Høy effektivitet, stedsspesifikk Transfeksjon av tilhenger Celler med siRNA Bruke microelectrode Arrays (MEA)

Summary

Artikkelen detaljer protokollen for stedsspesifikk transfeksjon av kryptert sekvens av siRNA i en tilhenger pattedyrcelle kultur ved hjelp av en microelectrode array (MEA).

Abstract

Oppdagelsen av RNAi vei i eukaryoter og den påfølgende utvikling av RNAi agenter, for eksempel siRNA og shRNA, har oppnådd en potent metode for stanse spesifikke gener ^1-8 for funksjonell genomforskning og terapi. En stor utfordring i RNAi baserte studier er levering av RNAi midler til målrettede celler. Tradisjonelle ikke-virale levering teknikker som bulk elektroporering og kjemiske transfeksjon metodene ofte mangler den nødvendige romlige kontroll over produksjonstid og råd fattige transfeksjon effektivitet ^9-12. Nylige fremskritt i kjemiske transfeksjon metoder som kationiske lipider, kationiske polymerer og nanopartikler har resultert i svært forbedret transfeksjon effektivitet ^13. Men disse teknikkene fortsatt ikke klarer å tilby nøyaktig romlig kontroll over levering som kan umåtelig nytte miniatyrisert høy gjennomstrømming teknologier, encellede studier og undersøkelser av celle-celle interaksjoner.

nt "> Nyere teknologiske fremskritt innen genet levering har aktivert high-throughput transfeksjon av tilhenger celler ^14-23, et flertall av dem bruker mikroskala electroporation. mikroskala electroporation gir presis spatio-temporal kontroll over levering (opp til enkeltceller), og har vist for å oppnå høy effektivitet ^{19, 24-26.} I tillegg gjør electroporation tilnærminger ikke krever en lengre inkubasjonstid (vanligvis 4 timer) med siRNA og DNA komplekser som nødvendig i kjemiske basert transfeksjon metoder og føre til direkte inntasting av naken siRNA og DNA molekyler i cellen cytoplasma. Som en konsekvens genuttrykk kan oppnås så tidlig som seks timer etter transfeksjon ^27. Vår lab har tidligere demonstrert bruk av mikroelektroden arrays (MEA) for stedsspesifikk transfeksjon i adherente pattedyr cellekulturer ^17-19. I MEA tilnærming, er levering av genetisk nyttelast oppnås via lokalisert mikro-skala electroporatipå av celler. En anvendelse av elektrisk puls til utvalgte elektroder genererer lokal elektrisk felt som fører til elektroporering av celler tilstede i regionen av de stimulerte elektroder. Den uavhengige styring av mikro-elektrodene gir romlige og tidsmessige kontroll over transfeksjon og også gjør at flere transfeksjon baserte forsøk som skal utføres på den samme kulturen øke eksperimentelle gjennomstrømming og redusere kultur til kultur variabilitet.

Her beskriver vi den eksperimentelle oppsett og protokollen for målrettet transfeksjon av adherente HeLa celler med en fluorescently merket kryptert sekvens siRNA med electroporation. Samme protokoll kan også brukes for transfeksjon av plasmidvektorer. Tillegg kan protokollen beskrevet her enkelt kan utvides til en rekke pattedyr cellelinjer med mindre modifikasjoner. Kommersielt tilgjengelig MEAs med både forhåndsdefinerte og egendefinerte elektrodemønstrene gjøre denne teknikken tilgjengelig to fleste forskningslaboratorier med grunnleggende cellekultur utstyr.

