Hög effektivitet, Platsspecifik transfektion av vidhäftande celler med siRNA Använda mikroelektrod Arrays (MEA)

Summary

I artikeln detaljerna protokollet för platsspecifik transfektion av oordning sekvens av siRNA i en vidhäftande däggdjurscellkultur med en mikroelektrod array (MEA).

Abstract

Upptäckten av RNAi väg i eukaryoter och den efterföljande utvecklingen av RNAi medel, såsom siRNA och shRNA, har uppnått en potent metod för att tysta specifika gener ^1-8 för funktionsgenomik och terapier. En stor utmaning som deltar i RNAi-baserade studier är leverans av RNAi medel till riktade celler. Traditionella icke-virala leverans tekniker, såsom bulk elektroporering och kemiska metoder för transfektion saknar ofta den nödvändiga rumsliga kontrollen över leverans och ge dålig transfektionseffektiviteter ^9-12. Nyligen gjorda framsteg i kemiska transfektionsmetoder såsom katjoniska lipider, katjoniska polymerer och nanopartiklar har resulterat i mycket förbättrade transfektionseffektiviteten ^13. Men dessa tekniker fortfarande inte erbjuda exakt rumslig kontroll över leveransen som oerhört kan dra miniatyriserade teknik med hög kapacitet, ensamstående studier cell och utredning av cell-cell interaktioner.

nt "> Nya ​​tekniska framsteg inom gen leverans har möjliggjort hög genomströmning transfektion av vidhäftande celler ^14-23, varav en majoritet använder mikroskala elektroporering. Microscale elektroporering ger exakt plats och tid kontroll över leverans (upp till enstaka celler) och har visats uppnå höga verkningsgrader ^{19, 24-26.} Dessutom kräver elektroporation angreppssätt inte en förlängd inkubationsperiod (typiskt 4 timmar) med siRNA och DNA-komplex som behövs kemiska baserade transfektionsmetoder och leda till direkt inmatning av naket siRNA och DNA molekyler i cellens cytoplasma. Som en följd genuttryck kan uppnås så tidigt som sex timmar efter transfektion ^27. Vårt laboratorium har tidigare visat att användningen av mikroelektrod arrayer (MEA) för platsspecifik transfektion i adherenta däggdjurscellkulturer ^17-19. I MEA synsätt, är leverans av genetisk nyttolast uppnås genom lokal mikroskala electroporatipå celler. En tillämpning av elektrisk puls till utvalda elektroder genererar lokala elektriska fält som leder till elektroporering av celler närvarande i området för de stimulerade elektroderna. Den oberoende kontroll av mikro-elektroderna ger rumsliga och tidsmässiga kontroll över transfektion och möjliggör även flera transfektion baserade experiment som skall utföras på samma kultur ökar experimentella genomströmningen och minska kulturen till kultur variabilitet.

Här beskriver vi den experimentella inställning och protokollet för riktade transfektion av vidhäftande HeLa-celler med en fluorescerande märkt kodad sekvens siRNA med elektroporering. Samma protokoll kan också användas för transfektion av plasmidvektorer. Dessutom, kan det protokoll som beskrivits här kan lätt utsträckas till ett flertal däggdjurscellinjer med mindre modifieringar. Kommersiella tillgängligheten av MEA med både fördefinierade och anpassade elektrodmönster gör denna teknik tillgänglig to de flesta forskningslaboratorier med grundläggande cellkultur utrustning.

