​magneten).
8. Reducer anæstesi niveau til 1,5% isofluran blandet med oxygen og nitrogen.

3.. Data Acquisition

1. Anskaf et sæt af 1 sagittale, 1 vandret og 1 koronale gradient-ekko (GE) scout billede (tri-pilot sekvens) og sæt vandrette, coronal og sagittal multi-slice billeder (lodsning T _2-vægtede hurtige overtagelse afslapning-forstærket ( RARE) SE-sekvens) til at bestemme positionen af hjernen i magneten (Figur 4).
2. Nedsæt støjen fra stigninger ved at øge deres Rampetiderne til 1.000 mikrosekunder.
<li> Forbered fMRI rækkefølge: RARE T _2-vægtede sekvens, effektiv TE: 60 msek, TR: 2.000 msek RARE faktor: 8, FOV: 16 mm, matrix størrelse: 64 x 32, orientering: sagittal, skive tykkelse: 0.75 mm, Inter-slice hul tykkelse: 0,05 mm, 15 skiver, der dækker næsten hele hjernen (Figur 4).
3. Vælg den auditive protokol (auditive stimuli og timing af stimulus levering) i præsentation software. Denne protokol består af en sekvens af kommandoer - til indledning af specifikke auditive stimuli - som udføres på et bestemt scan-nummer. Ved hver gentagelse i fMRI sekvens, vil scanneren software sende en trigger til den auditive præsentation software som til gengæld registrerer scanningen nummer og udfører den tilsvarende kommando.
4. For at sikre at den auditive præsentation software ikke forbigår nogen aftrækkeren fra scanneren er den auditive protokollen indledes først. Når protokollen er fuldt lastet, er fMRI sekvens startet.
5. Hver fMRI eksperiment indledes med købet af 12 dummy billeder til at sende signalet tilskrives scanneren støj til at nå en stabil tilstand, før du begynder auditiv stimulation.
6. Efter overtagelsen zero-fill data til 64 x 64.
7. Tag en første (foreløbige) kig på resultaterne ved hjælp af Functional Tool i Paravision (option Processing / Functional Imaging). Beregn forskellen BOLD respons mellem alle på blokke og baseline (OFF blokke). Denne analyse giver et første fingerpeg om kvaliteten af ​​forsøget. Hvis der ingen aktivering ses i de primære auditive områder på dette tidspunkt, var fuglen sandsynligvis ikke høre / forarbejdet de auditive stimuli på grund af tekniske problemer med stimulus præsentation, anæstesi niveau osv. Opsætningen bør verificeres og den gentagne måling.
8. Kør en anatomisk 3D RARE T2-vægtede sekvens i samme retning som de tidligere fMRI scanninger og effektiv TE: 60 msek, TR: 2.000 msek RARE faktor: 8, FOV: 16 mm, matrix størrelse: 256 x 128 x 64.
9. Zero-fylde data til 256 x 256 x 256.
10. Tag zebra finke fra MRI seng og lad det komme fra anæstesi i et bur under en rød lampe. Normalt inddrivelse af en zebra finke efter isofluran anæstesi går relativt hurtigt (maksimal 5 min). Efter kun et par minutter, vil fuglene forsøge at stå op og når fuglen er fuldt genvundet, vil det perch på en gren i stedet for at sidde på bunden af ​​buret. Varigheden af ​​anæstesi er omkring 2 timer for den foreliggende forsøg. Den maksimale tid for isofluran-anæstesi anvendes på zebrafinker i vores laboratorium er 6 timer, hvorefter fuglene også inddrevet inden for 5 min.

4.. Databehandling

1. Konverter MR-data i Analyse eller Nifti format.
2. Fordi SPM er blevet udviklet til at behandle fMRI data indsamlet hos mennesker, der er for voxel på omkring 2 mm. Talrige SPM indstillinger tilpasset denne omtrentlige voxelstørrelsen. Hvis man ikke gør det want til at ændre alle disse indstillinger, er den enkleste måde at fortsætte er at kunstigt øge voxelstørrelsen af ​​fuglenes fMRI data. Juster voxelstørrelsen i headeren ved at multiplicere den virkelige voxelstørrelse med 10 hjælp MRIcro. Det skal bemærkes, at en sådan justering ikke påvirker data i sig selv, ingen gensampling eller andre ændringer af data anvendes.

