القيطم المورق يوفر نظام نموذجا مثاليا لدراسة الخلية مواصفات مصير وظيفة فسيولوجية لخلايا شبكية العين الفردية في الثقافة الخلية الأولية. هنا نقدم تقنية لتشريح الأنسجة الشبكية وتوليد الثقافات الخلية الأولية التي يتم تصويرها للنشاط الكالسيوم وتحليلها بواسطة التهجين في الموقع.
العملية التي من خلالها المنطقة الأمامية من لوحة تثير العصبية في الشبكية الفقارية لا يزال يشكل محورا رئيسيا من البحوث الأساسية والسريرية على حد سواء. بالإضافة إلى أهمية واضحة الطبية لفهم وعلاج مرض الشبكية، وتطوير شبكية العين الفقارية تواصل لتكون بمثابة نظام نموذجا هاما وأنيقة لفهم الخلية العصبية والتمايز تقرير نوع 1-16. العصبية في الشبكية تتكون من ستة أنواع الخلايا المنفصلة (العقدة، مبصرات عديم الاستطالات، الأفقي، وخلايا القطبين، والخلايا الدبقية مولر) مرتبة في طبقات النمطية، وهو النمط الذي يتم حفظها بشكل كبير بين جميع الفقاريات 12،14-18.
أثناء الدراسة في الشبكية سليمة في الجنين النامية هو مطلوب بوضوح لفهم كيفية تطور هذا الجهاز المعقد من بروز الدماغ الأمامي في هيكل الطبقات، وهناك العديد من الأسئلة التي تفيد جيئة وذهابام توظيف النهج باستخدام زراعة الخلايا الأولية من خلايا الشبكية المفترض 7،19-23. على سبيل المثال، وتحليل الخلايا من الأنسجة وإزالة فصلها في مراحل مختلفة يسمح احد لتبين حالة تحديد الخلايا الفردية في مراحل نمو مختلفة، وهذا هو، مصير الخلايا في غياب التفاعل مع الأنسجة المجاورة 8،19-22 ،24-33. زراعة الخلايا الأولية كما يسمح المحقق لعلاج الثقافة مع الكواشف محددة وتحليل النتائج على مستوى خلية واحدة 5،8،21،24،27-30،33-39. القيطم المورق، ونظام النموذج التقليدي لدراسة التنمية في وقت مبكر العصبية 19،27،29،31-32،40-42، بمثابة مناسبة خاصة لنظام الشبكية زراعة الخلايا الأولية 10،38،43-45.
الأنسجة الشبكية الافتراضي يمكن الوصول إليها من المراحل الأولى من التنمية، مباشرة بعد تحريض العصبية 25،38،43. وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا عشرفي كل خلية في الجنين يحتوي على توريد صفار، يمكن زرعها في خلايا شبكية العين وسائل الإعلام تعريف بسيط جدا يتكون من محلول ملحي مخزنة، وبالتالي إزالة آثار الخلط من الحضانة أو غيرها من المنتجات القائمة على الأمصال 10،24،44-45 .
ومع ذلك، فإن عزل الأنسجة الشبكية من الأنسجة المحيطة والمعالجة اللاحقة يمثل تحديا. هنا، نقدم طريقة لتشريح وتفكك خلايا الشبكية في المورق القيطم التي سيتم استخدامها لإعداد الثقافات الخلية الأولية التي من شأنها، في المقابل، يتم تحليلها لنشاط الكالسيوم والتعبير الجيني في الخلايا القرار واحد. في حين أن الموضوع المقدمة في هذه الورقة هو تحليل الكالسيوم العابرين عفوية، والتقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة واسعة من الأسئلة البحثية والنهج (الشكل 1).
مع أنواعه الخلية جيدا أن تتميز من الحفظ في جميع الفقاريات، وشبكية العين يوفر نموذجا مفيدا لدراسة العمليات الجزيئية الخلوية التي تنظم خلية مواصفات نوع والتمايز. زراعة الخلايا الأولية تتيح وسيلة قوية للتحقيق في مجموعة واسعة من العمليات بما في ذلك التعبير الجيني، ودي?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور جون هايز تكرمت للمخطوطات؛ الدكاترة. اريك برادلي وكريستوفر ديل نيجرو للحصول على المساعدة مع المجهري متحد البؤر؛ درو هيوز، لورا Odorizzi، Garafalo اليكس، Lowden ريبيكا، وليز ماكموراي على عملهم في تطوير المشروع وتوفير البيانات الأولية، والدكتور جريج سميث للحصول على اقتراحات مفيدة على التحليل الإحصائي. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة (NINDS IR15N5067566-01) إلى MSS ومعهد هوارد هيوز الطبي العلوم منحة التعليم في كلية وليام وماري.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | ||||||||||||||||||||||
For Dissections and Culturing | ||||||||||||||||||||||||
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm | Fisher | 08-772A | ||||||||||||||||||||||
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm | Fisher | 0875713A | ||||||||||||||||||||||
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) | Fisher | 12-565-91 | ||||||||||||||||||||||
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) | Fisher | NC9341917 | ||||||||||||||||||||||
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm | Fisher | 50-313-17 | ||||||||||||||||||||||
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) | MP Biomedicals, LLC | 103106 | ||||||||||||||||||||||
Gentamicin Sulfate | Enzo Life Sciences | 380-003-G025 | ||||||||||||||||||||||
Gibco Trypsin (1:250) Powder | Life Technologies | 27250-018 | ||||||||||||||||||||||
Collagenase B from Clostridium histolyticum | Roche | 11088831001 | ||||||||||||||||||||||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||||||||||||||||||||||
Nile Blue Sulfate (optional) | Pfaltz & Bauer | N05550 | ||||||||||||||||||||||
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane | Corning | 430758 | ||||||||||||||||||||||
For Calcium Imaging | ||||||||||||||||||||||||
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent | Life Technologies | F-14217 | ||||||||||||||||||||||
Pluronic F-127 10% Solution in Water | Life Technologies | P-6866 | ||||||||||||||||||||||
LSM 510 Confocal Microscope System | Zeiss | Model Discontinued | ||||||||||||||||||||||
Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | ||||||||||||||||||||||
For Fluorescent in situ hybridization (FISH) | ||||||||||||||||||||||||
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments | Roche | 11207733910 | ||||||||||||||||||||||
Anti-DNP-HRP Antibody | Perkin-Elmer | NEL747A | ||||||||||||||||||||||
Cy3 NHS ester | GE Healthcare | PA13101 | ||||||||||||||||||||||
NHS-Fluorescein | Thermo Scientific | 46409 | ||||||||||||||||||||||
Formamide, Deionized | Amresco | 0606-950ML | ||||||||||||||||||||||
Torula RNA, Type IX | Sigma-Aldrich | R3629 | ||||||||||||||||||||||
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-250KU | ||||||||||||||||||||||
CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | ||||||||||||||||||||||
Table 2. Specific reagents and equipment. |
||||||||||||||||||||||||
Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media. |