Protocol

1. MEA Förberedelser

1. MEA för användning i elektroporation experiment kan antingen tillverkas med standard fotolitografi teknik som beskrivits tidigare ¹⁸ eller köpas direkt från leverantörer av MEA tillverkare såsom flerkanaligt system (http:/www.multichannelsystems.com/) och Alpha MED Scientific, Inc. ( http://www.MED64.com) . De MEA används i våra experiment tillverkades internt i renrum anläggningen i Arizona State University, som administreras av Centrum för Fasta tillståndets elektronik Forskning (CSSER). De MEA används i våra experiment hade 32 indium elektroder tennoxid i en 8 med 4 matris med storlekar elektrod diameter från 50 till 200 nm i en 1 cm innerdiameter glas väl. Glaset var väl bundet på MEA använder polydimetylsiloxan (PDMS).
2. Sterilisera MEA i en autoklav före cellenseeding. Andra metoder för sterilisering, såsom en blötläggning i 70% etanol, kan UV-behandling och behandling med varmt vatten, såsom beskrivits på andra ställen också användas så länge de inte äventyrar integriteten av MEA.
3. Överför autoklaverade MEA till ett laminärt flöde huva och placera den i en vanlig steril polystyren petriskål. Innan sådd celler på MEA, sterilisera huven laminära flödet genom att vrida på den UV-ljus under 20 minuter. Om MEA är känslig för UV-ljus täcka petriskål innehållande MEA med steril aluminiumfolie medan flödet huven är under UV-belysning.

2. Seeda Celler på MEA

1. Harvest celler från en löpande cellinje av vidhäftande däggdjursceller med användning av trypsin / EDTA och höja dem till en koncentration av 100-200 celler / | il under 1 medium ml cell för plätering. I våra experiment har vi varit framgångsrika i odling NIH 3T3 fibroblaster cellinje, HeLa-cellinjen och primära kortikala och hippocampala neuroner på MEA.
2. 2 h efter ympning av cellerna överför Petri-skål med MEA från inkubatorn till huv med laminärt flöde och försiktigt lägga 400-500 il pre värmde medium (37 ° C) till MEA väl. Kontrollera i mikroskop för att säkerställa att cellerna fortfarande är anslutna och jämnt på MEA ytan. Överför MEA tillbaka till inkubatorn. 2 tim vänteperiod före tillsats av media ger tillräckligt med tid för cellerna att vidhäfta med MEA ytan. Tillsats av cellmediet alltför snart efter ympning av cellerna kan tvätta bort cellerna. Om celler inte vidhäftar väl på MEA, kan dess yta behandlas med faktorer cellvidhäftning sådan aspolylysine, fibronektin, laminin och för att förbättra cellvidhäftning. I våra HeLa cell experiment vi behandlar typiskt MEA yta med fibronectin (10 pg / ml) under 1-2 timmar.
3. 8-12 timmar efter sådd av cellerna, utföra 1-2 tvättar med PBS för att avlägsna eventuella döda celler. Cellmedium kan ersättas varje 24-48 timmar efter behov. I ett typiskt experiment är cellerna vanligtvis redo för transfektion 24-48 timmar efter sådd. För att upprätthålla konsekvens i elektroporation effektivitet rekommenderas det att vänta tills kulturen är minst 80% sammanflytande före elektroporering.

3. Platsspecifik transfektion av siRNA

1. Bered nukleinsyra lösning. För siRNA transfektion, förbereda en 1-2 iM lösning siRNA elektroporering i iskall elektroporering buffert för att uppnå en slutlig volym av 200-400 | il. I denna video artikeln visar vi att transfektion av HeLa-celler med Alexa 488 konjugerad oordning sekvens av siRNA.
2. Överför MEA med celler från inkubatorn till sterila laminärt flöde huva. Ta bort cell materialet från MEA och utföra en tvätt med PBS. Därefter lägger 200-400 ul av ice kall 1 iM siRNA elektroporering lösning till brunnen.
3. Applicera anodiska kvadratiska elektriska pulser till de berörda elektroderna (Se steg 4 för att bestämma optimala parametrar för elektriska pulsen). I våra experiment använde vi en pragmatisk instrument 2414A vågform generator för att generera elektriska pulser och en dubbel-inline-paket (DIP) 16 polig klämma att ta kontakt med MEA förbindningskuddarna. Den vågformsgenerator kan anslutas till DIP klämman via en tryckt demultiplexerande kretskort för att åstadkomma selektivitet av individuella elektroder. För referenselektroden, placera en stål katod i cellmediet. Samtidigt sänka elektroden stål referens i media är det ytterst viktigt att se till att den inte kommer i kontakt med MEA ytan. Vid kontakt, kan det orsaka skada på cellerna och MEA. Det rekommenderas att sänka referenselektroden till en position av 1 mm ovanför cellerna. Ett distansorgan med en höjd av 1 mm kan placeras i brunnen för att underlätta placering av refrens elektrod. Ett alternativt tillvägagångssätt att använda en extern referens elektrod är att använda angränsande elektroder som katod-anod-paren.
4. Omedelbart efter tillämpning av de elektriska pulserna till de riktade elektroderna på MEA, överföra MEA tillbaka till inkubatorn. Efter en inkubationstid av 5 minuter, försiktigt ersätta 75% av elektroporation bufferten med förvärmda (37 ° C) cellmedia. Senare kan fluorescerande avbildning göras för att bekräfta leverans av fluorescent taggade siRNA till cellerna.