Et alternativ til dette er brugen af ​​'SPMMouse ", som er en værktøjskasse tillader SPM at åbne og analysere filer af enhver voxeldimension. Værktøjet gør det muligt for SPM 'glas hjerner' for at være skabt af et billede, og justerer automatisk defaults længdeskalaer baseret på headers i billedfiler eller brugerdata indtastede data. Derfor denne værktøjskasse virker i den modsatte retning end hvad vi foreslår. I stedet for at ændre voxelstørrelsen af ​​billederne til at passe i SPM er standardindstillingerne for SPM skiftet til at bruge billeder med forskellige voxel størrelser.

3. Justere fMRI data. Co-registrere den anatomiske 3D datasæt til than fMRI tidsserier. Normalisere 3D data (og co-registrerede fMRI tidsserier) til zebra finke hjernen MRI atlas. Påfør transformationsmatrix til fMRI datasættet. Dette kan alle gøres ved hjælp af statistiske Parametric Mapping (SPM) 8 software.
4. Glat data med en 0,5-mm bredde Gauss kernel hjælp SPM8.
5. Udføre statistiske voxel-baserede analyser med SPM8. Model dataene som en box-bil (ingen hæmodynamiske respons funktion). Skøn modelparametre med den klassiske Begrænset Maximum Likelihood algoritme. Beregn den gennemsnitlige virkning af hver auditiv stimulering i hvert emne (fastforrentede effekt analyse), og derefter beregne statistikker ønsket for gruppe analyser (mixed-effekt analyser).
6. Projicere statistiske parametrisk kort på zebra finke atlas (figur 5) ⁹ i SPM8 at lokalisere de funktionelle aktiveringer (figur 6).

Representative Results

Vi her visuelt præsenteret en optimeret sekvens af procedurer for en vellykket billeddannelse af neurale substrater af auditive stimuli i zebra finke hjernen. For det første beskrevne procedure til fremstilling af de auditive stimuli medfører stimuli, der kan inkorporeres i en ON / OFF-blok paradigme (figur 2), og som er normaliseret til fjerne potentielle forskelle i lydtrykniveau, som kan fremkalde en differentieret reaktion i hjernen . Efter klargøring af zebra finke for MRI scanning og placere den ind i boringen i magneten (Figur 1), kan fMRI erhverves. Derudover er en 3D billede i høj opløsning taget med henblik på at normalisere dataene til zebra finke atlas ^9.. Endelig præ-behandling og statistisk analyse af data giver mulighed for visualisering af de opnåede resultater (figur 6).

69/4369fig1.jpg "alt =" Figur 1 "fo: content-width =" 4.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4369/4369fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Spektrogrammerne af hvid støj optaget med henblik på at fastslå, frekvensbånd, der er forbedret / undertrykt i magneten boring. A. Hvid støj udenfor magneten boring. B. Hvid støj registreret ved placeringen af fuglens hoved inde i magneten boring. C. White støj efter anvendelse af equalizer-funktionen til at korrigere for forbedrede / undertrykt frekvensbånd.

Figur 2. Oversigt over ON / OFF blok paradigme, hvor auditive stimulation perioder vekslede med hvileperioder. Hver blok (stimulus / hvile) varer 16 sekunder, hvorunder 2 billeder erhverves. De forskellige stimuli består af repræsentative motiver af fuglesang eller andre former for lydafhængigt af forsøget. Disse Motiverne er sammenkædede, og sammenflettet med stille perioder og varigheden af ​​de tavse perioder er justeret til at holde den samlede mængde af lyd og stilhed ens for alle stimuli.

Figur 3. . Opsætning for auditiv fMRI i små sangfugle A. Animal seng Indsat:. Detaljeret skematisk oversigt over placeringen af fuglen i dyret sengen af scanneren: B. RF hoved spole, C. Beak maske med D. levering af bedøvelsesmiddel gas, E. umagnetiske hovedtelefoner, F. pneumatiske pude sensor til at overvåge respirationsfrekvens, G. kloak temperaturføler H. tilbagemeldinger styret varmelegeme system til at holde kroppenTemperaturen af fuglen stabilt under målingen. Klik her for at se større figur .

Figur 4.. Slice geometri til hel-hjerne fMRI billeddannelse. Sammensætning screenshots fra geometri editor i ParaVision software. Tidligere erhvervede aksiale, sagittale og koronale RARE pilotsektorer billeder bruges til at definere den skive orientering for fMRI scanning.