Protocol

1. MEA Forberedelse

1. MEAs for bruk i electroporation eksperimenter kan enten være fabrikkert ved hjelp av standard fotolitografi teknikk som beskrevet tidligere ¹⁸ eller kjøpes direkte fra leverandørene av MEA produsenter som flerkanals Systems (http:/www.multichannelsystems.com/) og Alpha MED Scientific, Inc. ( http://www.MED64.com) . Den MEAs brukes i våre eksperimenter ble fabrikkert i huset på det rene rommet anlegget i Arizona State University, som administreres av Senter for Solid State Electronics Research (CSSER). De MEAs brukes i våre eksperimenter hadde 32 indium tinn oksid elektroder i en 8 med 4 array med elektrode diameterstørrelser 50-200 mikrometer innen en 1 cm indre diameter glass godt. Glasset Brønnen ble limt på MEA BRUKE polydimetylsiloksan (PDMS).
2. Steriliser MEA i en autoklav før celle seeding. Andre metoder for sterilisering som en soaking i 70% etanol, kan UV behandling og varmtvann behandling som beskrevet andre steder også brukes så lenge de ikke kompromittere integriteten til MEA.
3. Overfør autoklaverte MEA til en laminær hette og legg den i en standard steril polystyren petriskål. Før seeding cellene i MEA, sterilisere laminær hette ved å slå på UV-lys i 20 min. Hvis MEA er følsomme for UV lys dekke petriskålen inneholdende MEA med sterilt aluminiumsfolie mens strømningshette er under UV lys.

2. Seeding Celler på MEA

1. Høste celler fra en løpende cellelinje av adherente pattedyrceller hjelp Trypsin / EDTA og heve dem til en konsentrasjon på 100 til 200 celler / pl i 1 ml celle medier for plating. I våre eksperimenter har vi lykkes i dyrking NIH 3T3 fibroblaster cellelinje HeLa cellelinje og primære kortikale og hippocampus nevroner på MEA.
2. 2 timer etter såing cellene overfører petriskålen med MEA fra inkubatoren til laminær hette og tilsett 400-500 ul pre varmet media (37 ° C) til MEA godt. Sjekk under mikroskop for å sikre at cellene er fortsatt festet og jevnt spredt på MEA overflaten. Overfør MEA tilbake til inkubatoren. 2 timers venteperioden før tilsetning av media sikrer nok tid for at cellene skal overholde med MEA overflaten. Tilsetning av celle medier for tidlig etter såing cellene kan vaske bort cellene. Hvis celler ikke holder godt på MEA, kan dens overflate behandles med cellefesting faktorer aspolylysine, fibronektin, og laminin å forbedre celle adhesjon. I våre HeLa celle eksperimenter typisk vi behandle MEA overflaten med fibronectin (10 ug / ml) i 1-2 timer.
3. 8-12 timer etter såing cellene, utføre 1-2 vaskinger med PBS for å fjerne noen døde celler. Cell mediet kan erstattet hver 24-48 hr etter behov. I et typisk forsøk, cellene er vanligvis klar for transfeksjon 24-48 hr etter såing. For å opprettholde konsistens i electroporation effektivitet er det anbefalt å vente til kulturen er minst 80% confluent før electroporation.

3. Stedsspesifikk Transfeksjon av siRNA

1. Forbered nukleinsyre løsning. For siRNA transfeksjon, forberede en 1-2 uM siRNA elektroporering løsning i iskald elektroporering buffer å oppnå et endelig volum på 200-400 pl. I denne videoen artikkelen viser vi transfeksjon av HeLa celler med Alexa 488 konjugert kryptert sekvens av siRNA.
2. Overfør MEA med celler fra inkubatoren til sterilt laminær strømning hette. Fjern cellen media fra MEA og utføre en vask med PBS. Deretter legger 200-400 pl av ice kaldt 1 uM siRNA elektroporering løsning til brønnen.
3. Påfør anodiske firkantede elektriske pulser til målrettede elektroder (Se trinn 4 for å bestemme optimale parametere for elektrisk puls). I våre forsøk har vi brukt en pragmatisk Instruments 2414A bølgeform generator for å generere elektriske pulser og en dual-inline-pakke (DIP) 16 pin klipp for å få kontakt med MEA obligasjon pads. Bølgeform generatoren kan kobles til DIP klippet via en demultiplexor kretskort å tilveiebringe selektivitet av individuelle elektroder. For referanse-elektroden, plassere en stål katode i cellen media. Mens senke stål referanseelektrode media det er svært viktig for å sikre at den ikke kommer i kontakt med MEA overflaten. Ved kontakt, kan det oppstå skader på cellene og MEA. Det anbefales å senke referanseelektrode til en posisjon av 1 mm over cellene. Et avstandsstykke med en høyde på 1 mm kan plasseres i brønnen for å hjelpe til i plassering av refhenvisning elektroden. En alternativ tilnærming til å bruke en ekstern referanse elektrode er å bruke nabokommunene elektroder som katode-anode parene.
4. Umiddelbart etter påføring av de elektriske pulser til de målrettede elektroder på MEA, overføre MEA tilbake til inkubatoren. Etter en inkubasjonstid på 5 min, forsiktig erstatte 75% av elektroporering buffer med forvarmede (37 ° C)-celle medier. Senere, kan fluorescerende avbildning gjøres for å bekrefte leveringen av fluorescensmerket tagget siRNA til cellene.

