تشريح والثقافة، وتحليل<em> القيطم المورق</em> الأنسجة الجنينية الشبكية

Summary

القيطم المورق يوفر نظام نموذجا مثاليا لدراسة الخلية مواصفات مصير وظيفة فسيولوجية لخلايا شبكية العين الفردية في الثقافة الخلية الأولية. هنا نقدم تقنية لتشريح الأنسجة الشبكية وتوليد الثقافات الخلية الأولية التي يتم تصويرها للنشاط الكالسيوم وتحليلها بواسطة التهجين في الموقع.

Abstract

العملية التي من خلالها المنطقة الأمامية من لوحة تثير العصبية في الشبكية الفقارية لا يزال يشكل محورا رئيسيا من البحوث الأساسية والسريرية على حد سواء. بالإضافة إلى أهمية واضحة الطبية لفهم وعلاج مرض الشبكية، وتطوير شبكية العين الفقارية تواصل لتكون بمثابة نظام نموذجا هاما وأنيقة لفهم الخلية العصبية والتمايز تقرير نوع ^1-16. العصبية في الشبكية تتكون من ستة أنواع الخلايا المنفصلة (العقدة، مبصرات عديم الاستطالات، الأفقي، وخلايا القطبين، والخلايا الدبقية مولر) مرتبة في طبقات النمطية، وهو النمط الذي يتم حفظها بشكل كبير بين جميع الفقاريات ^12،14-18.

أثناء الدراسة في الشبكية سليمة في الجنين النامية هو مطلوب بوضوح لفهم كيفية تطور هذا الجهاز المعقد من بروز الدماغ الأمامي في هيكل الطبقات، وهناك العديد من الأسئلة التي تفيد جيئة وذهابام توظيف النهج باستخدام زراعة الخلايا الأولية من خلايا الشبكية المفترض ^7،19-23. على سبيل المثال، وتحليل الخلايا من الأنسجة وإزالة فصلها في مراحل مختلفة يسمح احد لتبين حالة تحديد الخلايا الفردية في مراحل نمو مختلفة، وهذا هو، مصير الخلايا في غياب التفاعل مع الأنسجة المجاورة ^{8،19-22 ،24-33.} زراعة الخلايا الأولية كما يسمح المحقق لعلاج الثقافة مع الكواشف محددة وتحليل النتائج على مستوى خلية واحدة ^{5،8،21،24،27-30،33-39.} القيطم المورق، ونظام النموذج التقليدي لدراسة التنمية في وقت مبكر العصبية ^{19،27،29،31-32،40-42،} بمثابة مناسبة خاصة لنظام الشبكية زراعة الخلايا الأولية ^{10،38،43-45.}

الأنسجة الشبكية الافتراضي يمكن الوصول إليها من المراحل الأولى من التنمية، مباشرة بعد تحريض العصبية ^25،38،43. وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا عشرفي كل خلية في الجنين يحتوي على توريد صفار، يمكن زرعها في خلايا شبكية العين وسائل الإعلام تعريف بسيط جدا يتكون من محلول ملحي مخزنة، وبالتالي إزالة آثار الخلط من الحضانة أو غيرها من المنتجات القائمة على الأمصال ^{10،24،44-45} .

ومع ذلك، فإن عزل الأنسجة الشبكية من الأنسجة المحيطة والمعالجة اللاحقة يمثل تحديا. هنا، نقدم طريقة لتشريح وتفكك خلايا الشبكية في المورق القيطم التي سيتم استخدامها لإعداد الثقافات الخلية الأولية التي من شأنها، في المقابل، يتم تحليلها لنشاط الكالسيوم والتعبير الجيني في الخلايا القرار واحد. في حين أن الموضوع المقدمة في هذه الورقة هو تحليل الكالسيوم العابرين عفوية، والتقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة واسعة من الأسئلة البحثية والنهج (الشكل 1).

Protocol

يتم تنفيذ جميع التجارب التالية البروتوكولات التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام في كلية وليام وماري. مراحل نمو المشار إليها في هذا البروتوكول، وفقا لفابر وNieuwkoop 46. 1. تشريح <li sty…

Representative Results

وترد أمثلة على الحويصلات البصرية تشريح بنجاح (المرحلة 25) والشبكية (المرحلة 35) في أرقام 2E و2J. في حين يمكن استخدام هذا البروتوكول في مراحل مختلفة من التنمية، فإن من الأهمية بمكان الحصول على الأنسجة الشبكية فقط لضمان الدقة لتجارب أخرى. إزالة بعناية البشرة في جمي…

Discussion

مع أنواعه الخلية جيدا أن تتميز من الحفظ في جميع الفقاريات، وشبكية العين يوفر نموذجا مفيدا لدراسة العمليات الجزيئية الخلوية التي تنظم خلية مواصفات نوع والتمايز. زراعة الخلايا الأولية تتيح وسيلة قوية للتحقيق في مجموعة واسعة من العمليات بما في ذلك التعبير الجيني، ودي?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
			For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm	Fisher	08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm	Fisher	0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent)	Fisher	12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55)	Fisher	NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm	Fisher	50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamicin Sulfate	Enzo Life Sciences	380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder	Life Technologies	27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Nile Blue Sulfate (optional)	Pfaltz & Bauer	N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane	Corning	430758
			For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent	Life Technologies	F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System	Zeiss	Model Discontinued
Blocking Reagent	Roche	11096176001
			For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3 NHS ester	GE Healthcare	PA13101
NHS-Fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamide, Deionized	Amresco	0606-950ML
Torula RNA, Type IX	Sigma-Aldrich	R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Solution Reference Contents Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid 150 mM NaCl (pH 7.5). Marc’s Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH adjusted to 7.4 with NaOH 0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH. MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock). In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide 5X SSC 1 mg/ml Torula RNA 100 mg/ml Heparin 1X Denhart’s Solution 0.1% Tween 20 0.1% CHAPS 10 mM EDTA. Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.