Xenopus laevis는 세포의 운명 사양 및 기본 세포 배양의 개별 망막 세포의 생리 기능을 연구하기위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 여기 망막 조직을 해부하고 칼슘 활동 이미징 및 현장 하이브리드 화에 의해 분석 기본 셀 문화를 생성하는 기법을 제시한다.
신경 판의 앞쪽 영역이 척추 망막에 상승을 제공하는 과정은 임상과 기초 모두 연구의 주요 초점이되고 있습니다. 망막 질환을 이해하고 치료에 대한 명백한 의료 관련뿐만 아니라, 척추 망막의 개발을 이해 neuronal 세포 유형 결정과 차별화 1-16에 대한 중요하고 우아한 모델 시스템으로 제공하고 있습니다. 신경 망막은 틀에 박힌 층에 배치 여섯 개별 세포 유형 (신경절, 수평, amacrine photoreceptors, 양극성 세포와 뮐러 glial 세포), 대체로 모든 vertebrates 12,14-18 사이에 보존되어있는 패턴으로 구성됩니다.
그대로 개발 배아에서 망막을 공부하는 것은 분명이 복잡한 기관은 계층 구조로 forebrain의 돌출부에서 어떻게 전개되는지 이해가 필요합니다 동안 이리저리 혜택을 많은 질문이 있습니다m 추정 망막 세포의 주요 세포 배양 7,19-23을 사용하여 방식을 채용. 예를 들어, 서로 다른 단계에서 제거 dissociated 조직의 세포를 분석하는 것은 하나는 다른 발달 단계에서 개별 셀의 사양의 상태를 분별 할 수있다 즉, 주변 조직 8,19-22와의 상호 작용의 부재에있는 세포의 운명 ,24-33. 기본 세포 배양은 또한 탐정 특정 시약과 문화를 처리하고 단일 세포 수준 5,8,21,24,27-30,33-39에 결과를 분석 할 수 있습니다. Xenopus laevis의 연구 고전 모델 시스템은 초기 신경 발달 19,27,29,31-32,40-42은 망막 기본 세포 배양 10,38,43-45에 특히 적합한 시스템으로 제공하고 있습니다.
추정 망막 조직은 즉시 신경 유도 25,38,43 따라 개발 초기 단계에서 액세스 할 수 있습니다. 또한, 일을 부여태아의 각 셀 노른자의 공급을 포함에서 망막 세포가 버퍼 소금 솔루션으로 구성된 매우 간단한 정의 미디어에서 배양 할 수 있습니다, 따라서 부화 또는 기타 커 기반 제품 10,24,44-45의 혼란 효과를 제거 .
그러나, 주변 조직 및 후속 처리에서 망막 조직의 격리 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 결과적으로, 단일 세포의 해상도 칼슘 활동 및 유전자 표현 분석됩니다 기본 셀 문화를 준비하는 데 사용됩니다 Xenopus laevis의 망막 세포의 분해 및 분리하기위한 방법을 제시한다. 본 논문에서 제시 한 주제 자발적인 칼슘 과도의 분석이지만, 기술은 연구 질문 및 접근 방법 (그림 1)의 다양한 배열 광범위하게 적용됩니다.
모든 vertebrates에서 보존 아르는 잘 특징 세포 유형으로, 망막은 셀 타입 사양과 차별화에 관한 분자 – 세포 프로세스를 공부에 유용한 모델을 제공합니다. 기본 세포 배양은 유전자 발현, 단백질 역학, 그리고 칼슘 및 단일 셀 해상도 수준의 전기 활동을 포함한 과정의 광범위한 조사를위한 강력한 방법을 갖게. 여기에 우리가 추정 망막 개발하고 기본 세포 배양의 매우 초기 단계에서 쉽게 액세스 …
The authors have nothing to disclose.
우리는 기꺼이 스크립트에 박사 존 헤이즈 감사, Drs. 에릭 브레 디하고 공 촛점 현미경과 지원 크리스토퍼 델 흑인, 드류 휴즈, 프로젝트를 개발하고 예비 데이터를 제공에서 그의 작품을위한 로라 Odorizzi, 알렉스 Garafalo, 레베카 Lowden, 그리고 리즈 MacMurray, 통계 분석에 대한 유용한 제안 박사 그렉 스미스. 이 작품은 MSS에 대한 NIH 보조금 (NINDS IR15N5067566-01)와 윌리엄과 메리의 대학에 하워드 휴즈 의학 연구소 과학 교육 교부금에 의해 지원되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | ||||||||||||||||||||||
For Dissections and Culturing | ||||||||||||||||||||||||
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm | Fisher | 08-772A | ||||||||||||||||||||||
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm | Fisher | 0875713A | ||||||||||||||||||||||
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) | Fisher | 12-565-91 | ||||||||||||||||||||||
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) | Fisher | NC9341917 | ||||||||||||||||||||||
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm | Fisher | 50-313-17 | ||||||||||||||||||||||
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) | MP Biomedicals, LLC | 103106 | ||||||||||||||||||||||
Gentamicin Sulfate | Enzo Life Sciences | 380-003-G025 | ||||||||||||||||||||||
Gibco Trypsin (1:250) Powder | Life Technologies | 27250-018 | ||||||||||||||||||||||
Collagenase B from Clostridium histolyticum | Roche | 11088831001 | ||||||||||||||||||||||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||||||||||||||||||||||
Nile Blue Sulfate (optional) | Pfaltz & Bauer | N05550 | ||||||||||||||||||||||
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane | Corning | 430758 | ||||||||||||||||||||||
For Calcium Imaging | ||||||||||||||||||||||||
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent | Life Technologies | F-14217 | ||||||||||||||||||||||
Pluronic F-127 10% Solution in Water | Life Technologies | P-6866 | ||||||||||||||||||||||
LSM 510 Confocal Microscope System | Zeiss | Model Discontinued | ||||||||||||||||||||||
Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | ||||||||||||||||||||||
For Fluorescent in situ hybridization (FISH) | ||||||||||||||||||||||||
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments | Roche | 11207733910 | ||||||||||||||||||||||
Anti-DNP-HRP Antibody | Perkin-Elmer | NEL747A | ||||||||||||||||||||||
Cy3 NHS ester | GE Healthcare | PA13101 | ||||||||||||||||||||||
NHS-Fluorescein | Thermo Scientific | 46409 | ||||||||||||||||||||||
Formamide, Deionized | Amresco | 0606-950ML | ||||||||||||||||||||||
Torula RNA, Type IX | Sigma-Aldrich | R3629 | ||||||||||||||||||||||
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-250KU | ||||||||||||||||||||||
CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | ||||||||||||||||||||||
Table 2. Specific reagents and equipment. |
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Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media. |