4. Electroporation Parameter Optimalisering

1. Å fastslå den optimale elektrisk puls parametre for electroporation, design electroporation eksperimenter for en rekke verdier av puls amplitude, pulsbredde og antall pulser. I vår erfaring med HeLa celler, observerte vi at en enkelt spenningspuls av amplitude fra 3 V til 9 V og varighet fra 1 ms til 10 ms for en elektrode størrelse på 100 mikrometer førte til vellykket electroporation med minimal celledød. Det er vår anbefaling at en parameter varieres på en tid og andre er holdt konstant. Å kvantifisere elektroporering effektiviteten for hver av puls parametere, bruker vi propidium jodid (PI), en celle impermeant fargestoff som flekker nuklein materiale og levende analysen basert metode, som beskrevet i trinn 4.2 til 4.5.
2. Etablere en cellekultur på MEA følge instruksjonene skissert i trinn 1 og 2.
3. Før elektroporering forberede en 300-500 pl 30 pg / ml PI-løsning i iskaldt elektroporering buffer og 400 ul av 4 uM calcien AM løsning i PBS.
4. Overfør MEA fra inkubatoren til laminær strømning hette. Fjern cellen media fra MEA og utføre en vask med PBS. Deretter legger 300-500 pl av den iskalde elektroporering buffer med PI.
5. Påfør elektriske pulser med ønsket puls amplitude og varighet til målrettede elektroder (Utstyret som brukes i våre forsøk for å utvikle og anvende det elektrisketrisk puls til MEA er beskrevet i trinn 3.3). For referanse-elektroden enten senke en stål elektroden i elektroporering buffer i MEA godt eller bruk nabostaten elektroden som referanse. Ved selektivt å bruke pulser av varierende amplituder eller varighet til ulike elektroder flere eksperimenter kan utføres på den samme enheten. For eksempel, på en 32 elektrode MEA kan 8 eksperimenter utføres ved å splitte 32 elektrodene i 8 grupper, hver bestående av 4 elektroder. Hver av de 8 gruppene kan deretter bli stimulert av en enkelt rektangulær spenningspuls av varighet 5 msek med amplituder varierende i 3 V-6 V område i 0,5 V intervaller og en gruppe kan brukes som en kontroll.
6. Umiddelbart etter påføring av de spenningsimpulser overføre MEA til inkubator i 5 min. Etterpå, forsiktig fjerne 75% av electroporation buffer fra MEA godt og erstatte den med varme celle media. Overfør MEA tilbake til inkubatoren.
7. Etter en inkubasjonstid på 2-4 hrerstatte celle media i MEA godt med 300-500 pl av 4 pM Calcein AM løsning i PBS. Overfør MEA tilbake til inkubator for annen 30 min.
8. Etter inkubering av cellene med Calcein AM, erstatte Calcein AM løsningen i MEA godt med PBS etter to vaskinger med PBS. Skaffe fluorescerende bilder av celler ved hjelp med et optisk mikroskop med filtre for PI (Excitation / Emission - 535 nm/617 nm) og Calcein AM (Excitation / Emission - 490 nm/520 nm). Opptaket av PI, grunnet elektroporering, forårsaker at cellene fluoresce røde og Calcein AM forårsaker celler som er i live til fluoresce grønt. Tre mulige scenarier som kan observeres er 1) celle electroporated og levende (vil fluoresce både rød og grønn), 2) cellene i live, men ikke electroporated (vil fluoresce bare grønn) og 3) Celler døde på grunn av electroporation (vil fluoresce bare rød) . Cellen levedyktighet ble beregnet som en prosent av det totale antall celler i live på elektroden og elektroporering efficiency ble beregnet som prosent av det totale antall celler lastet med PI / siRNA.