4. Elektroporation Parameter Optimering

1. Att bestämma den optimala elektriska pulsparametrar för elektroporering, experiment konstruktion elektroporation för ett antal värden på pulsamplitud, pulsvaraktighet, och antalet pulser. I vår erfarenhet med HeLa-celler, observerade vi att ett enda spänningspuls av amplitud från 3 V till 9 V och varaktighet från 1 msek till 10 msek för en elektrod storlek av 100 um ledde till framgångsrik elektroporation med minimal celldöd. Det är vår rekommendation att en parameter varieras vid en tidpunkt och andra hålls konstanta. För att kvantifiera elektroporering verkningsgraden för varje pulsparametrarna, använder vi propidiumjodid (PI), en cell ogenomträngligt färgämne som färgar nukleinsyra material och levande analys metod, som beskrivs i steg 4,2-4,5.
2. Upprätta en cellkultur på MEA följa anvisningarna som beskrivs i steg 1 och 2.
3. Före elektroporation framställa en 300-500 pl 30 pg / ml PI lösning i iskall elektroporation buffert och 400 | il av 4 M calcien AM lösning i PBS.
4. Överför MEA från inkubatorn till laminärt flöde. Ta bort cell materialet från MEA och utföra en tvätt med PBS. Därefter lägger 300-500 ìl av iskall elektroporering buffert med PI.
5. Applicera elektriska pulser med önskad pulsamplitud och varaktighet till de riktade elektroderna (Den utrustning som används i våra experiment för att generera och tillämpa eltriska puls till MEA beskrivs i steg 3,3). För referenselektroden antingen sänka en stål elektrod i elektroporering bufferten i MEA väl eller använd angränsande elektroden som referens. Genom att selektivt tillämpa pulser av varierande amplituder eller varaktighet till olika elektroder flera experiment kan utföras på samma enhet. Till exempel, på en 32 elektrod MEA, kan 8 experiment utföras genom att dela de 32 elektroderna i 8 grupper, var och en bestående av 4 elektroder. Varje 8 grupperna kan sedan stimuleras av en enda rektangulär spänningspuls av varaktighet 5 ms med amplituder som varierar i 3 V-6 V-området i 0,5 V steg och en grupp kan användas som en kontroll.
6. Omedelbart efter applicering spänningspulserna överför MEA till inkubatorn under 5 minuter. Efteråt försiktigt bort 75% av elektroporation bufferten från MEA bra och ersätta det med varma cellmediet. Överför MEA tillbaka till inkubatorn.
7. Efter en inkubationstid på 2-4 timmarersätta cellmediet i MEA väl med 300-500 pl 4 M AM Calcein lösning i PBS. Överför MEA tillbaka till inkubatorn för ytterligare 30 minuter.
8. Efter inkubering av cellerna med kalcein AM, byt kalcein AM lösningen i MEA väl med PBS efter två tvättningar med PBS. Skaffa fluorescerande bilder av celler med användning med ett optiskt mikroskop med filter för PI (Excitation / Emission - 535 nm/617 nm) och kalcein AM (Excitation / Emission - 490 nm/520 nm). Upptaget av PI, på grund av elektroporation, orsakar celler att fluorescera rött och Calcein AM orsakar celler som är levande för fluorescera grönt. Tre möjliga scenarier som kan observeras är 1) cell elektroporerade och levande (kommer fluorescera både rött och grönt), 2) Celler levande, men inte elektro (kommer fluorescerar bara grönt) och 3) Celler döda på grund av elektroporation (kommer fluorescera bara röd) . Cellviabiliteten beräknades som en procent av det totala antalet celler vid liv på elektroden och elektroporering efficiency beräknades som procent av det totala antalet celler laddade med PI / siRNA.