Figur 5. Lateral visning af en 3D repræsentation af venstre hjernehalvdel med afgrænsede strukturer fra zebra finke atlas ⁹ projiceret på sin mid-sagittal skive. Farvekoden på afgrænset kerner præsenteres til højre. Disse delineated strukturer er en del af den vokale motor vej: HVC, nucleus robustus arcopallii (RA), nXII pars tracheosyringealis (nXIIts), den forreste forhjernen vej: nucleus lateralis magnocellularis pars lateralis (LMAN), område X (X), det auditive system: field L, nucleus ovoidalis (Ov), nucleus mesencephalicus lateralis pars dorsalis (MLD), det olfaktoriske system: lugtekolben (OB), og det visuelle system: nucleus entopalliallis (E), Tectum Opticum (TEO).

Figur 6.. Eksempel på en fMRI BOLD respons i den primære auditive regionen Field L, og tilstødende sekundære auditive områder fremkaldt af forskellige auditive stimuli i forhold til resten tilstand. Billederne består af statistiske parametriske maps oven på højopløselige anatomiske billeder fra zebra finke hjernen atlas ^9.. T-værdier er farvekodet i henhold til denskala vises i figuren og kun voxels, hvor t-test blev fundet at være signifikant (p <0,001) vises.

Discussion

I denne rapport beskriver vi en optimeret protokol til den detaljerede in vivo karakterisering af neurale substrater af auditiv stimulation i bedøvede zebrafinker.

I overensstemmelse med den fremlagte protokol, de fleste af funktionelle hjerne aktivering hos dyr ved hjælp af BOLD fMRI bedøve dyrene under overtagelsen. Træning dyr at vænne dem til magneten miljø og scanneren støj under undersøgelsens perioder er også muligt, men snarere tidskrævende og udfordrende og derfor sjældent anvendes.

Selvom anæstesi minimerer stress-inducerede virkninger på fysiologiske reaktioner af interesse og letter håndtering af dyr, dens virkning på både det neurale respons og om overførsel funktion mellem de neurale aktivitet og BOLD respons målt i fMRI er en on-going og vigtigt forskningsemne . Derfor er virkningerne af anæstesi på Fed svar under auditory stimulation i zebrafinker blev undersøgt i vores laboratorium ^2.. Følgelig tre udbredte bedøvelsesmidler i zebrafinker - medetomodine, isofluran og urethan - handler på forskellige neurotransmitter systemer blev undersøgt. Resultaterne viste, at auditiv stimulering resulterede i klare BOLD responser med alle tre bedøvelsesmidler, men at små forskelle opstod mellem de tre reagenser i forhold til f.eks udvidelse af området med aktivering. Baseret på resultaterne af denne undersøgelse og på det faktum, at isofluran er den mest almindelige bedøvelsesmiddel i kliniske anvendelser, som det har den store fordel at have relativt hurtig genopretning og mindre bivirkninger, og dermed har det største potentiale til brug i forløbsstudier blev isofluran bedøvelsesmiddel valg for zebra finke fMRI på vores laboratorium.

I denne protokol, anvender vi spin-ekko (SE) fMRI stedet for de mere traditionelle gradient-ekko (GE) fMRI. Sammenlignet med GE fMRI, SE fMRI harden store fordel, at signal til hele hjernen, da der ikke er noget signaltab i billederne. En anden fordel ved SE BOLD fMRI er dens bedre rumlig specificitet ^10,11. Faktisk ved høj magnetfelt er den intravaskulære del af SE BOLD signal reduceret (på grund af en lang TE), og det ekstravaskulære komponent fra store skibe er undertrykt (ved 180 ° omlægningen puls SE MRI sekvens). SE BOLD signal således domineret af en nøjagtig ekstravaskulær signal stammer fra små fartøjer ^12-14. Den største begrænsning af SE fMRI er forholdsvis svag følsomhed, kræver optimerede sekvenser og optimerede stimulering paradigmer. Kontrasten til støjforhold (CNR) stiger med feltstyrke ^15. En lang TE øger også CNR, men kompromitterer signal-støjforhold ^12,13,15. Den optimale TE sædvanligvis svarer til en tid lig med eller længere end den T ₂ værdien af væv. Vi har vist, at på 7T,en TE værdi på 60 msek giver en CNR og et signal-til-støj-forhold tilstrækkeligt til at påvise signifikante forskelle i BOLD respons udløst af forskellige stimuli (Poirier, 2010).