5. Representant Resultater

Figur 1 viser stedsspesifikk lasting av HeLa-celler med PI. Det kan observeres at bare celler på elektroden demonstrere en opptak av PI (figur 1B). En levende analysen utført innlegg electroporation ble brukt til å vurdere levedyktigheten av celler (figur 1A). Den elektroporering effektivitet og cellelevedyktighet for eksempelet vist i figur 1 er 81,8% og 96,1% henholdsvis. Høy celleviabilitet og elektroporering effektivitet kan oppnås ved å optimalisere electroporation puls parametere. Stedsspesifikk transfeksjon av HeLa-celler med fluorescensmerket tagged siRNA for en optimalisert elektroporering puls (8 V, 1 msek) er vist i figur 2. Den elektroporering effektivitet for siRNA ved 8 V, 1 ms ble funnet å være 74,4 ± 16,0% ogcelleviabilitet ble funnet å være 87,9 ± 8,4% (alle data representert som gjennomsnitt ± standardavvik, n = 5).

Figur 1. Stedsspesifikk levering av PI i HeLa celler på en 200 mikrometer elektrode (6 V, 5 ms). A) Calcien basert levende analysen utført 2 timers innlegget electroporation. Levende celler er merket med grønt fluorescens. B) Red fluorescens demonstrerer opptaket av PI av celler på elektroden. C) En innfelt bilde av A og B. De hvite pilene indikerer celler som er electroporated og levende. De svarte pilene viser celler som er døde. Den hvite sirkelen i A, B og C indikerer omrisset av elektroden.

Figur 2. Transfeksjon av HeLa celler med fluorescently merket scramble sekvens av siRNA. A) Bilde av HeLa celler på 100 mikrometer elektrode transfektert med Alexa 488 tagget siRNA (8 V, 1 ms). B) Bilde av cellekjerner farget med DAPI. Den hvite sirkelen markerer kanten av elektroden.

Discussion

I denne videoen artikkelen viser vi bruken av MEA for stedsspesifikk transfeksjon av HeLa celler med kryptert sekvens av siRNA. En av fordelene med denne teknologien er dens anvendbarhet til forskjellige cellelinjer inkludert primære cellelinjer. Vår lab har tidligere demonstrert bruk av denne teknologien for stedsspesifikk transfeksjon av primær hippocampus neuronal kultur fra E18 dag gamle rotte og NIH-3T3 celler med eggerøre siRNA sekvenser og GFP plasmid ^{18, 19.} Vi har også hatt suksess i å levere funksjonelle siRNA mot en endogen mål i HeLa celler (upubliserte data). En typisk kommersielt tilgjengelig MEA er kompatibel med optisk imaging (stående mikroskop), slik at kvantitativ vurdering av funksjonell virkningen av genet Silencing, ved hjelp av fluorescerende farging teknikker. Tillegg kan mikroelektroder i MEA brukes til å overvåke elektriske aktivitet i celler, slik som primær nevroner, som svar til genetisk perturbasjon. Denunike natur av MEA muliggjør samtidig flere eksperimenter på en enkelt celle kultur, og dermed øke den eksperimentelle gjennomstrømming. Dag en stor begrensning med MEA basert system er den store mengden av siRNA trengs for transfeksjon (400 pl av 1μM siRNA), som er høyt i forhold til konvensjonelle kjemiske transfeksjon tilnærminger og dermed begrenser kostnadseffektiviteten av systemet. Dette kan delvis overvinnes ved å innlemme mircofluidics med MEA basert system for å redusere det totale volum av siRNA elektroporering løsning til mindre enn noen få mikroliter. Tillegg kan MicroFluidics aktiverer seriell levering av ulike siRNA molekyler, dermed dermed øker gjennomstrømningen av MEA basert teknologi. Alternativt kan siRNA molekyler bli oppdaget på mikroelektroder før celle såing og deretter siRNA molekyler kan transfekteres i celler ved revers elektroporering ^{15, 23.} Videreutvikling av denne teknologien tilbyr en roman high-throughput, effektiv og rimelig metode for genmanipulering studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Electroporation buffer	Biorad Laboratories	165-2677
Waveform generator	Pragmatic	2414A	Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.