5. Representativa resultat

Figur 1 visar den platsspecifika lastning av HeLa-celler med PI. Det kan observeras att endast celler på elektroden visar en upptagning av PI (figur 1B). En levande utförd efter elektroporering användes för att bedöma lönsamheten av celler (Figur 1A). Den elektroporation effektivitet och cellviabilitet till exemplet som visas i figur 1 är 81,8% och 96,1% respektive. Hög cellviabilitet och elektroporering effektivitet kan uppnås genom att optimera parametrarna elektroporering puls. Platsspecifik transfektion av HeLa-celler med fluorescent märkt siRNA för en optimerad elektroporering puls (8 V, 1 ms) visas i figur 2. Den elektroporation effektivitet för siRNA vid 8 V, 1 ms befanns vara 74,4 ± 16,0% ochcellviabiliteten befanns vara 87,9 ± 8,4% (alla data som representeras som medelvärde ± standardavvikelse, n = 5).

Figur 1. Platsspecifik avgivning av PI i HeLa-celler på en 200 fim elektrod (6 V, 5 msek). A) Calcien baserade levande utförd 2 elektroporation h efter. Levande celler indikeras med grön fluorescens. B) Röd fluorescens visar upptaget av PI genom celler på elektroden. C) En överlagrade bilden av A och B. De vita pilarna visar celler som är elektroporerades och levande. De svarta pilarna visar celler som är döda. Den vita cirkeln i A, B och C visar konturen av elektroden.

Figur 2. Transfektion av HeLa-celler med fluorescens märkta scramble sekvens av siRNA. A) Bild av HeLa-celler på en 100 nm elektrod transfekterad med Alexa märkt 488 siRNA (8 V, 1 ms). B) Bild av cellkärnor färgas med DAPI. Den vita cirkeln markerar kanten av elektroden.

Discussion

I denna video artikeln visar vi att använda MEA för platsspecifik transfektion av HeLa-celler med oordning sekvens av siRNA. En av fördelarna med denna teknik är dess tillämpbarhet på olika cellinjer inklusive primära cellinjer. Vårt laboratorium har tidigare visat användningen av denna teknik för platsspecifik transfektion av primär hippocampus neuronal kultur från E18 dagar gammal råtta och NIH-3T3-celler med kodade siRNA sekvenser och GFP plasmid ^{18, 19.} Vi har också haft framgång i att leverera funktionella siRNA mot en endogen mål i HeLa-celler (opublicerade data). En typisk kommersiellt tillgänglig MEA är kompatibel med optisk avbildning (upprätt mikroskop), vilket möjliggör kvantitativ bedömning av funktionell effekt geners uttryck med hjälp fluorescerande immunfärgning tekniker. Dessutom kan mikroelektroderna i MEA kan användas för att övervaka elektrisk aktivitet hos celler, såsom primära neuroner som svar på genetisk störning. Denunika karaktär MEA möjliggör flera samtidiga experiment på en enda cellodling, därigenom ökar experimentella genomströmning. För närvarande en stor begränsning med MEA baserade system är den stora mängden av siRNA som behövs för transfektion (400 pl 1 pM siRNA), vilket är högt jämfört med konventionella baserade kemiska transfektion metoder och därmed begränsar kostnadseffektiviteten hos systemet. Detta kan delvis övervinnas genom införlivande mircofluidics med MEA baserade system för att minska den totala volymen av siRNA elektroporering lösning till mindre än några få mikroliter. Dessutom kan mikrofluidik möjliggör seriell leverans av olika siRNA-molekyler, därigenom avsevärt öka genomströmningen av MEA baserad teknik. Alternativt kan siRNA-molekyler kan upptäckas på mikroelektrodema före cellsådd och sedan siRNA-molekyler kan transfekteras in i celler genom omvänd elektroporering ^{15, 23.} Ytterligare utveckling av denna teknik ger en ny hög-throughput, effektiv och billig metod för studier genmodifieringstekniker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Electroporation buffer	Biorad Laboratories	165-2677
Waveform generator	Pragmatic	2414A	Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.