Xenopus Хепориз обеспечивает идеальную модельную систему для изучения клетки спецификации судьбы и физиологические функции отдельных клеток сетчатки в первичной культуре клеток. Здесь мы представляем технику для рассечения тканей сетчатки и формирования первичных культур клеток, что загружаются кальция деятельности и проанализированы в гибридизация.
Процесс, при котором передней части нервной пластинки приводит к сетчатке позвоночных продолжает оставаться одним из основных направлений клинических и фундаментальных исследований. В дополнение к очевидной медицинской значение для понимания и лечения заболевания сетчатки, развитие позвоночных сетчатки продолжает служить важным и элегантная модель системы для понимания нейронных определения типа и дифференцировки клеток 1-16. Нейронных сетчатка состоит из шести отдельных типов клеток (ганглии, амакринные, горизонтальные, фоторецепторы, биполярные клетки, а клетки глии Мюллера), расположенных в стереотипных слои, шаблон, который в значительной степени сохраняется среди всех позвоночных 12,14-18.
При изучении сетчатки в неповрежденной развивающегося эмбриона явно необходимы для понимания того, как это сложный орган развивается из выпячивания мозга в слоистую структуру, есть много вопросов, которые приносят сюдам применения подходов с использованием первичной культуры клеток предполагаемого клеток сетчатки 7,19-23. Например, анализ клеток из тканей удаляется и диссоциированных на различных этапах позволяет выявить состояние спецификация отдельных клеток на разных стадиях развития, то есть, судьба клеток в отсутствие взаимодействия с соседними тканями 8,19-22 ,24-33. Первичные культуры клеток также позволяет следователю относиться к культуре специфических реагентов и анализировать результаты на одном уровне клетки 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus Хепориз, классическая модель системы для изучения раннего развития нервной 19,27,29,31-32,40-42, служит особенно подходящей системой для сетчатки первичной культуре клеток 10,38,43-45.
Фиксированные ткани сетчатки доступна с самых ранних стадиях развития, сразу после нейронной индукции 25,38,43. Кроме того, учитывая йв каждой ячейке в эмбрион содержит поставку желток, клетки сетчатки можно культивировать в очень простой определены сред, состоящих из буферного солевого раствора, удаляя при этом смешанное воздействие инкубации сыворотки или других продуктов на основе 10,24,44-45 .
Тем не менее, изоляция ткани сетчатки от окружающих тканей и последующая обработка является сложной задачей. Здесь мы представляем метод для вскрытия и диссоциации клеток сетчатки в Xenopus Хепориз, который будет использоваться для подготовки первичных культур клеток, что, в свою очередь, быть проанализированы на активность кальция и экспрессии генов при разрешении отдельных клеток. В то время как темы, представленные в этой работе является анализ спонтанной переходных кальция, техника широко применима к широкому кругу вопросов исследования и подходы (рис. 1).
Благодаря хорошо изученных типов клеток, которые сохраняются во всех позвоночных животных, сетчатка представляет собой полезную модель для изучения молекулярно-клеточные процессы, определяющие ячейки спецификации типа и дифференциации. Первичные культуры клеток дает мощный метод и…
The authors have nothing to disclose.
Мы любезно благодарит д-р Джон Хейс для скриптов; доктора. Эрик Брэдли и Кристофер Дель Негро за помощью конфокальной микроскопии; Дрю Хьюз, Лаура ODORIZZI, Алекс Garafalo, Ребекка Lowden, и Лиз MacMurray за их работу по разработке проекта и предоставления предварительным данным, д-р Грег Смит за полезные предложения по статистическому анализу. Эта работа была поддержана NIH грант (NINDS IR15N5067566-01) для ПСС и Медицинского института Говарда Хьюза Наука Образование грант в колледж Уильяма и Мэри.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | ||||||||||||||||||||||
For Dissections and Culturing | ||||||||||||||||||||||||
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm | Fisher | 08-772A | ||||||||||||||||||||||
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm | Fisher | 0875713A | ||||||||||||||||||||||
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) | Fisher | 12-565-91 | ||||||||||||||||||||||
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) | Fisher | NC9341917 | ||||||||||||||||||||||
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm | Fisher | 50-313-17 | ||||||||||||||||||||||
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) | MP Biomedicals, LLC | 103106 | ||||||||||||||||||||||
Gentamicin Sulfate | Enzo Life Sciences | 380-003-G025 | ||||||||||||||||||||||
Gibco Trypsin (1:250) Powder | Life Technologies | 27250-018 | ||||||||||||||||||||||
Collagenase B from Clostridium histolyticum | Roche | 11088831001 | ||||||||||||||||||||||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||||||||||||||||||||||
Nile Blue Sulfate (optional) | Pfaltz & Bauer | N05550 | ||||||||||||||||||||||
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane | Corning | 430758 | ||||||||||||||||||||||
For Calcium Imaging | ||||||||||||||||||||||||
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent | Life Technologies | F-14217 | ||||||||||||||||||||||
Pluronic F-127 10% Solution in Water | Life Technologies | P-6866 | ||||||||||||||||||||||
LSM 510 Confocal Microscope System | Zeiss | Model Discontinued | ||||||||||||||||||||||
Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | ||||||||||||||||||||||
For Fluorescent in situ hybridization (FISH) | ||||||||||||||||||||||||
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments | Roche | 11207733910 | ||||||||||||||||||||||
Anti-DNP-HRP Antibody | Perkin-Elmer | NEL747A | ||||||||||||||||||||||
Cy3 NHS ester | GE Healthcare | PA13101 | ||||||||||||||||||||||
NHS-Fluorescein | Thermo Scientific | 46409 | ||||||||||||||||||||||
Formamide, Deionized | Amresco | 0606-950ML | ||||||||||||||||||||||
Torula RNA, Type IX | Sigma-Aldrich | R3629 | ||||||||||||||||||||||
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-250KU | ||||||||||||||||||||||
CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | ||||||||||||||||||||||
Table 2. Specific reagents and equipment. |
||||||||||||||||||||||||
Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media. |