Sammenlignet med GE T2 *-vægtet kontrast SE T2-vægtet kontrast kræver en lang TR (1.500-2.000 msek ved 7T). At være i stand til at afbilde 15 skiver, brugte vi en TR på 2.000 msek. For at holde købet tid på en rimelig grænse, SE MR-sekvenser skal fremskyndes. Dette opnås sædvanligvis ved hjælp af ekko plane imaging (EPI) stikprøveplan ^10,16-19. Men EPI inducerer billedforvrængninger der stiger med størrelsen af ​​det magnetiske felt, og forurener BOLD signal med T2 * virkninger (gør signalet stærkere, men mindre specifik). EPI producerer også en meget intens akustisk støj, hvilket gør det mindre relevant til anvendelse i efterforskningen auditive stimuli. Vi har således brugt en RARE sekvens med en matrix størrelse på 64 x 32, hvilket resulterede i en erhvervelse cirka 8 sekunder. Denne tidsmæssige resolution er stadig kompatibel med den træge BOLD respons induceret af blok design, men for langsomme til præcist at prøve tidsforløbet for BOLD respons eller bruge event-relaterede designs. Med denne sekvens, således vi opnåede en ren T2-vægtet SE signal, som er kendetegnet ved en meget god rumlig specificitet, en følsomhed tilstrækkelig høj til at detektere differentielle BOLD respons og en tidsmæssig opløsning forenelig med den anvendte stimulus paradigme ^20,21.

Fordele og begrænsninger af brugen af ​​fMRI i Songbirds

I de seneste årtier har fMRI blevet en af ​​de mest populære Neuroimaging teknikker i klinisk kognitiv neurovidenskab til studiet af hjernens aktivitet under forskellige opgaver lige fra simple sansemotoriske til yderst kognitive opgaver. I prækliniske forskning, er denne metode dog stadig kun næsten brugt. Knapheden på fMRI eksperimenter afsluttet i små dyr, og især sangfugle til dato muligvisvedrører den omstændighed, at anæstesi eller sedation er nødvendig for at opnå fuldstændig immobilisering af emnerne (se diskussionen ovenfor). Derfor er denne betragtes som den største ulempe ved teknikken og begrænser den type spørgsmål, som kan behandles. Men selv om fMRI kræver anæstesi og BOLD signal afspejler hovedsagelig lokale feltpotentialer og dermed adskiller sig fra de virkningspotentialer målt i elektrofysiologiske og omgående tidlige gen (IEG) undersøgelser (fx ^22), BOLD fMRI har bekræftet mange resultater opnået ved disse teknikker.

Til dato er de mest populære teknikker i songbird neurovidenskab stadig aktivitet-afhængig udtryk for IEG og elektrofysiologiske optagelser af single-eller multi-unit aktivitet. Disse teknikker drage fordel af en meget høj rumlig opløsning (5-30 m; cellulære niveau). Men de er meget invasiv eller endda dødelige. Derudover er elektrofysiologiske teknikker begrænset af antallet af lokationer, der kan stikprøven i et eksperiment, og derfor kræver en priori hypoteser om lokalisering af neuronal substrat er involveret i den undersøgte proces. I modsætning hertil muliggør FED fMRI en hel-hjerne tilgang - med en rumlig opløsning på 250 um - og kan således anvendes til at udføre antagelse-fri eksperimenter. Endelig og vigtigst, ikke-invasiv MRI giver gentagne langsgående foranstaltninger på de samme emner, som åbner en lang række nye muligheder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane anaesthetic	Isoflo	05260-05
PC-Sam hardware/software	SA-Instruments		http://www.i4sa.com
Monitoring and gating system		1025
MR-compatible small rodent heater system			Model 1025 compatible
Rectal temperature probe		RTP-102B	7'', 0.044''
7T MR scanner	Bruker Biospin	PHS 70/16
Paravision software		5.1
Gradient Insert		BGA9S	400 mT/m, 300A, 500V
Gradient Amplifiers	Copley Co., USA	C256
Transmit resonators			Inner diameter: 72 mm, transmit only, active decoupled
Receiver antenna - 20 mm quadrature Mouse Head			Receive only, active decoupled
WaveLab software	Steinberg
Praat software	Paul Boersma, University of Amsterdam		http://www.praat.org
Non-magnetic dynamic speakers	Visation, Germany	HK 150
Fiber optic microphone	Optoacoustics,	Optimic 1160
Sound amplifier	Phonic corporation	MM 1002a
Presentation software	Neurobehavioral Systems Inc.
MRIcro	Chris Rorden		http://www.cabiatl.com/mricro/mricro/
Statistical Parametric Mapping (SPM)	Welcome Trust Centre for Neuroimaging	8	http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/